双取代苯并二氢吡喃酮合成方法及治疗COPD等肺部炎症中应用

技术领域：

本发明属于生物医药领域，具体涉及4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮及其合成方法和在制备治疗COPD等肺部炎症药物中的应用。

背景技术：

肺炎指的是远端肺部，也就是肺间质、肺泡腔以及终末气道出现的炎症。引起炎症的因素主要是细菌、寄生虫、真菌以及病毒等致病微生物，抑或化学过敏、放射线等。肺炎的临床症状主要是咳嗽、发热、痰中有血或者咳痰，经常伴随着呼吸困难或者胸闷等。按照病因学可以把肺炎划分成病毒性肺炎、真菌性肺炎、细菌性肺炎、支原体肺炎、理化性肺炎、变态反应性肺炎、其他病原体肺炎、免疫性肺炎等，最为常见的肺炎是细菌性肺炎，在成人肺炎中占据70％以上。当病原体入侵肺部组织时，机体的丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、核转录因子-κB等信号传导通路被激活，引发炎症反应以进行免疫。炎症反应中，肺泡巨噬细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等免疫细胞被信号转导通路激活，并释放肿瘤坏死因子、白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子等炎性介质，如TNF-α，IL-6，IFN-γ，IL-1β，IL-12，IL-18等对炎症反应以及信号转导通路进行反馈调节。肺部炎症是多种急慢性呼吸系统疾病如COPD、哮喘、ARDS等的重要组成部分，会致使患者出现粘液分泌过多、气道堵塞、肺气肿、肺水肿等病症，以及一些其他器官组织的并发疾病乃至全身性疾病，严重时殃及生命。

黄酮类化合物因其特有结构特点，被广泛的用于肺部炎症的治疗当中。与肺部组织炎症反应发生发展的病理过程特点相对应，黄酮类化合物对抗肺炎的机制主要有以下几个途径：对MAPK、NF-κB等信号传导通路进行调节，影响炎性细胞在肺内的积聚，抑制细胞因子的释放，减少促炎介质的产生，以抑制炎症反应的发生发展。

发明内容：

本发明的目的在于提供4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮及其合成方法和在制备治疗COPD等肺部炎症药物中的应用。

本发明的4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮，其化学结构如下式(a)所示，

式(a)中，R

本发明所述的4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮优选下述化合物之一：

当R

当R

当R

当R

当R

当R

当R

当R

当R

当R

当R

当R

当R

当R

本发明的第二个目的是提供4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮的合成方法，该合成方法(如反应式i所示)包括以下步骤：

将柚皮素与叔丁基二甲基氯硅烷在咪唑、4-二甲氨基吡啶的催化下得到化合物a和化合物b，在三苯基膦与偶氮二甲酸二异丙酯的催化下，化合物a与R

上述方法的反应式如下所示：

经过实验发现，上述4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮可以抑制细胞因子的释放，减少促炎介质的产生，以抑制炎症反应的发生发展。

因此，本发明的第三个目的是提供上述4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮在制备抗炎药物中的应用。

本发明的第四个目的是提供一种抗炎药物，其包括上述4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮作为活性成分。

优选，所述的抗炎药物是抗肺部炎症药物。

进一步优选，所述的抗炎药物是治疗慢性阻塞性肺疾病COPD的药物。

优选，所述的抗炎药物包括4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮和医学上可接受的辅料。

本发明合成了4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮，实验发现，其可以有效抑制肺部炎症反应。因此可以将其用于抑制肺部炎症反应，具有广阔的用途。

附图说明：

图1是化合物b的结构经过核磁单晶衍射得到验证；

图2是化合物的抗炎活性结果。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1本发明关键中间体的合成以及目标产物的合成步骤：

称取柚皮素YPS(10g,36.76mmol)，转移至装有搅拌子的500ml圆底烧瓶中，再加入30ml二氯甲烷，室温搅拌10min。依次加入咪唑(5g,73.52mmol)与4-二甲氨基吡啶(0.9g,7.4mmol)，室温搅拌30min至溶液澄清。分批缓慢加入叔丁基二甲基氯硅烷(5.6g,37.33mmol)，室温搅拌过夜，TLC监控反应进程。翌日，待反应转化率约达80％以上时，加入30ml饱和碳酸氢钠溶液淬灭反应，用30ml二氯甲烷萃取三次，合并有机相，用饱和食盐水溶液洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，旋干溶剂，过柱，得到黄色油状固体(中间体a)，产率：55.8％。IR(neat,cm

中间体b(结构经过核磁单晶衍射验证，图1)，米白色晶状固体，产率：33.4％。IR(neat,cm

中间体c的合成：

将化合物a溶于四氢呋喃中，室温搅拌10min后，依次加入三苯基膦、R

R

R

中间体d的合成：

将化合物c溶于二氯甲烷中，冰浴中搅拌10min后，滴入四丁基氟化铵，冰浴中反应0.5h，TLC检测反应结束后，进行柱色谱分离，即得化合物d。

R

R

化合物e的合成：

将化合物d溶于四氢呋喃中，室温搅拌10min后，依次加入三苯基膦、R

实施例2 7-环戊甲氧基-5-羟基-2-(4-异丁氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e1)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备，其中，中间体c的合成中，R

