发酵乳杆菌及在羊奶强化型全麦酸面团面包制备中的应用

技术领域

本发明涉及食品加工技术应用领域，涉及一株可提高面包综合品质的发酵乳杆菌及其在一种营养强化型酸面团全麦面包中的应用。

技术背景

中国烘焙行业发展迅速，与饮食习惯相近的地区和国家相比，我国人均烘焙食品消费量还有很大上升空间。消费者易被新产品、新口味吸引，因此开发风味适口、营养价值高、低能量但饱腹感强、储藏性能好的主食尤为重要。目前，烘焙行业急需提升营养强化手段与生产技术来满足消费者日益增长的对于健康烘焙食品的需求。

将工业上产量较高的羊奶应用在烘焙食品中，可降低原有的羊膻味，在必须氨基酸组成上与谷物互补，降低升糖指数，提升产品综合品质。此外，将易发生品质劣化的鲜羊奶转化为可长期储存且品质稳定的羊奶粉并进一步应用于烘焙食品的制作，可以减少浪费，实现羊乳资源的高效利用。酸面团(Sourdough)技术是世界范围内公认的烘焙食品改良手段，该技术对于我国主食工业化的推进和未来全谷物食品的推广具有重要意义。

传统酸面团有着悠久的使用历史，是由谷物、水和具有活性的乳酸菌、酵母菌经发酵制得的面团。中国人一般将酸面团称为“老面”、“酵头”等，主要用于馒头发酵，但使用技术基本还停留在家庭或小作坊为单位的手工面制品制作，应用基础薄弱。此外，自然发酵酸面团的制备过程也存在品质不稳定，质量难控制，杂菌污染等问题。通过人工添加微生物制备酸面团，可以将不利风险降到最低。在烘培食品中添加益生菌发酵、增加全谷物的比例可以提供更好的营养价值和科技含量。烘焙食品在采用潜在益生菌发酵后，即使最终成品已经没有活菌，但发酵及焙烤过程中产生的后生元(包括细胞组分，细胞壁组分，细胞分泌物和代谢物)也具有一定的生理功能。此外，在发酵过程中能够产生多种风味物质，作为食品配料，将其应用于面食加工时，所得产品具有独特的发酵风味和质地，符合消费者感官需求。

中国发明专利申请201711083419.8公开了一种降脂美容芦荟葡萄面包蛋糕的制备方法，原料包括新鲜芦荟、新鲜紫葡萄、高筋面粉、紫米粉、酵母粉、羊奶、黄油、食盐、低筋面粉、鸡蛋液、普鲁兰多糖、椰子油；芦荟葡萄料的制备；将高筋面粉、紫米粉、酵母粉和羊奶放入和面机中，加水搅拌至面团状，取出恒温发酵，得面包团；将黄油加热至融化，加入芦荟葡萄泥混合均匀，与面包团一起投入到和面机中搅拌，取出，置入发酵箱内恒温发酵，得面包体；将鸡蛋液、羊奶、普鲁兰多糖和黄油混合搅拌，加入低筋面粉和芦荟葡萄汁继续搅拌，得蛋糕糊；制备面包蛋糕；具有降火气、调理血气、促进血液循环、消除疲劳、保护肝脏胃肠的功能，还可降低血脂，排除毒素，具有养颜美容、提高免疫力、抗癌、抗衰老功能。但是该技术仅仅利用酵母粉，面包蛋糕的风味和货架期有待提高，尤其是该技术主要是利用芦荟的自身美容效果，没有发挥面粉与芦荟的配合作用，其中的羊奶只是提供营养，没有发挥功能性效果。

发明内容

本发明旨在提供一种发酵乳杆菌及在羊奶强化型全麦酸面团面包制备中的应用，应用发酵乳杆菌制备全麦酸面团并提供一种控血糖羊奶强化全麦酸面团面包，提高面包的营养价值和消化性，延长面包的货架期，并改善面包的综合品质。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)，其保藏编号为GDMCC62472。

应用所述发酵乳杆菌制备羊奶强化全麦酸面团吐司面包的方法，包括以下步骤：

1)发酵乳杆菌的活化：将发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)接种于培养基后活化；

2)发酵乳杆菌发酵酸面团的制作：将活化后的发酵乳杆菌(LimosilactobacillusfermentumM4)溶于水中稀释制成接种物；将全麦粉与接种物混合制备DY值为166～200的全麦酸面团，充分搅拌混匀，36-38℃恒温培养；

3)面包面团的制作：将即发活性干酵母、复原羊奶和发酵乳杆菌酸面团混合搅拌；加入全麦粉、白砂糖和盐，搅拌，醒发；

4)定型：将得到的面团取出静置，分成小面团，卷成吐司状放入吐司盒，醒发；

5)焙烤：将醒发后的吐司状面团焙烤，即得羊奶强化全麦酸面团吐司面包。

为进一步实现本发明目的，优选地，所述的活化是发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)接种于MRS液体培养基后，36-38℃孵育16～18h，再转接入新鲜MRS液体培养基中，再培养16～18h后离心后弃上清；用无菌水重悬菌泥，调节菌液浓度为1-3×10

