食品着色剂

技术领域

本公开涉及食品着色剂。尤其地，本公开涉及直链的含四吡咯的化合物，诸如天然藻胆蛋白，例如藻红蛋白，作为用于食品，例如在肉类仿制食品和肉类替代食品中的着色剂和/或金属离子载体，以及作为用于它们的成分的用途。本公开还涉及食品，例如肉类仿制食品和肉类替代食品，以及用于它们的成分，该成分包括所述着色剂。

背景技术

由于需要养活不断增长的估计到2050年将达到97亿人的全球人口，因此需要重新平衡世界食物来源中的动物衍生组分，以实现可持续的食物系统并提高食物和营养安全。由于消费者饮食模式的转变，肉类产品的植物衍生替代品代表了一个不断增长的市场。消费者越来越关注食品系统对环境、气候变化和动物伦理的影响，这会影响他们对食物购买的选择。纯素食主义者、素食主义者和正在减少肉食消费的动物肉食者(忌肉主义者或半荤半素食主义者)正在推动对完全或大部分由非动物产品制成的肉类替代品的需求。

自1960年代以来，使用挤压技术由大豆粉或浓缩物制成的组织大豆蛋白产品已成为切碎的或绞碎的肉的普遍替代品。最近，其它非动物蛋白源，例如真菌蛋白、蘑菇、豆类(例如豌豆、羽扇豆、黄豆)和小麦也在被制造成肉类替代品或肉类仿制品。

然而，动物肉包含蛋白质结构和纤维的复杂基质，其中有堆积脂肪(trappedfats)、碳水化合物、水和其它分子，它们有助于含肉食品在其生的和熟的状态的感官、质地和结构上的特征(例如外观、风味、咀嚼性、多汁性)。虽然消费者可能出于生态或道德原因愿意消除或减少肉类消费，但许多人仍然更喜欢肉类替代品来重现“肉类体验”：不仅在诸如外观、风味和质地的感官方面，而且在例如储存、处理和烹饪的物理方面呈现和表现得像动物肉。烹饪和膳食准备的方法深深植根于文化之中，并且非常抗拒快速变化。鉴于动物肉的复杂结构和分子组成，重现各种特征以使得非动物衍生的肉类替代品模仿或重现动物肉的生熟特征仍然具有挑战性。

希望再现的特征之一涉及肉类替代产品或肉类仿制产品的外观，特别是在生(未烹饪)和熟的状态下的颜色。由于血红蛋白和肌红蛋白(负责在脊椎动物血液中运输氧气的铁和氧结合的结合蛋白)的存在，生的动物肉，例如鸡肉、牛肉、羊肉或猪肉，通常呈粉红色或红色。然而，一旦例如在大约60-80℃的温度下烹饪时，这些蛋白质会变性，并且肉会变色，失去其原始状态的粉红色或红色，通常会变成白色、棕色和/或灰色。这为厨师提供了视觉指示并帮助指导烹饪时间以实现烹饪的产品所需的风味和/或质地，并且在某些情况下提供与热处理相关的食品安全的指示。

目前用于为肉类仿制产品或肉类替代产品提供粉红色或红色的一种选择是植物衍生着色剂，例如甜菜根和萝卜提取物。但是，虽然这提供了一种用于在生的状态下的肉类仿制产品或肉类替代产品(类似于动物肉)呈现粉红色或红色的产品，但它在被烹任时没有跟随肉类替代品或仿制产品变成白/棕色/灰色的视觉体验。由于烹饪时没有明显的颜色变化，因此厨师会将肉烹任过头以达到所需的烹任颜色。仍然需要用于肉类替代品和仿制产品的着色剂，这些肉类替代品和仿制产品在视觉上表现出类似于动物肉烹任时观察到的颜色变化。

藻胆蛋白(PBP)是在蓝藻(蓝绿藻)、某些真核微藻和巨藻，诸如红藻(红藻门)、一些隐藻和甲藻中发现的高度水溶性荧光蛋白，包含与直链四吡咯发色团(称作后胆色素类)共价结合的蛋白链。组装成膜外分子超结构，称为藻胆体，它们通过作为捕获和转移光能的天线来用作光捕获色素，否则叶绿素无法获得光能。

构成藻胆体的藻胆蛋白排列在两个结构上不同的单元：核和杆中，包括αβ亚基的三聚体(核)或六聚体(杆)的堆叠盘的圆柱体。αβ亚基本身是异二聚体，由共价连接到直链(非环状)四吡咯发色团的α和β多肽链(每个约160-180个氨基酸残基)组成，其中直链(非环状)四吡咯发色团赋予光吸收特性。

根据它们的吸收特性，藻胆蛋白通常分为四个亚类：蓝色藻蓝蛋白(典型的λ

一些常见的吸收和发射值的实例示于下面表1。

表1藻胆蛋白的示例性吸收和发射值

赋予这些特性的四种发色团是藻红胆素(PEB)、藻尿胆素(PUB)、藻蓝胆素(PCB)和藻紫胆素(PXB)(参见下面方案1-在通过二硫键与肽连接的情况下进行图示)。π-电子共轭的差异决定了它们的吸收特性和颜色。

方案1

科学文献中充满了藻胆蛋白的特征，在亚类中可能会发现一些共同的主题。藻红蓝蛋白以三聚体(αβ)

尽管如此，甚至在相同类型的藻胆蛋白，例如藻红蛋白之间也观察到光谱差异。例如，藻红蛋白之间的光谱差异反映了PEB和PUB发色团的含量和比例(参见，例如KlotzA.V.,and Glazer,A.N,The Journal of Biological Chemistry,260,4856-4863,1985)，并且其它地方已经表明，从各种红藻门物种中纯化的藻红蛋白可能表现出不同的UV可见吸收光谱特性。(参见例如，Rennis,D.S.,and Ford,T.W.,A survey of antigenicdifferences between phycoerythrins of various red algal(Rhodophyta)species,Phycologica,(1992),31,192-204)；和Ma,J,et al,Nature,2020,579,146-151)。尤其是，虽然一些藻红蛋白在大约495-503nm和540-570nm处表现出吸收峰，但已表明从一些物种中提取的藻红蛋白在UV可见光谱中大约495-503nm处表现出减小或不存在的峰(参见Rennisand Ford,supra,page 197,Fig.1；和Ma et al,supra,Extended Data Fig.1)。这归因于较低的PUB含量(Ma,J,et al,supra,)。藻胆蛋白(诸如藻红蛋白)的α、β和γ亚基的每个也可能具有不同的吸光度概况(参见Tamara et al,Chem 5,1302–1317,2019)，因此可能导致藻红蛋白之间的光谱差异。在其它地方，据报道C-藻红蛋白(裂须藻属(Schizothrixcalicola))在565nm(PEB)的可见区域表现出主要的吸收最大值；R-藻红蛋白(三叉仙菜(Ceramium rubrum))在567nm(PEB)>538nm(PEB)>498(PUB)的可见区域表现出主要的吸收最大值；以及B-藻红蛋白(紫球藻(Porphyridium cruentum))在545nm(PEB)>563nm(PEB)>498(S)(PUB)的可见区域表现出主要的吸收最大值(Glazer,A.N.,and Hixson,C.S.,TheJournal of Biological Chemistry,250,5487—5495,1975)。