实施例3 7-正丁氧基-5-羟基-2-(4-异丁氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e2)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例4 7-环丙甲氧基-5-羟基-2-(4-异丁氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e3)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例5 7-对甲氧基苄氧基-5-羟基-2-(4-异丁氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e4)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例6 7-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基-5-羟基-2-(4-异丁氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e5)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例7 7-异丁氧基-5-羟基-2-(4-异丁氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e6)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例8 7-环己甲氧基-5-羟基-2-(4-异丁氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e7)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例9 7-正丁氧基-5-羟基-2-(4-环戊甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e8)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例10 7-异丁氧基-5-羟基-2-(4-环戊甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e9)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例11 7-环己甲氧基-5-羟基-2-(4-环戊甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e10)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例12 7-环戊甲氧基-5-羟基-2-(4-环戊甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e11)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例13 7-环丙甲氧基-5-羟基-2-(4-环戊甲氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e12)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例1的方法制备。其中，中间体c的合成中，R

实施例14 7-吗啉乙氧基-5-羟基-2-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e13)的合成：

将化合物b溶于四氢呋喃中，室温搅拌10min后，依次加入三苯基膦、R

当R

实施例15 7-(N-甲基(苯基)氨基)乙氧基-5-羟基-2-(4-(叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基苯基)苯并二氢吡喃-4-酮(e14)的合成：

除了使用相应的原料外，按照实施例14的方法制备。其中，R

实施例16 4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮在抗炎活性方面的研究

对本发明的衍生物进行了肺炎细胞因子表达水平的抑制试验，试验方法采用常规的QPCR法。

一、细胞的培养

人源肺上皮细胞BEAS-2B采用加入10％(V/V)FBS、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基(完全培养基)进行培养。培养条件为37℃、5％CO

二、细胞给药与诱导细胞炎症

采用处于对数生长期的细胞进行实验，细胞以1*10

三、RNA的提取及qPCR的测定

1.将培养好的细胞完全弃去培养基后，每孔加入0.5mL RNA提取试剂盒中的RA2进行裂解(可在-80℃冻存一晚上，裂解效果更佳，也可在4℃裂解10min后收集)；

2.收集细胞裂解物按试剂盒说明书提取Total RNA，并用超微量紫外可见分光光度计测其浓度；

3.RT-PCR(每个体系20uL)，包括5x BUFFER 4μL，Total RNAXμL(1pg-1ug，大多数时候取200-400ng)，DEPC-H

4.转录后的cDNA加80μL DEPC-H

5.按(SYBR 10μL+DEPC-H

6.将样品板放入CFX Connect Real-Time System(实时荧光定量PCR仪)中进行检测，按照(95℃2min，95℃20s，57℃20s，72℃20s)共循环39次，95℃1min，55℃30s，95℃30s的程序进行检测，仪器共耗时2.5h；

7. 2h后保存数据并分析，采用2

扩增引物的设计：本发明针对的是IL-6基因，以GAPDH为内参基因。在NCBI里的基因库中搜索目的基因，查看GeneBank中的目的基因序列，根据检测要求进行引物参数的设计，如下表1所示。

表1

cDNA的合成：以总RNA为模板合成cDNA，采用5x HiScript II Q Select RTSuperMix，使用前将每种溶液涡旋振荡混匀，快速离心后收集残留在管壁的液体。在冰浴中完成反应体系的配制，在冰上解冻模板RNA后，按照表2所示配制反转录反应体系：

表2

在Veriti 96well Thermal Cycler PCR仪中进行去除基因组及反转录反应，反应程序为：50℃15min,85℃5s，反转录产物置于-20℃冰箱中保存备用。

Real-time qPCR：按照表3所示配制real-time qPCR反应体系，在本实验中使用的引物序列见表1，选择GAPDH基因作为内参，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表3

在CFX Connect Real-Time System实时荧光定量PCR仪中进行real-time qPCR反应，扩增程序为：95℃2min，然后进行40个循环：95℃20s,57℃20s，72℃20s。温度从55℃升至95℃，得到熔解曲线。结果由分析软件自动分析，生成扩增曲线并计算Ct值。采用2

结果如表4所示：

表4

测试结果显示，4’,7-双取代苯并二氢吡喃-4-酮在所测试的人肺源上皮细胞株中能有效抑制IL-6的表达水平(图2)，化合物e8，e9，e11和e14表现出来更好的抗炎活性。以上实验结果表明，本发明的化合物具有良好的抗肺炎活性，可用于抗肺部炎症药物的研究。