优选地，所述的发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)是保存在-80℃冰箱中。

优选地，以质量份数计，步骤2)中，所述的全麦粉为50～70份；接种物40～50份；36-38℃恒温培养的时间为12～18h。

优选地，以质量份数计，步骤3)中，所述的即发活性干酵母为1.0～2.0份、水复原羊奶为1～69.7份、发酵乳杆菌酸面团为1～32份、全麦粉75～100份、白砂糖为2～5份、盐为1～2份；步骤3)中还包括加入起酥油，加入量为1～5.0份，在加入全麦粉、白砂糖和盐后加入。

优选地，以质量份数计，所述的复原羊奶是将1份的纯生羊乳粉溶于6～8份蒸馏水中100～120℃下灭菌15～20min制得。

优选地，步骤3)中所述的醒发是将原料都加入搅拌后所得面包面团放入发酵盆后封口，32～37℃培养箱中醒发40～70min。

优选地，步骤4)中，所述的小面团用保鲜膜覆盖后定型，挤压出面团中的气泡再卷成吐司状放入吐司盒；步骤4)中醒发是32～37℃醒发40～100min。

优选地，步骤5)中，所述的焙烤是在预热好的烤箱烘烤，控制上火温度190～220℃，下火温度210～220℃。

本发明所使用的MRS肉汤培养基可使用市面上销售的MRS肉汤培养基，也可以自配MRS肉汤培养基，制备方法如下：分别称取10g蛋白胨、10g牛肉膏粉、4g酵母膏粉、20g葡萄糖、1.08g吐温-80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰，加入1L蒸馏水充分溶解，混合均匀后置于可高温灭菌的容器如锥形瓶中，封口后在高压灭菌锅中121℃下灭菌15min。

本发明与己有技术相比具有以下优点及有益效果：

(1)本发明通过羊奶强化增强了面包的营养价值，起到控血糖的作用。将羊奶应用于面包的制作可以继承羊奶的优良特性，削弱凝乳性能弱、膻味带来的不利影响。此外，额外添加羊奶可增强淀粉和蛋白质间的相互作用，降低α-淀粉酶对淀粉颗粒的可及性，影响烘焙过程中淀粉的糊化性能，从而降低血糖反应。复原羊乳的添加也为羊乳资源的多层次利用提供了途径，可以减少临期羊乳的浪费。

(2)本发明中发酵乳杆菌M4是潜在的益生菌，在面团中的应用具有所需接种量少、生长快、产酸快、产气的特点。此外，在面团发酵及焙烤过程中，发酵乳杆菌M4产生的后生元(包括细胞组分，细胞壁组分，细胞分泌物和代谢物)具有一定的生理功能，这赋予面包良好的功能特性，具有营养保健价值。

(3)本发明利用潜在益生菌菌株发酵乳杆菌M4发酵制作酸面团，并制备了营养强化型的酸面包，改善了全麦面包的烘焙及储藏品质，增大了面包比容，降低了硬度，提升了面包的持水性能，延长了货架期。发酵乳杆菌M4发酵酸面团的使用在一定程度上可以替代面包改良剂(亲水胶体、酶制剂)的使用，从而降低生产成本。

(4)本发明中羊奶强化全麦酸面团面包的制作方法简单，具有生产周期短，品质稳定，外皮颜色鲜亮，内部质地均匀等优点，满足了消费者对健康和美味的双重需求。此外，生产过程中不产生废弃物，有利于环境保护和资源的有效利用。

附图说明

图1为本发明中发酵乳杆菌M4应用于羊奶发酵时的生长曲线。

图2为本发明实施例1-3和对比例1总酚含量情况图。

图3为本发明实施例1-3和对比例1ABTS·自由基清除率情况图。

图4为实施例6、7及对比例2的剖面图。

图5为实施例4-7以及对比例1和2所得面的淀粉水解曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步说明，但本发明的实施方式不限于此。需指出的是，以下若有未特别详细说明之过程，均是本领域技术人员可参照现有技术实现或理解的。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，视为可以通过市售购买得到的常规产品。

本发明实施例中述慢速搅拌的转速为60～80转/分钟，快速搅拌的转速为180～240转/分钟。

本发明所使用的MRS肉汤培养基可使用市面上销售的MRS肉汤培养基，也可以自配MRS肉汤培养基，制备方法如下：分别称取10g蛋白胨、10g牛肉膏粉、4g酵母膏粉、20g葡萄糖、1.08g吐温-80、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三铵、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰，加入1L蒸馏水充分溶解，混合均匀后置于可高温灭菌的容器如锥形瓶中，封口后在高压灭菌锅中121℃下灭菌15min。