因此，藻胆蛋白的蛋白质亚基和发色团的准确数量和性质(以及因此的藻胆蛋白的吸收光谱特性)以及产生的量取决于物种，并且会进一步受到生长条件(例如光、温度、营养素、pH等)的影响，因此可能导致物理和光谱特性差异，即使在单个藻胆蛋白亚类中也是如此。

藻胆蛋白表现出强烈的荧光特性，并在生物技术中发现许多应用，例如基于荧光的技术和免疫测定。它们还用作食品工业中的食品着色剂，其中来自螺旋藻Spirulina(钝顶螺旋藻Arthrospira platensis)的藻蓝蛋白用作蓝色着色剂(例如在口香糖、冰糕、冰淇淋、糖果、软饮料和乳制品中)，以及据报道的从P.cruentum中提取的B-和b-藻红蛋白在果冻甜点和乳制品中用作红色着色剂(Dumay,J.et al同上)。

发明内容

现在令人惊讶地发现，某些藻胆蛋白(例如藻红蛋白)当存在于待烹饪的食品，诸如肉类仿制食品或肉类替代食品中时，可以在视觉上提供与动物肉在烹饪过程中发生的相似的颜色变化，例如颜色从红色或粉红色(“生的”状态)变为白色、棕色和/或灰色(“熟的”)。因此，使用藻胆蛋白(例如藻红蛋白)作为肉类仿制产品和肉类替代产品中的着色剂，可以为消费者提供模拟动物肉在烹饪过程中的视觉颜色烹饪体验。

第一方面，提供了一种肉类仿制食品，该肉类仿制食品包含一种或多种藻胆蛋白，该藻胆蛋白的量足以在视觉上赋予食品粉红色或红色，在烹饪食品至内部温度在约50-95℃的范围内，例如在约60-85℃内时，该肉类仿制食品提供视觉颜色变化。

另一方面提供了一种或多种藻胆蛋白在制备肉类仿制食品中的用途，其中该一种或多种藻胆蛋白以足以赋予食品视觉上的粉红色或红色的量包含在食品中，并且随后在将食品烹饪至内部温度在约50-95℃的范围内，例如约60-85℃时提供视觉颜色变化。

再一方面提供一种本公开的熟的肉类仿制食品。

在上述的一些实施方式中，该一种或多种藻胆蛋白至少包括藻红蛋白，例如R-藻红蛋白和/或B-藻红蛋白和/或C-藻红蛋白和/或b-藻红蛋白。在进一步的实施方式中，该一种或多种藻胆蛋白还包括藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白中的一种或多种。在更进一步的实施方式中，藻红蛋白包括按重量计该一种或多种藻胆蛋白的至少50％，例如至少80％、90％或95％。在进一步的实施方式中，该一种或多种藻胆蛋白基本上由藻红蛋白组成。

在一些实施方式中，观察到藻胆蛋白的λ

在一些实施方式中，藻红蛋白可以从一种或多种合适的藻类物种中获得并且以提取的、纯化的(例如纯度为至少90％、95％或99％)或至少部分纯化(例如，纯度大于50％，例如纯度大于60％、70％或80％)的形式包含在食品中。在一些实施方式中，该一种或多种藻胆蛋白以藻类形式被包含在食品中并且可以以完整的或浸渍的藻类被包含，它可以是湿的(例如，在水中的糊剂、悬浮液或浆液，呈液态或冷冻状态)或干的(例如通过加热、蒸发或冷冻干燥进行干燥)。

在上述的任何一个或多个方面或实施方式中，肉类仿制食品包括非动物蛋白源、一种或多种碳水化合物、一种或多种脂肪和油(优选地为植物衍生的，即非动物的)、一种或多种风味组分和水。其它组分，例如增稠剂、粘合剂和防腐剂可以被添加。在它们的进一步的实施方式中，肉类仿制产品包含大豆蛋白，例如组织大豆蛋白，或其它植物基蛋白，例如蚕豆、豌豆、小麦、鹰嘴豆和绿豆。

在上述的任何一个或多个方面或实施方式中，肉类仿制食品可以是家禽肉(例如鸡肉)、牛肉(beef)、小牛肉、羔羊肉、猪肉、山羊肉、袋鼠肉或鱼肉/海鲜肉仿制品。在一些进一步的实施方式中，肉制品是碎的肉类仿制食品。

已经发现某些藻胆蛋白，例如藻红蛋白，具有与金属离子例如铁(Fe)螯合及增加铁蛋白的产生的能力，因此也可以为食品中金属离子输送，尤其是作为营养价值的铁输送提供便利的机制。因此，在上述的一个或多个方面或实施方式中，一种或多种藻胆蛋白可以与诸如铁Fe

附图说明

图1描绘了通过将100μL澄清的藻红蛋白样品从25℃加热至95℃获得的DSF荧光信号。

图2描绘了在95℃下加热6min之前和之后藻红蛋白提取物的UV/VIS吸收光谱。

图3描绘了从紫球藻(Porphyridium purpureum)、海门冬(Asparagopsistaxiformis)、柏桉藻(Bonnemaisonia hamifera)和野生红海藻中获得的澄清藻红蛋白提取物的UV/VIS吸收光谱。

图4描绘了从20-95℃在536nm处从紫球藻、海门冬、柏桉藻和野生红海藻中获得的藻红蛋白提取物的热变性。

图5描绘了由培养物中生长的盐生红胞藻属(Rhodomonas salina)红色微藻生物质制备的藻红蛋白提取物(从20℃加热至95℃之前和之后)在室温下的UV/VIS吸收光谱。

图6描绘了由培养物中生长的盐生红胞藻属(Rhodomonas salina)红色微藻获得的藻红蛋白提取物在550nm处从20℃到95℃的温度扫描。

图7描绘了随着氯化铁(II)浓度增加的藻红蛋白提取物的荧光发射光谱。

具体实施方式

贯穿本说明书和所附权利要求，除非上下文另有要求，词语“包括”和诸如“包括(comprises)”和“包括(comprising)”的变体将被理解为暗示包含所述整数或步骤或整数组，但不排除任何其它整数或步骤或整数组或步骤组。

贯穿本说明书和所附权利要求，除非上下文另有要求，短语“基本上由……组成(consisting essentially of)”和诸如“基本上由……组成(consists essentially of)”之类的变体将被理解为表明所列举的要素是必要的，即本发明的必要要素。该短语允许存在其它未列举的元素，这些未列举的元素不会实质性地影响本发明的特征，但排除了会影响本发明所定义的基本和新颖性特征的其它未指定元素。

本说明书中对任何先前出版物(或衍生自它的信息)或任何已知事项的引用不是也不应被视为认可或承认或任何形式的暗示该先前出版物(或衍生自它的信息)或已知事项构成本说明书所涉及的努力领域中的公知常识的一部分。

单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数方面，除非上下文另有明确规定。

术语“发明”包括如本文所述的所有方面、实施方式和实施例。

如本文所用，“约”是指量、值或参数可以变化多达所述量、值或参数的25％、20％、15％、10％、5％或1-2％，并且至少包括本领域内接受的公差。在列举的范围或值的列表的开头时，它旨在应用于范围的上限和下限以及列表中的每个成员。

除非上下文另有说明，下文描述的特征可以独立地应用于本发明的任何方面或实施方式。

如本文所用，肉类仿制食品(也称为肉类类似品、肉类代替品或肉类替代品)是指在、任何一种或多种物理或感官因素(包括关于外观、味道、质地、口感(湿度、咀嚼度、脂肪性等))、香气或其它物理特性(包括结构、质地、储存、处理和/或烹饪)上，以类似于动物衍生的肉类产品的方式模拟、类似或执行的含非动物蛋白的食品。在一些实施方式中，蛋白质可以是植物或真菌衍生的。在一些实施方式中，肉类仿制产品是植物基食品。

在一些实施方式中，肉类仿制食品包含非动物蛋白源，并且不含有或包括，或基本上不含有或包括(即小于约5％w/w，例如小于约4％w/w，或小于约3％w/w或小于约2％w/w或小于约1％w/w)源自或获得自动物源的任何成分。然而，应当理解，本公开不限于此，并且在其它实施方式中，肉类仿制食品或用于其中的成分可以包含一定比例的一种或多种动物衍生成分(包括蛋、酪蛋白、乳清、肌肉、脂肪、软骨和结缔组织、内脏或血液或其组分中的任何一种或多种)，例如以按食物成分或肉类仿制食品的重量计约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的量。这可能包括那些含有由干细胞培养基生长的细胞肉的肉类仿制产品。

如本文所用，“粉红色”或“红色”颜色，当用于与生的或未煮熟的肉类仿制食品有关时，是指在视觉上类似于相应的动物肉形式的粉红色或红色，包括：诸如对应于鸡肉猪肉、小牛肉或山羊肉的粉红色；诸如对应于鲑鱼肉的粉红色/橙色或红色/橙色；和诸如对应于羔羊肉、绵羊肉、牛肉或袋鼠肉的红色。

如本文所用，“颜色变化”，当用于肉类仿制产品的烹饪有关时，是指产品的粉红色/红色的视觉减少，以及反映一种或多种藻胆蛋白变性的白色、棕色或灰色的相应出现。

术语“烹饪”和“熟的”是指例如通过油炸、烘焙、烘烤、铁扒、炙烤、炒、烧烤、蒸、煨、煮、微波等施加热量。在一些有利的实施方式中，至少一种藻胆蛋白热变性，以使得在与动物肉中发生类似颜色转变的温度或温度范围大致对应的温度下，观察到颜色从粉红色或红色转变到白色、棕色或灰色。在一些实施方式中，将食品(例如肉类仿制品或替代品)烹饪至内部温度在约50-95℃，例如约55-90℃或约60-85℃的范围内。在一些进一步的实施方式中，将食品烹饪至内部温度在约60-65℃、或约65-70℃、或约70-75℃或约75-80℃范围内。在进一步的实施方式中，可以将食品烹饪至内部温度为约65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85℃。

单独或共同用于本公开的一种或多种藻胆蛋白为生的或未烹饪的肉类仿制食品提供粉红色或红色。有利地，至少一种或多种藻胆蛋白在视觉上是粉红色或红色的。因此，在上述的一些实施方式中，一种或多种藻胆蛋白包含至少藻红蛋白，藻红蛋白通常表现出λ

在进一步的实施方式中，一种或多种藻胆蛋白包括藻红蛋白并且可以进一步包括藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和藻红蓝蛋白中的一种或多种。因此，在一些实施方式中，一种或多种藻胆蛋白可以包括藻红蛋白和至少藻蓝蛋白。在一些实施方式中，一种或多种藻胆蛋白可以包括藻红蛋白和至少别藻蓝蛋白。在一些实施方式中，一种或多种藻胆蛋白可以包括藻红蛋白和至少藻红蓝蛋白。在一些进一步的实施例中，一种或多种藻胆蛋白可以包括藻红蛋白和至少两种其它的藻胆蛋白。因此，在其一些实施方式中，与任何其它藻胆蛋白或所有其它藻胆蛋白相比，藻红蛋白以主导量(基于w/w)存在，例如一种或多种藻胆蛋白包括至少50％，或至少55％，或至少60％，或至少65％，或至少70％，或至少75％，或至少80％，或至少85％，或至少90％，或至少95％，或至少96％、或至少97％、或至少98％、或至少99％或100％的藻红蛋白。

微(单细胞)藻类和大型(多细胞)藻类可以提供藻胆蛋白的方便来源。合适的来源可以是，例如：蓝藻(蓝藻纲)，诸如节旋藻属Arthrospira sp(螺旋藻属Spirulina sp))和鱼腥藻属(Anabaena sp)；红藻(红藻门-红藻纲)，诸如江蓠属(Gracilaria sp)和紫球藻属(Porphyridium sp)；和隐藻(隐藻纲)，诸如红胞藻属Rhodomonas sp(例如盐生红胞藻Rhodomonas salina)。藻胆蛋白，例如藻红蛋白的来源包括天然存在的或基因修饰的物种。藻胆蛋白，例如藻红蛋白也可以通过本领域已知的重组技术和方法获得。不能自然产生大量藻红蛋白的藻类仍然可以提供合适的藻红蛋白来源。例如，节旋藻属等物种可通过诱变和定向进化以及适当的生长条件，产生更多数量的藻红蛋白。