本发明所用发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)分离自豆腐黄浆水，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 62472，保藏地点为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，邮编510075；保存时间为2022年5月17日。该发酵乳杆菌的全基因组测序数据序列如SEQ.ID.NO1。经检测，发酵乳杆菌M4是一株安全可靠的。

主要原料包括：全麦粉由鲍勃红磨坊Bob's Red Mill Natural Foods公司生产，全脂生羊乳粉由陕西红星美羚乳业股份有限公司生产；其他原料包括：耐高糖高活性干酵母由安琪酵母股份有限公司生产，食用低钠盐由广盐集团股份有限公司生产，优级白砂糖由太古糖业(中国)有限公司生产；起酥油由南侨食品集团(上海)股份有限公司生产。

本发明在营养强化型酸面团面包的研制过程中，进行了比容、色度、质构、感官评价、货架期分析、挥发性风味、淀粉含量测定及升糖指数试验，具体方法如下。

①比容、色度测定：取烘焙出炉的待测面包室温冷却1h后使用电子天平测定质量，记为面包重量。将待测面包放入容器中，采用小米替代法测定体积，完全覆盖面包并摇实填满并刮平。接着取出面包，将小米倒入量筒中测量体积，容器体积与小米体积相减即可获得面包体积。比容为体积质量比，单位为mL/g，每个配方3个平行。色度测定将色差仪调整为CIE-L*a*b*颜色空间，分别用黑色陷阱和白板分别校零校正后获得色度信息。

②全质构、感官评价：采用TA-XT Plus质构仪按照AACC 74-09的方法，对面包进行质构分析(TPA)。面包测试样品制备：烘焙出炉的面包室温冷却1.5h后，切成厚度约为10mm的面包片。选取中间2片叠放在质构仪的样品台中央。质构仪测试参数设定为：选用P36/R探头，并令测前、测试、测后速度分别为2.5mm/s、1.0mm/s、5.0mm/s，触发力5g(触发点负载)，压缩程度为50％形变，两次压缩停留时间为10s。每个样品测定6次，获得平均值。采用9分制进行感官评价，评价标准参考ISO 6658制定。分数越高代表接受程度越好，其中1～9分分别表示极度不喜欢、非常不喜欢、不喜欢、有点不喜欢、适中、有点喜欢、喜欢、非常喜欢、极度喜欢。

③面包发霉变质分析：将面包样品包装在聚乙烯袋中放入恒温箱，以25±1℃存储一周，监测面包表面的霉菌菌落数目变化。评估侵染的标准为：无可见菌落(-)，1个菌落(+)，2个(++)和3个或3个以上(+++)。

④挥发性风味化合物分析：采用顶空固相微萃取(HS-SPME)和气相色谱质谱(GC-MS)联用检测全麦面包芯香气挥发性物质：简而言之，取2.5g新鲜面包芯样品放入20mL顶空瓶中，插入老化后的自动进样萃取探针，60℃置于顶空瓶的顶部空间萃取40min，取出探针并插入气相色谱质谱联用仪进样口(280℃)，以不分流模式解吸挥发物5min。毛细管色谱柱型号为Agilent DB-5MS(长度30m，内径0.25mm，膜厚0.25μm)，流速为2mL/min载气为氦气。具体程序参数为：35℃保留5min，然后以5℃/min的速度升至50℃并保留5min，最后以5.5℃/min速度升至230℃，保留5min。进样孔温度为250℃，电离方式为EI，离子源温度为200℃，电子能量为70eV，发射电流为200μA，采用全扫描采集方式，质量范围为33～495m/z。所得挥发物的GC-MS图谱及质谱通过与NIST 14Library数据进行匹配检索，并结合Kovats指数(KI)比较鉴定。匹配度高于80％认定为可靠。通过峰面积归一化方法对化合物进行定量。

⑤快消化淀粉、慢消化淀粉和抗性淀粉含量测定：参照Englyst等人提出的体外模拟酶水解法并结合GOPOD试剂盒进行测定。首先配酶液，将3g猪胰酶粉末磁力搅拌30min混匀于20mL蒸馏水，4500r/min离心10min，取13.5mL上清。另取0.7mL的葡萄糖苷酶到1.8mL的蒸馏水混匀，与上述上清液混匀，4℃冷藏待用，根据每次测定的样品数量多次配制混酶溶液并混合。接着配制pH5.2的缓冲液，将0.1mol/L醋酸和0.1mol/L醋酸钠按1:3.7混合，每升缓冲液加4mL的1mol/L的CaCl