该至少一种或多种藻胆蛋白可以源自单一来源或多种来源的组合。作为一个实例，红色藻红蛋白可以从一种或多种红藻和/或蓝藻和/或隐藻来源获得，并且可选地与一种或多种其它相同或不同的从不同来源获得的藻胆蛋白组合。

由产生藻胆蛋白的生物，例如隐藻、蓝藻和/或红藻产生的藻胆蛋白的量和类型可以通过培养条件，例如营养素、碳源、pH、温度和暴露于不同的光条件来控制例如，增加所产生的藻胆蛋白的总量，和/或使一种或多种藻胆蛋白/生色团的产生相对于另一种偏斜。例如，藻红蛋白的产生可以通过在绿光下培养藻类来增加，而在一些实施方式中，在红光下培养产生更多的藻蓝蛋白。其方法在本领域中是已知的，例如如在一些上述参考文献中所述的，以及在Hsieh-Lo,M.,et al,Algal Research,42(2019)101600；Ferreira,R.,et al,Food Sci.Technol,Campinas 35(2):247-252,Abr.-Jun.2015；Oostlander,P.C.,et al,Algal Research,47(2020),10189；和Minh Thi Thuy Vu,et al,Journal of AppliedPhycology,28,1485-1500(2016)，以及其中引用的参考文献中所述的，这些文献的内容通过引用并入本文。

在一些实施方式中，藻类生物质富含或呈现高比例的所需藻胆蛋白，例如藻红蛋白。因此，在一些实施方式中，每1g干重的藻源生物质含有约5mg至约150mg的藻红蛋白，例如约5-50mg藻红蛋白。在进一步的实施例中，每1g干重的藻源生物质含有约10mg、或约15mg或约20mg、或约25mg或约30mg、或约35mg或约40mg、或约45mg或约50mg、或约55mg或约60mg，或约65mg或约70mg，或约75mg或约80mg，或约85mg或约90mg，或约95mg或约100mg，或约105mg或约110mg，或约115mg或约120mg，或约125mg或约130mg，或约135mg，或约140mg，或约145mg藻红蛋白。

藻类的藻红蛋白含量可以使用本领域已知的方法测定(参见例如，Gnatt E.,andLipschultz C.A.,Biochemistry,1974,13,2960-2966；Kursar T.A.,&Alberte R.S.,Plant Physiology,1983,72,409-414；Sobiechowska-Sasim,M.,et al,J Appl Phycol(2014)26:2065-2074；和Saluri M.,et al,Journal of Applied Phycology,32,1421-1428,2020)。在一些实施方式中，还可以使用Dagmar B.Stengel和Solène Connan(编)的“Natural Products From Marine Algae:Methods and Protocols,Methods inMolecular Biology,vol.1308”，斯普林科学商业媒体，纽约2015(Springer ScienceBusiness Media New York 2015)中，Justine Dumay、Michèle

一种或多种藻胆蛋白以提供所需颜色的任何量和组合被添加或存在于肉类仿制食品中，该所需颜色优选地为模拟相应的生的动物肉，例如牛肉、小牛肉、羔羊肉、猪肉、山羊肉、袋鼠肉、鱼肉(例如鲑鱼肉、鳟鱼肉、金枪鱼肉)和家禽肉(例如鸡肉、鸭肉、鹅肉、火鸡肉和猎鸟肉)的颜色的红色或粉红色。

在一个或多个实施方式中，将一种或多种藻胆蛋白以从藻类源获得的提取物或至少部分纯化的形式掺入肉类仿制食品中。

用于获得含藻胆蛋白的提取物，例如含藻红蛋白的提取物的一些示例性方法描述于RU2548111C1、CN101139587A、JP2017532060A、CN1796405A、CN101617784A、CN1618803A、CN101942014A、WO2003099039A，以及其中引用的参考文献中，这些文献的内容以引用的形式并入本文。

藻胆蛋白(例如藻红蛋白)的确切颜色取决于获得它的物种、蛋白质亚基的数量和性质，以及存在的发色团的数量和性质。额外的化合物，例如其它藻胆蛋白(例如别藻蓝蛋白和/或藻蓝蛋白)的存在或不存在也会影响整体视觉颜色。

用于制备本公开的着色剂的一种示例性通用方法包括在水性溶液(例如水或缓冲溶液)中均质化诸如红藻、蓝绿藻(蓝藻)或隐藻的含藻胆蛋白生物质的步骤。可选地，可以将含有提取的一种或多种藻胆蛋白的液体与固体材料分离。可选地，可浓缩和/或干燥经均质化的生物质或经分离的含藻胆蛋白的水性悬浮液或溶液。该方法可以包括进一步的可选步骤，例如经均质化的生物质的超声处理(声处理)以增强藻胆蛋白向水性相中的提取。

在一些优选的实施方式中，藻胆蛋白是通过至少一个提取或分离步骤从含藻胆蛋白的生物质例如隐藻、蓝藻(蓝绿藻)或大型或微型红藻(红藻门)中获得经提取的藻胆蛋白。

因此，在一些实施方式中，可以将至少一种藻胆蛋白以经浸渍的生物质的形式添加到食品(例如肉类仿制产品)中，例如其中合适的生物质，诸如蓝藻和/或红藻在水或水性溶液(例如在pH为约6.5至约7.5的范围内，例如pH为约6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3或7.4的缓冲溶液(例如磷酸钠或磷酸钾或乙酸钠或乙酸钾溶液))中被均质化，以使得藻胆蛋白被提取到水或水性溶液中。在一些实施方式中，所得的悬浮液或浆液(可选地已经用超声波进一步处理)可以直接添加到食品的成分，例如切碎的或绞碎的肉类仿制混合物/肉类替代混合物中。在进一步的实施方式中，均质化的浆液或悬浮液(可选地已经进一步用超声波处理)可以在添加到食品之前进一步浓缩或干燥。在这些实施方式的一些中，向食品中添加生物质固体材料可以有利地增加食品的营养价值和/或引入风味组分(例如，由于谷氨酸盐的存在而产生的鲜味)或风味前体(例如谷胱甘肽或其它氨基酸)，这有助于在肉类仿制品的后续烹饪过程中产生熟肉风味，直至最终风味概况(profile)。

在一些实施方式中，可以通过使用任何一种或多种合适的分离技术，例如筛分、离心、沉淀、过滤、超滤、微滤、纳滤、透滤、反渗透和色谱法来分离和去除一些或所有固体材料，将均质化的材料(可选地进一步通过超声处理)进一步纯化至所需纯度水平，以提供一种或多种藻胆蛋白的水性悬浮液或溶液。在添加到食品中之前，可选地，可以将所得溶液进一步浓缩至所需浓度。