称取1g(干基计，经测定含水量约为7％)冻干面包屑于50mL的离心管中(加一空瓶做空白)，与20mL缓冲液和1颗搅拌磁子涡旋混匀(模拟胃肠道蠕动环境)，37℃水浴15min。加入5mL的酶液并以100r/min磁力搅拌开启消化反应。反应20min后取0.25mL反应液于装有10mL 70％乙醇的离心管中，共取三份，在4500r/min下离心5min后取0.1mL的上清液于装有3mL GOPOD试剂(试剂盒提前配制)的小离心管中，48℃水浴20min，测定510nm处吸光值。另取0.1mL的1mg/mL的葡萄糖标准液(GOPOD试剂盒附送)做同样的处理，取0.1mL的蒸馏水作空白。在反应120min后再次取样，测试方法同20min反应液。将50mg面包溶于6ml 2M KOH中振荡30min，接着加入3ml 0.4M的醋酸钠和60μL葡萄糖苷酶，在60℃水浴下振荡45min。最后4000r/min离心10min后采用GOPOD试剂盒测定上清液中的葡萄糖浓度并以0.9为换算系数计算总淀粉含量(TS)。快消化淀粉(RDS)，慢消化淀粉(SDS)和抗性淀粉(RS)的计算方式如下。

RDS(％)＝(G20-FG)×0.9/TS

SDS(％)＝(G120-G20)×0.9/TS

RS(％)＝[TS-(RDS+SDS)]/TS

式中：G20为水解20min后产生的葡萄糖含量(mg)；FG——处理前淀粉中游离葡萄糖含量(mg)；G120——水解120min后产生的葡萄糖含量(mg)；TS——总淀粉含量(mg)。

⑥eGI值测定：首先配酶液，将3g猪胰酶粉末磁力搅拌30min混匀于20mL蒸馏水，4500r/min离心10min，取13.5mL上清。另取0.7mL的葡萄糖苷酶到1.8mL的蒸馏水混匀，与上述上清液混匀，4℃冷藏待用，根据每次测定的样品数量多次配制混酶溶液并混合。接着配制pH 5.2的缓冲液，将0.1mol/L醋酸和0.1mol/L醋酸钠按1:3.7混合，每升缓冲液加4mL的1mol/L的CaCl

取250mL锥形瓶往其中加入1颗磁子，取1g冻干面包屑至锥形瓶中，加入20mL蒸馏水，同时做空白对照。用盐酸(5％w/w 4mL)调节溶液pH＝1.2(记录盐酸用量)，加入浓度为2％的胃蛋白酶溶液1mL后在37℃水浴摇床中孵化，同时作空白。孵化30min后取0.5mL消化液测葡萄糖当量，记为0min的葡萄糖当量，同时用2mL 1M NaOH溶液和滴管滴加几滴0.1M的NaOH溶液(记录NaOH用量)调节孵化液pH＝5.2，加入5mL混合酶，继续在摇床中消化，分别在10、20、40、60、80、120、160、180min取0.5mL消化液，采用GOPOD法测定孵化液中葡萄糖当量。根据孵化液中的葡萄糖当量计算样品在消化过程中各时间点的淀粉水解率。淀粉水解曲线遵循：C＝C

eGI＝(0.862×HI)+8.198

采用Origin 2021拟合函数后，根据公式可计算得到不同全麦面包的水解指数(Hydrolysis Index,HI)和估测血糖指数。根据Granfeldt等人推导的公式计算血糖指数(eGI)的估算值。其中t

⑦多酚含量测定：首先制备多酚提取液：在前人的基础上有一定修改。粉碎真空冷冻干燥后的八种面包芯囊，分别取2g粉末加入25mL 80％的甲醇溶液，在37℃下，以900r/min磁力搅拌下避光提取2h，接着超声30min。将提取液以5500r/min离心处理10min后取上清液备用，接着加入25mL 80％甲醇溶液在剩余残渣中以相同方法重复提取，合并两次提取上清液，混匀后4℃冰箱避光保存，以便进一步分析

采用Folin-Ciocalteau法进行多酚含量测定：取1mL多酚提取液，加入1mL的福林酚试剂(用5倍体积水稀释过的)和3mL的水，振荡后加入5mL10％Na

⑧抗氧化性活性分析(ABTS·自由基清除)方法：

分别配置ABTS(7mmol/L)和过硫酸钾(2.45mmol/L)溶液，等量混合避光反应16h，得到ABTS+·储备液。接着对储备液用蒸馏水调吸光度为0.70±0.05(波长为734nm)作为ABTS+·反应液(现配现用)。取3mL ABTS+·反应液，加入0.4mL面包提取液，振荡后室温静置30min后，取离心后的上清液测定734nm波长处的吸光度。以蒸馏水代替面包提取液为对照组，以蒸馏水代替ABTS+·反应液为空白组。面包ABTS自由基清除能力以VC当量(VCE)(mgVC/g面包粉末质量)表示。

实施例1：发酵乳杆菌M4的全基因组序列分析

(1)采用三代ONT和二代Illumina相结合的技术手段完成了发酵乳杆菌M4全基因组序列的测定，发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)的16srDNA序列如SEQ.ID.NO1所示。结果表明，发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)基因组含一个2,032,184bp的环状染色体，平均G+C含量为51.75％。

(2)采用综合抗生素耐药性(CARD)非冗余蛋白质序列(Nr)等数据库注释基因，结果表明，发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)无抗生素耐药基因，含有与耐酸、耐胆盐、粘附等胃肠道耐受性相关的基因，与前期表型研究相符；

(3)采用致病基因数据库(PHI、VFDB)检索，发酵乳杆菌(LimosilactobacillusfermentumM4)基因组中的潜在致病或毒力基因，结果表明，发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)不含任何毒力或致病基因，是一株安全可靠的潜在益生菌菌株。

(4)糖利用实验表明，，发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)能利用多种不同基质中的葡萄糖、乳糖、果糖、木糖、棉子糖、水苏糖、木聚糖、蔗糖、麦芽糖等，与碳水化合物功能注释的结果一致，奠定了其在多种不同基质中生长的基础。

实施例2：发酵乳杆菌M4在羊奶中的生长曲线

(1)复原羊奶的制备方法为：取1份(49g)的纯生羊乳粉(蛋白含量25g/每100g)溶于6.143份(301g)蒸馏水中100℃下灭菌15min，冷却后即可得到羊奶。在后续用于面包制作时，为了调节面团中类似的水分和固形物含量，含羊奶的样品应添加更多羊奶，更少面粉。

(2)发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)在羊奶中的生长曲线：在羊奶灭菌前另以2％的比例添加蔗糖保证碳源充足。每2h取样梯度稀释后，选合适浓度涂布到MRS琼脂平板中，并在24h后进行活菌计数，重复三次取平均值。

由图1可知，发酵乳杆菌M4以3.1×10

实施例3：发酵乳杆菌M4在全麦面团中的生长发酵情况

生长发酵实验：在全麦面团中，以6.60log(CFU/g)的初始浓度接种，发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)，发酵12h，菌数可达到9.81log(CFU/g)。继续发酵至21h，达到10.02log(CFU/g)。此外，经12h发酵即可使pH降低到4.0以下，具有在全麦面团体系中良好的生长发酵能力。

此外，发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)具有丰富的碳水化合物水解酶系(可以较好地利用酸面团环境中的麦芽糖、蔗糖、木聚糖等碳水化合物)，具有较强的蛋白水解系统，并且具有合成氨基酸、B族维生素、酚酸代谢的潜力。极强的产酸能力主要与7个L-乳酸脱氢酶基因有关。这些优良的适应性和代谢特点，为其作为潜在酸面团发酵剂提供了理论依据。

实施例4：发酵乳杆菌M4发酵酸面团全麦面包

(1)发酵乳杆菌的活化：从-80℃冰箱取出发酵乳杆菌(LimosilactobacillusfermentumM4)甘油冻藏管，取50μL发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)接种于5ml MRS液体培养基后，37℃孵育18h，取100μL转接入10mL新鲜MRS液体培养基中，再培养18h后，以4500r/min离心后弃上清；用无菌水重悬菌泥，并调节菌液浓度约为10

(2)发酵乳杆菌发酵酸面团的制备：将66.67(187.5g)份的全麦粉与44.44(125g)份的接种物(3：2)混合制备DY值为166.7的全麦酸面团。保证最终进入面团的发酵乳杆菌M4初始浓度在10

(3)面包面团的制作：加入1.0(2.8125g)份即发活性干酵母、53.33(150g)份水和所得的成熟发酵乳杆菌酸面团(重量计约32(90g)份)，低速搅拌1分钟。接着取80(225g)份全麦粉、2.0(5.625g)份白砂糖、1.0(2.8125g)份盐放入搅拌缸中低速搅拌2分钟，快速搅拌3分钟，最后低速搅拌1分钟；取出面团，放入发酵盆后封口，37℃培养箱中醒发70min。

(4)面包面团的定型与焙烤：将得到的面团取出静置5分钟后，等分成约150g/块的小面团，再次用保鲜膜覆盖10min后定型，用擀面杖挤压出面团中的气泡，卷成吐司状放入吐司盒，37℃醒发100min。之后放入预热好的烤箱，上下火220℃烘烤35min，即得全麦酸面团面包。

烘焙及感官品质分析的结果显示，全麦酸面团面包的比容为3.11cm

实施例5：发酵乳杆菌M4发酵酸面团羊奶全麦面包1

(1)发酵乳杆菌的活化：从-80℃冰箱取出发酵乳杆菌(LimosilactobacillusfermentumM4)甘油冻藏管，取50μL发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)接种于5ml MRS液体培养基后，37℃孵育18h，取100μL转接入10mL新鲜MRS液体培养基中，再培养18h后，以4500r/min离心后弃上清；用无菌水重悬菌泥，并调节菌液浓度约为10