在一些实施方式中，可以进一步对包含一种或多种藻胆蛋白的提取物溶液进行适当的分离步骤，例如透析或反渗透处理，以去除存在的任何金属和/或其它杂质。

在一个或多个实施方式中，可以对藻胆蛋白提取物悬浮液或溶液进行一个或多个冷冻步骤，例如在约-10℃或以下，例如约-15℃或以下，或约-20℃或以下，或-25℃或以下进行一个或多个冷冻步骤。

在一些进一步的实施方式中，可以通过任何合适的干燥技术，例如蒸发、冷冻干燥、喷雾干燥或超临界干燥，将包含一种或多种藻胆蛋白的水性溶液干燥以形成固体材料。在一些实施方式中，可以将至少一种藻胆蛋白以干燥形式或等于约0.5mg/g至约25mg/g，例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24mg/g的干重量添加至食品，例如肉类仿制品或肉类替代品。

可选地，可通过将液体加热到低于蛋白质变性和变色的温度，例如小于约80℃，或小于约77℃，或小于约75℃或小于约70℃的温度下对液体藻红蛋白提取物进行巴氏杀菌。

在一些实施方式中，一种或多种藻胆蛋白以藻类形式(例如红藻门的物种、蓝藻或隐藻)包含在食品中，并且可以以完整的藻类生物质，可选地为(例如通过一种或多种冻融循环和/或在均质器中)浸渍的完整的藻类生物质形式添加。在一些实施方式中，藻类是微藻。藻类可以排出和/或过滤以及湿用(例如以水/培养基中的糊剂、悬浮液或浆液的形式)，例如约0.1％w/w生物质，或约0.5％w/w生物质，或约1％w/w生物质，约5％w/w生物质，或约10％w/w生物质，或约20％w/w生物质，或约30％w/w生物质，或约40％w/w生物质，或约50％w/w生物质，或约60％w/w生物质，或约70％w/w生物质，或约80％w/w生物质或约85％w/w生物质，或约90％w/w生物质，或约95％w/w生物质，或更高)。藻类生物质可以直接使用，或者可选地在进一步使用之前可以被冷藏、冷冻和/或巴氏杀菌。在其它实施方式中，藻类生物质可以是干燥的(例如通过加热、蒸发或冷冻干燥来干燥)。

藻类生物质可以以适合赋予所需粉红色或红色的量添加到肉类仿制产品中。要添加的藻类生物质的量可以取决于藻类的藻红蛋白含量。在一些实施方式中，藻类生物质以不超过每重量肉类仿制产品约20％干重的量被添加。在一些实施方式中，藻类生物质可以以每重量食品约0.1％至约20％干重的范围加入到肉类仿制产品中，例如约0.1-5％，例如约0.1％、0.25％、0.5％、0.75％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％或14％或15％、或16％、或17％或18％或19％，以每重量食品的干重计。

有利地，在一些实施方式中，藻类生物质具有的藻红蛋白含量使得其可以以足够为肉类仿制食品提供所需的红色或粉红色着色但不赋予肉类仿制食品不利的海洋风味(主要是由于存在二甲基硫)的量使用。这可以通过感官评估来确定，感官评估可以由味道测试人员进行，比较具有和不具有藻胆蛋白成分的肉类仿制样品的味道。其合适的藻红蛋白含量可以在每1g干重5mg至约150mg藻红蛋白的范围内，例如约10-50mg，如上文所述。在一些进一步的实施方式中，藻类生物质是(单细胞)微藻。合适的实例可以包括：紫球藻属Porphoridium sp(例如P.purpureum)和P.sordidum)、红毛藻属Rhodochaete sp.(例如R.parvula)，胭脂藻属Hildenbrandia sp.(例如H.rivularis)，星丝藻属Erythrotrichiasp.(例如E.carnea)，Rhodella sp.(例如R.violacea)，红孢囊藻属(例如R.marinus)、节旋藻属Arthrospira sp(例如A.platensis钝顶节旋藻)、Fremyella sp.(例如F.diplosiphon)或红胞藻属Rhodomonas sp(例如R.salina)。一种优选的藻类来源是R.salina。在进一步的实施方式中，藻类是R.salina菌株CS-174。

藻类的物种和菌株可以从商业来源和培养物保藏中心(例如CSIRO澳大利亚国家藻类培养物保藏中心、UTEX培养物保藏中心、CCAC，德国；NIVA，挪威)获得。用于培养藻类(例如上述那些物种)的方法是本领域已知的。Oostlander,P.P.,et al,Algal Research,47,101889,2020；Minh Thi Thuy Vu,et al,Journal of Applied Phycology,28,1485-1500(2016)；Guevara,M.,J.Appl.Phycol.,28(5),2651-2660,2016以及其中引用的参考文献中描述了一些方法，它们的内容通过引用并入本文。

在一些实施方式中，可通过评估提取的或纯化的藻胆蛋白的UV/VIS吸收光谱，和/或确定藻红蛋白变性的温度，例如确定观察到λ

例如，藻胆蛋白提取物可以根据本文所述的任何一种方法或本领域已知的其它方法获得，并且获得其UV/VIS吸收光谱以及评估特征峰的存在，特征峰例如对于藻红蛋白，在540-570nm的λ

因此，可以通过对从藻类中获得的藻红蛋白的经提取的、分离的或至少部分纯化的样品的UV/VIS吸收光谱来确定藻类物种以至少部分经分离或纯化的藻红蛋白的来源使用，或以整体或浸渍形式使用以提供所需的红色或粉红色的适合性。

经提取或分离或至少部分纯化的形式的藻红蛋白可有利地表现出540-570nm处与495-503nm处的UV/可见吸收峰比值为至少1:1，例如至少1.5:1，或至少2.0:1，或至少2.5:1，或至少3:1，或至少4:1，或至少5:1，或至少6:1，或至少7:1，或至少8:1，或至少9:1，或至少10:1。在一些实施方式中，UV/VIS吸收光谱基本上仅显示在约540-570nm(对应于PEB)，例如在约550-565nm，和在约280-290nm(对应于蛋白质)处的最大峰/肩峰，因此反映了藻红蛋白样品中高含量的PEB。

用于本公开的至少一种藻胆蛋白(例如藻红蛋白)(以提取物或至少部分纯化的形式，或以完整或浸渍的藻类形式添加到肉类仿制产品中)的适合性可以通过评估在加热时λ

已表明藻胆蛋白与金属离子如Fe

因此，在一些实施方式中，根据本公开使用的一种或多种藻胆蛋白也可以作为金属离子例如Fe

在一些实施方式中，铁以其2+氧化态(例如以氯化亚铁(FeCl

铁化合物可以与一种或多种藻胆蛋白一起使用，其中Fe与藻胆蛋白的摩尔比为约1:10至约3:1，例如约1:5、1:2、1:1.5，1:1、1.5:1或2:1。在进一步的实施方式中，Fe:PE的摩尔比为约1:10至约3:1，例如约1:5、1:2、1:1.5、1:1、1.5:1或2:1。

在一些实施方式中，至少一种藻胆蛋白着色剂还可以与一种或多种其它着色剂联合使用，或者单独地添加到食品中，或者与一种或多种藻胆蛋白组合以形成着色剂的混合物，并且然后添加到食品中。在一些实施方式中，一种或多种其它着色剂不包括含有环状四吡咯(和类吡咯)部分的试剂，例如卟啉、二氢卟吩、卟吩(bacteriochlorins)、咔咯(corroles)和咕啉(corrins)，以及它们的金属络合物，例如原卟啉IX和血红素，以及它们的蛋白质结合物。在一些实施方式中，生的和/或熟的形式的肉类仿制食品不包括这种单独添加的含环状四吡咯的化合物。应当理解，以藻类形式添加的藻胆蛋白将含有天然的或内源性的环状叶绿素，并且上述某些实施方式不应被解释为排除内源性的及固有地存在于衍生藻红蛋白的藻类中的环状四吡咯和类吡咯部分的存在。

在一些实施方式中，用于肉类仿制产品的着色剂由或基本上由一种或多种藻胆蛋白组成。在一些实施方式中，着色剂由或基本上由藻红蛋白组成。

在一些实施方式中，一种或多种额外的着色剂是非动物和非煤/焦油衍生的，因此适用于素食或纯素食消费者。适当的颜色可以包括红色、洋红色、紫色/紫罗兰色、橙色、黄色、棕色、蓝色和绿色中的一种或多种。一些示例性的植物衍生的着色剂可以包括花青素、甜菜碱、类胡萝卜素、类黄酮和多酚。在一些实施方式中，此类着色剂可以以源自植物例如浆果、葡萄、甜菜根、白萝卜、姜黄和胡萝卜的汁液、浓缩物、提取物或干粉形式添加。其它额外的着色剂可能包括棕色，例如浅褐色/焦糖色。

肉类仿制食品可以包括一种或多种非动物蛋白源，例如大豆蛋白(例如组织大豆蛋白、大豆分离蛋白)、豌豆蛋白、蚕豆蛋白、羽扇豆蛋白、绿豆蛋白、豆科植物(例如豌豆、豆类(例如黑豆、芸豆、白腰豆(cannellini)、斑豆、绿豆)、羽扇豆、鹰嘴豆、扁豆)、坚果、种子、蘑菇和其他真菌来源(例如镰孢霉(Fusarium venenatum))，以及藻类和微生物来源；一种或多种碳水化合物源，例如糖，包括单糖和二糖(例如葡萄糖、果糖、阿拉伯糖、核糖、麦芽糖蔗糖、葡萄糖麦芽糊精、木糖、乳糖、阿拉伯糖)、寡糖、多糖、淀粉、树胶、角叉菜胶、果胶、和纤维；一种或多种脂肪和油(例如植物衍生的油，例如芥花籽油、向日葵油、橄榄油、椰子油、蔬菜油、棕榈油、花生油、亚麻籽油、棉籽油、玉米油、红花油(safflower)、米糠油)、乳化剂(例如卵磷脂、聚山梨醇酯(20、40、60、80))；粘合剂和增稠剂(例如树胶(例如藻胶、瓜尔胶、刺槐豆胶和黄原胶)、果胶、纤维素(例如甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉、马铃薯片、马铃薯粉、由磨碎的或绞碎的谷物和豆类(小麦、大米、黑麦燕麦、大麦、荞麦、玉米、羽扇豆、鹰嘴豆、小扁豆、黄豆等)制成的面粉)、抗氧化剂、表面活性剂、盐和营养剂，例如氨基酸(例如必需氨基酸(例如组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、脯氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸)、二肽和三肽)、维生素(例如A、B(1、2、3、5、6、7、9和12)、C、D、E、K)、矿物质(钙、磷、镁、钠、钾、锌、碘、铁、铜)和植物营养素(例如类胡萝卜素(例如α-和β-胡萝卜素、β-隐黄质、番茄红素、叶黄素)、类黄酮(例如黄烷醇、黄酮醇黄酮、二氢黄酮(flavonones)、异黄酮)、多酚(例如花青素、槲皮素、鞣花酸))；调味剂，例如香草、香料(例如欧芹、迷迭香、百里香、罗勒、鼠尾草、薄荷)、香精(例如芹菜、洋葱、大蒜)、酵母提取物、麦芽提取物、天然和人造甜味剂、烟熏香精、氨基酸(例如谷氨酸钠)、核苷、核苷酸和水。一种或多种成分可以发挥一种或多种功能。

铁(Fe)可催化一种或多种风味前体分子的化学反应以产生可赋予所需风味和/或香气，例如肉味、咸味或鲜味(例如牛肉、鸡肉、猪肉、培根、火腿、羊肉)的调味剂。因此，在烹饪过程中发生变性时，在肉类仿制食品中，与Fe(Fe

风味前体分子的一些实施例(除了上面列出的任一额外成分)可以包括：糖、糖醇、糖酸和衍生物(例如葡萄糖、果糖、核糖、蔗糖阿拉伯糖、肌醇(inistol)、麦芽糖、麦芽糊精、半乳糖、乳糖、葡萄糖醛酸和木糖)；油，例如菜籽油、向日葵油、橄榄油、椰子油、蔬菜油、棕榈油、花生油、亚麻籽油、棉籽油、玉米油、红花油、米糠油；脂肪酸，例如辛酸、癸酸、月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸；氨基酸，例如半胱氨酸、胱氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、精氨酸、组氨酸、丙氨酸、谷氨酸、天冬酰胺酸(asparganine)、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和酪氨酸，以及二肽和三肽，例如谷胱甘肽；核苷和核苷酸，以及维生素。