(2)发酵乳杆菌发酵酸面团的制作：用无菌水重悬并调菌浓度大致相当于细胞密度约为10

(3)复原羊奶的制备方法为：取1份(49g)的纯生羊乳粉(蛋白含量25g/每100g)溶于6.143份(301g)蒸馏水中100℃下灭菌15min，冷却后即可得到羊奶。在后续用于面包制作时，为了调节面团中类似的水分和固形物含量，含羊奶的样品可以添加更多羊奶，更少面粉。

(4)面包面团的制作：加入1.0(2.8125g)份即发活性干酵母、54(151.92g)份复原羊奶和先前得到的成熟发酵乳杆菌酸面团(重量计约32(90g)份)，低速搅拌1分钟。接着取75(211g)份全麦粉、2.0(5.625g)份白砂糖、1.0(2.8125g)份盐放入搅拌缸中低速搅拌2分钟，快速搅拌3分钟，最后低速搅拌1分钟；取出面团，放入发酵盆后封口，37℃培养箱中醒发70min。

(5)面包面团的定型与焙烤：将得到的面团取出静置5分钟后，等分成约150g/块的小面团，再次用保鲜膜覆盖10min后定型，用擀面杖挤压出面团中的气泡，卷成吐司状放入吐司盒，37℃醒发100min。之后放入预热好的烤箱烘烤35min，上下火220℃，即得到所述实施例5。

烘焙及感官品质测定结果表明，羊奶强化全麦酸面团面包(实施例5)的比容为2.72cm

实施例6发酵乳杆菌M4发酵酸面团羊奶全麦面包2(含起酥油)

(1)发酵乳杆菌的活化：从-80℃冰箱取出发酵乳杆菌(LimosilactobacillusfermentumM4)甘油冻藏管，取50μL发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)接种于5ml MRS液体培养基后，37℃孵育16h，取70μL转接入5mL新鲜MRS液体培养基中，再培养16h后，以4500r/min离心后弃上清；用无菌水重悬菌泥，并调节菌液浓度约为10

(2)发酵乳杆菌发酵酸面团的制作：用无菌水重悬并调菌浓度大致相当于细胞密度约为10

(3)复原羊奶的制备方法为：取1份(49g)的纯生羊乳粉(蛋白含量25g/每100g)溶于8份(392g)蒸馏水中120℃下灭菌20min，冷却后即可得到羊奶。在后续用于面包制作时，为了调节面团中类似的水分和固形物含量，含羊奶的样品应添加更多羊奶，更少面粉。

(4)面包面团的制作：加入2.0(5.625g)份即发活性干酵母、60(168.75g)份复原羊奶和先前得到的成熟发酵乳杆菌酸面团(重量计约32(90g)份)，低速搅拌1分钟。接着取75(211g)份全麦粉、5.0(14.0625g)份白砂糖、2.0(5.625g)份盐放入搅拌缸中低速搅拌2分钟，加入5.0(14.0625g)份起酥油并快速搅拌3分钟，最后低速搅拌1分钟；取出面团，放入发酵盆后封口，32℃培养箱中醒发40min。

(5)面包面团的定型与焙烤：将得到的面团取出静置5分钟后，等分成约150g/块的小面团，再次用保鲜膜覆盖10min后定型，用擀面杖挤压出面团中的气泡，卷成吐司状放入吐司盒，37℃醒发40min。之后放入预热好的烤箱烘烤30min，上火200℃，下火220℃，即得到所述实施例6。

羊奶强化全麦酸面团面包(加起酥油)的感官评分为7.8分。感官上，由于全麦酸面团发酵时间和加水量，以及羊奶浓度降低，面包出现了轻微粘牙感，酸味略强于其他样品，且面包颜色较深。由于发酵时间较长，最终面包出现较多孔洞，泡窝均匀度一般。

羊奶强化全麦酸面团面包(加起酥油)估测血糖指数eGI为68.83。

实施例7发酵乳杆菌M4发酵酸面团羊奶全麦面包3(含起酥油)

(1)发酵乳杆菌的活化：从-80℃冰箱取出发酵乳杆菌(LimosilactobacillusfermentumM4)甘油冻藏管，取50μL发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentumM4)接种于5ml MRS液体培养基后，37℃孵育16h，取70μL转接入5mL新鲜MRS液体培养基中，再培养16h后，以4500r/min离心后弃上清；用无菌水重悬菌泥，并调节菌液浓度约为10

(2)发酵乳杆菌发酵酸面团的制作：用无菌水重悬并调菌浓度大致相当于细胞密度约为10

(3)复原羊奶的制备方法为：取1份(49g)的纯生羊乳粉(蛋白含量25g/每100g)溶于6份(301g)蒸馏水中120℃下灭菌20min，冷却后即可得到羊奶。在后续用于面包制作时，为了调节面团中类似的水分和固形物含量，含羊奶的样品应添加更多羊奶，更少面粉。