在一些实施方式中，藻胆蛋白着色剂可用于制备肉类仿制食品，例如绞碎的或切碎的肉制品，例如汉堡肉饼、烤肉串、肉丸、炸肉饼、肉糕、香肠、肉酱和馅料(例如辣椒、肉酱、塔可馅料、馅饼馅料)和其他成形的或具有形状的肉制品(可选地为碎的)，例如鸡块、牛排、炸肉片、炸肉排、肋条和肉条。在一些进一步的实施方式中，食品着色剂可用于制备汉堡肉饼。在一些实施方式中，肉类仿制食品不含或基本上不含一种或多种引起过敏或不耐受反应的试剂，例如味精、麸质或坚果。

现在将通过参考以下实施例进一步描述本公开，这些实施例仅用于说明的目的，而不应被解释为限制上述的普遍性。

实施例

初步评估-血红蛋白和肌红蛋白对汉堡的味道和外观的影响。

血红蛋白和肌红蛋白购自Sigma Aldrich。汉堡配方包含约20％的组织大豆蛋白、约15％的植物脂肪(总配方重量的5％是椰子脂肪)、约2.5％的纤维、约5％的调味剂(包括氨基酸)和约57.5％的水。

使用200mg/100g汉堡配方的浓度，将血红蛋白和肌红蛋白单独地添加到带有调味剂的汉堡配方中，并与未添加血红蛋白或肌红蛋白的汉堡进行比较。未添加血红蛋白或肌红蛋白的生汉堡呈浅棕色/米色，而其他两个汉堡在生的状态下外观呈红色/棕色。

烹饪后，内部的描述性感官分析和通过气相色谱的风味分析表明，汉堡在评估的几乎所有方面都基本相同(例如烧焦的外观、烤牛肉(beef)的气味、烟熏烧焦的余味、表面和内部质地、脂肪口感、牛肉余味、豆味/植物味、咸味、鲜味、金属味/血味和整体肉型(beefiness)，以及硫挥发物、醛和吡嗪的存在)。汉堡之间观察到的主要差异在于烤牛肉外观和内部红色/血色外观方面，没有添加血红蛋白或肌红蛋白的汉堡在这些方面比其他两个得分显著降低，从而证明血红蛋白和肌红蛋白负责汉堡的粉红色/红色(即“血色”)外观，但对风味概况/感官分析没有显著影响。

从野生红海藻中获得和提取藻红蛋白

2019年3月11日，在38°16'19.8"S 144°38'27.3"E的维多利亚州贝拉林半岛(Bellarine Peninsula,Victoria)收集了六种红色大型藻类。

藻红蛋白的提取包括在缓冲液中混合藻类和离心以去除大颗粒的步骤：

提取缓冲液：20mM的磷酸钠，pH 7，0.02％的叠氮化钠。

1)称取10g红藻加入到100mL提取缓冲液中。

2)使用Ultra-turrex以均质化样品并倾倒通过筛子。

3)使用F21x50Y固定角转子在Beckman Coulter Sorvall RC-5中以15000RPM速度在4度下运行15分钟进行澄清。

4)使用PES进行浓缩，20mL10kDa截止。

5)用蒸馏水透析以去除金属/污染物。

6)冷冻干燥。

初始均质化的红海藻产生红色/橙色液体。通过离心澄清后，溶液变得明显更荧光粉红色，这在浓缩时更加明显。冷冻干燥产生较深的粉红色材料。

R-藻红蛋白的热表征

进行热表征以确定藻红蛋白在加热时是否具有颜色变化。首先，在澄清之前，将粗制的均质化的藻红蛋白在95℃加热5分钟并观察颜色变化。粗制样品从红色变为棕色。

在60℃和70℃加热1小时后，样品均稳定且无颜色变化。因此，为了精确测量藻红蛋白的热变性温度，以0.5℃/10秒的速度提高温度，将100uL澄清的藻红蛋白从25℃加热至95℃来进行差示扫描荧光法(DSF)。

如图1所示，藻红蛋白失去其荧光并因此发生颜色转变的热变性温度为77℃。

超声波提取试验

为了提高藻红蛋白提取的产率，对超声提取进行了研究。超声波通常用于提高细菌和酵母细胞中蛋白质的回收率。由于藻类细胞的坚韧性质，超声波用于提高藻红蛋白的回收率。提取遵循以下方案：

1)称取25g红藻(样品1)加入到150mL提取缓冲液中。

2)在8000(min

3)在160W下超声处理，3.3s开，9.9s关，总处理时间＝5min。

4)使用F21x50Y固定角转子在Beckman Coulter Sorvall RC-5中以15000RPM速度在4℃下运行15分钟进行澄清。

5)使用PES进行浓缩，20mL10kDa截止。

6)用10L蒸馏水透析4小时。

7)在80℃下冷冻。

8)冷冻干燥3天。

在澄清和浓缩后，所得样品的颜色比提取之前时观察到的荧光粉红色要更加血红。

为了研究为什么超声提取的溶液颜色是血红色而不是荧光粉红色，进行了吸收光谱分析以研究差异。除了在大约495nm、545nm、565nm处的特征性藻红蛋白峰外，使用超声处理步骤获得的提取物在675nm处出现了一个额外的突出峰，在625nm处出现了一个小峰，这分别为别藻蓝蛋白(带蓝色的/绿色)和R-藻蓝蛋白(蓝色)的表现。将亮粉色/红色藻胆蛋白(例如藻红蛋白)与一种或多种绿色/蓝色藻胆蛋白(例如别藻蓝蛋白、藻蓝蛋白)混合可产生血红色的提取物。

适合用作食品成分的藻红蛋白提取物的制造

为了模拟用于从红色大型海藻中获得藻红蛋白的简单、可扩展的食品级提取方法，应用了使用实施例1中设计的实验室规模方法的改进方法：

1-在自来水中配制食品级200mM的NaCl提取缓冲液。

2-称取25g海藻加入到150mL的提取水中。

3-在厨房手持搅拌机中搅拌2分钟。

4-在160W下超声，3.3s开，9.9s关，总处理时间＝5min。

5-在4.2r摆动转子中以5000g离心澄清。

6-倒入筛子以除去任何大的海藻颗粒。

7-在-20℃下冷冻。

8-冷冻干燥3天和/或直至水全部去除。

观察到液体提取物颜色强度的变化，尽管都是红色/粉红色。一旦通过离心和过滤使海藻提取物澄清，然后将它们冷冻干燥成粉末。

在模型绞碎的(ground)肉产品中使用藻红蛋白提取物。

使用与上述的初步评估中使用的相同配方制成迷你汉堡，每个汉堡总重15g。将着色剂(甜菜根、藻红蛋白、血红蛋白或铁蛋白)和冷冻的切碎的椰子脂肪(5％w/w)添加到其余成分中并混合。