(4)面包面团的制作：加入2.0(5.625g)份即发活性干酵母、60(168.75g)份复原羊奶和先前得到的成熟发酵乳杆菌酸面团(重量计约32(90g)份)，低速搅拌1分钟。接着取75(211g)份全麦粉、5.0(14.0625g)份白砂糖、2.0(5.625g)份盐放入搅拌缸中低速搅拌2分钟，加入5.0(14.0625g)份起酥油并快速搅拌3分钟，最后低速搅拌1分钟；取出面团，放入发酵盆后封口，37℃培养箱中醒发45min。

(5)面包面团的定型与焙烤：将得到的面团取出静置5分钟后，等分成约150g/块的小面团，再次用保鲜膜覆盖10min后定型，用擀面杖挤压出面团中的气泡，卷成吐司状放入吐司盒，37℃醒发40min。之后放入预热好的烤箱烘烤30min，上火210℃，下火220℃，即得到所述实施例6。

羊奶强化全麦酸面团面包(加起酥油)的感官评分为8.3分。该面包羊奶及酸面团风味浓郁，颜色优于其他样品。酸度适宜，质构松软，泡窝均匀，可接受性最好。

羊奶强化全麦酸面团面包(加起酥油)估测血糖指数eGI为67.27。

对比例1：全麦面包1

(1)面包面团的制作：加入1.0(2.8125g)份即发活性干酵母、66.67(187.5g)份水，低速搅拌1分钟。接着取100(281.25g)份全麦粉、2.0(5.625g)份白砂糖、1.0(2.8125g)份盐放入搅拌缸中低速搅拌2分钟，快速搅拌3分钟，最后低速搅拌1分钟；取出面团，放入发酵盆后封口，37℃培养箱中醒发70min。

(2)面包面团的定型与焙烤：将得到的面团取出静置5分钟后，等分成约150g/块的小面团，再次用保鲜膜覆盖10min后定型，用擀面杖挤压出面团中的气泡，卷成吐司状放入吐司盒，37℃醒发100min。之后放入预热好的烤箱烘烤35min，上下火220℃，即得到所述对比例1。

烘焙及感官品质测定结果表明(见表1)，普通全麦面包(对比例1)的比容为2.67cm

对比例2：全麦面包2(含起酥油)

(1)面包面团的制作：加入2.0(5.625g)份即发活性干酵母、66.67(187.5g)份水，低速搅拌1分钟。接着取100(281.25g)份全麦粉、2.5(14.0625g)份白砂糖、2.0(5.625g)份盐放入搅拌缸中低速搅拌2分钟，加入5.0(14.0625g)份起酥油并快速搅拌3分钟，最后低速搅拌1分钟；取出面团，放入发酵盆后封口，37℃培养箱中醒发50min。

(2)面包面团的定型与焙烤：将得到的面团取出静置5分钟后，等分成约100g/块的小面团，再次用保鲜膜覆盖10min后定型，用擀面杖挤压出面团中的气泡，卷成吐司状放入吐司盒，37℃醒发40min。之后放入预热好的烤箱烘烤30min，上火190℃，下火210℃，即得到所述的对比例2。

普通全麦面包(加起酥油)的感官评分为7.2分。中规中矩的全麦面包口感，感官略显粗糙，风味一般。

普通全麦面包(加起酥油)估测血糖指数eGI为80.52。

图4从左到右分别为实施例6、7及对比例2的剖面图，从图可见实施例6、7及对比例2都制备产品明显为面包。

图5为实施例4-7以及对比例1和2所得面的淀粉水解曲线图，可见在水解性能方面本发明实施例与对比例基本相近。

从以上实施例可以看出，加入发酵乳杆菌M4制备的酸面团可使得面包比容明显增加，硬度降低，羊奶的添加则使得面包比容下降，硬度增加。与对比例1相比，实施例3硬度增加了约29.8％。通过联用酸面团处理，使实施例5的硬度下降到了比对比例1更低的水平，即酸面团削弱了羊奶强化带来的不利质构影响。

从以上实施例可以看出，羊奶的添加使得面包芯L*、a*、b*均有增加，尤其是面包整体的亮度增加，酸面团的添加在一定程度上降低了亮度。此外实施例5和实施例6具有较高的感官得分，即羊奶联合发酵乳杆菌M4制备酸面团的使用提升了面包整体的感官特性。

对本发明实施例不同全麦面包的挥发性风味物质进行聚类分析热图测试，测试中红色代表含量较高，蓝色代表含量较低；挥发性风味物质测定结果进一步证实了羊奶和酸面团带来的风味物质组成方面的显著差异，己醛、草酸等物质的含量因为羊奶的添加而减少，但是增加了众多酯类、醛类的相对含量。该结果表明羊奶强化对于面包风味的影响显著。未添加发酵乳杆菌M4发酵酸面团的组别及酸面团组别也存在明显的差异，其中乙酸、多种醛类及酯类是造成两类面包间风味差异的主要物质，比如2-壬烯醛、癸醛、2,4-葵二烯醛、壬醛、3-甲基-1-丁醇(花果香)等的含量都有显著提升，这赋予酸面团面包独特的风味，使得实施例4和实施例5具有较好的感官特性。

从以上实施例可以看出，发酵乳杆菌M4发酵12h制备的酸面团能够在一定程度上抑制全麦面包中霉菌的生长，相比于对照组，将全麦面包的保质期延长了1～2天。

从以上实施例可以看出，经羊奶和发酵乳杆菌M4发酵协同改良的全麦面包(实施例5)，其总酚含量在所有面包中最大(1.540mg/g)，约是对比例1的1.15倍。ABTS·自由基清楚能力也强于对照例1(图3)。

从以上实施例可以看出，在淀粉消化性方面(表3)，添加羊奶、酸面团对面包的可消化淀粉部分均有积极影响，淀粉消化速率显著减慢，即RDS显著下降，SDS和RS均有一定程度的增加。实施例5和实施例6具有较低的eGI(64.07/62.58)，使得高GI(GI≥70)的面包成为了中等GI(56≤GI≤69)的面包。

表1为本发明实施例和对比例1中不同全麦面包样品的基本特征测试情况表。表2为本发明实施例和对比例1中不同全麦面包挥发性风味物质统计表。表3为本发明实施例和对比例1中不同全麦面包储藏过程中的霉菌侵染情况表。表4为本发明实施例和对比例1中不同全麦面包的总淀粉、快消化淀粉、慢消化淀粉、抗性淀粉含量、水解指数及估测血糖指数统计表。

表1：面包的基本特征

表2：全麦面包的挥发性风味化合物

注：nd表示未检出

表3：霉菌侵染情况

注：霉菌侵染情况：无明显菌落(-)，一个菌落(+)，两个菌落(++)，三个及以上菌落(+++)

实施例4和5以及对比例1所得面包的总淀粉、快消化淀粉、慢消化淀粉、抗性淀粉含量、水解指数及估测血糖指数情况如表4所示。

表4

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南理工大学

<120> 发酵乳杆菌及在羊奶强化型全麦酸面团面包制备中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 11

<211> 1477

<212> DNA/RNA

<213> 发酵乳杆菌(Limosilactobacillus fermentum M4)

<400> 11

ggggcagggc ggtgctataa tgcagtcgac gcgttggccc aattgattga tggtgcttgc 60

acctgattga ttttggtcgc caacgagtgg cggacgggtg agtaacacgt aggtaacctg 120

cccagaagcg ggggacaaca tttggaaaca gatgctaata ccgcataaca acgttgttcg 180

catgaacaac gcttaaaaga tggcttctcg ctatcacttc tggatggacc tgcggtgcat 240

tagcttgttg gtggggtaac ggcctaccaa ggcgatgatg catagccgag ttgagagact 300

gatcggccac aatgggactg agacacggcc catactccta cgggaggcag cagtagggaa 360

tcttccacaa tgggcgcaag cctgatggag caacaccgcg tgagtgaaga agggtttcgg 420

ctcgtaaagc tctgttgtta aagaagaaca cgtatgagag taactgttca tacgttgacg 480

gtatttaacc agaaagtcac ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggtgg 540

caagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa gagagtgcag gcggttttct aagtctgatg 600

tgaaagcctt cggcttaacc ggagaagtgc atcggaaact ggataacttg agtgcagaag 660

agggtagtgg aactccatgt gtagcggtgg aatgcgtaga tatatggaag aacaccagtg 720

gcgaaggcgg ctacctggtc tgcaactgac gctgagactc gaaagcatgg gtagcgaaca 780

ggattagata ccctggtagt ccatgccgta aacgatgagt gctaggtgtt ggagggtttc 840

cgcccttcag tgccggagct aacgcattaa gcactccgcc tggggagtac gaccgcaagg 900

ttgaaactca aaggaattga cgggggcccg cacaagcggt ggagcatgtg gtttaattcg 960

aagctacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcttgcg ccaaccctag agatagggcg 1020

tttccttcgg gaacgcaatg acaggtggtg catggtcgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 1080

gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttacta gttgccagca ttaagttggg 1140

cactctagtg agactgccgg tgacaaaccg gaggaaggtg gggacgacgt cagatcatca 1200

tgccccttat gacctgggct acacacgtgc tacaatggac ggtacaacga gtcgcgaact 1260

cgcgagggca agcaaatctc ttaaaaccgt tctcagttcg gactgcaggc tgcaactcgc 1320

ctgcacgaag tcggaatcgc tagtaatcgc ggatcagcat gccgcggtga atacgttccc 1380

gggccttgta cacaccgccc gtcacaccat gagagtttgt aacacccaaa gtcggtgggg 1440

taacctttta ggagccagcc gctaagtgac agatggt 1477