配方列于表2-1。

表2-1

将表2-1中的汉堡配方在电炉(Silex

对照组汉堡在生的时候外观呈白黄色，烹饪后外观呈棕色(由于美拉德反应和焦糖化)，但烹饪并没有改变汉堡的内部颜色，内部颜色保持了与生的产品相同的白黄色。甜菜根提取物使生的汉堡和熟的汉堡都呈现红色外观，但烹饪并没有改变汉堡的内部颜色。藻红蛋白提取物导致生的产品呈现“血”色(粉红色/红色)外观，随后在烹饪后内部颜色变为棕色。在烹饪过程中，汉堡表面上的红色液体的积聚模仿了在烹饪诸如牛肉(beef)等动物肉时通常观察到的“出血”。Vitafit血红蛋白使汉堡外观在生的时呈深棕色，在被烹饪时接近黑色。含CR铁蛋白的汉堡在外观上与对照组汉堡(生的和熟的)相同。

藻红蛋白提取物的升级和表征

为了模拟一种用于从野生红色大型海藻(先前在该项目的第一阶段收集的)中获取藻红蛋白的简单、可扩展的食品级提取方法，应用了使用第一阶段中设计的实验室规模方法的改进方法：

1-在自来水中配制食品级20mM磷酸钠，pH 7.0的提取缓冲液。

2-称取1000g海藻加入到5000mL提取缓冲液中。

3-在8000(min

4-使用F21x50Y固定角转子在Beckman Coulter Sorvall RC-5中以10000RPM速度在4℃下运行15分钟进行澄清。

5-倒入筛子以除去任何大的海藻颗粒。

6-使用SM-PES 20000Da MWCO Synder超滤膜浓缩3.3倍(3.3X)，然后使用7倍(7X)超纯水(MilliQ water)渗滤以去除残余的海藻气味。

7-在-20℃下冷冻。

8-冷冻干燥3天和/或直至水全部去除。

用于此过程的野生红海藻于2019年12月31日在澳大利亚维多利亚州的德罗马纳海滩收集。分析超滤前后样品的吸收光谱显示了藻红蛋白的特征峰，并表明过滤过程浓缩了对应于280nm处的蛋白质峰的藻红蛋白。在SDS-PAGE凝胶上运行(running)这些样品也只显示一条蛋白质带，表明样品中藻红蛋白是纯的。

将升级的藻红蛋白提取物在95℃加热6分钟，观察到颜色从亮粉色变为棕色。两个样品的吸收光谱表明，加热后藻红蛋白的特征峰大大减小，峰变宽，表明颜色变化是由于藻红蛋白的蛋白质结构发生变化(见图2)。

多种藻红蛋白提取物的表征和对比

使用上述实施例1中描述的方法从以下藻类物种中提取R-藻红蛋白。

-(a)紫球藻(Porphyridium purpureum，菌株：CS-25，悉尼科技大学)

-(b)海门冬(Asparagopsis taxiformis，CH4Global)

-(c)柏桉藻(Bonnemaisonia hamifera，CH4Global)

-(d)沙滩上收集的野生海藻样品。

记录每个藻红蛋白样品的UV吸收光谱。结果如图3所示。注意的是对于(b)-(d)中的每个样品，在约495-500nm处观察到一个峰，这与和藻红蛋白结合的藻胆素发色团一致，但该峰基本上不存在于样品(a)。观察到的该差异反映了自然界中发现的亚型，这取决于构成藻红蛋白的蛋白质亚基的数量、排列和类型。

热变性

对每个藻红蛋白样品(a)-(d)进行热变性。结果如图4所示。

从视觉上看，所有藻红蛋白样品在加热到95℃时都显示出颜色损失。然而，与其他相比，从紫球藻中提取的藻红蛋白保留了更多的颜色。这很可能是由于在紫球藻中发现的特定亚型的藻红蛋白。

由培养物中生长的微藻制造适合用作食品成分的藻红蛋白提取物

为了模拟一种用于从培养基中生长的红微藻(CS-174盐生红胞藻(Rhodomonassalina)，(悉尼科技大学))的生物质中获取藻红蛋白的简单、可扩展的食品级提取方法，应用了实施例2中设计的基于使用实验室规模方法的改进方法。

1、解冻冷冻的生物质(干重*藻类含量＝50mg/g湿生物质)

2、以每克(湿重)生物质2.75mL水的比例将水添加到培养基生物质中。

3、混合1分钟，10000rpm(Ultra-turrax，T8型，IKA/Janke&Kunel GmbH德国)。

4、离心澄清：5分钟，4000g(Beckman J6-MI离心机，JS4.2转子)。

5、倒出澄清的上清液作为粗液提取物。

6、通过离心澄清粗提取物：15分钟，10000RPM，4℃。(Sorvall RC-5离心机，F21x500Y转子)。

7、将澄清的上清液倒出作为水性食品级藻红蛋白提取物。

*关于干重基是指去除所有水的藻类

通过UV/光谱法表征来自培养基中生长的微藻的藻红蛋白提取物

为了确定特定提取物是否适合用作热敏食品着色剂以及提取物的相对纯度，可以使用常见的实验室设备获得提取物的UV/可见光谱。感兴趣的化合物的热敏性可以通过测量提取物对关键波长的热的响应来获得。为了确认颜色概况(profile)的变化，在加热提取物后可以获得进一步的UV/可见光谱。

提取物的UV/可见光谱的识别。

1、将液体提取物用水稀释制成测试溶液，以得到仪器工作范围内的读数。在这种情况下，1/10稀释就足够了。

2、准备UV光谱仪(UV-1700Shimadzu澳大利亚)以测量波长扫描，测量特性如下。

a.波长范围(nm)：270.00至700.00

b.扫描速度：中

c.采样间隔：1.0s

d.自动采样间隔：禁用

e.扫描模式：单波长范围

3、运行扫描并收集数据

4、准备UV光谱仪(UV-1700Shimadzu澳大利亚)以测量在步骤3中识别的感兴趣波长的波长扫描，测量特性如下。

5、运行扫描并收集数据

6、使用第2步中使用的设置重新运行波长扫描

7、运行扫描并收集数据

实施例6中描述的提取物获得的数据示于图7(UV/VIS吸收光谱)和图8(温度扫描)中。提取物在大约550mn处显示出一个主峰，这是藻红蛋白的特征。λ

在550nm的温度扫描表明在大约63℃时吸光度损失50％，总颜色损失约为初始的20％。当经加热的提取物在波长扫描中重新运行时，会出现一个小的残留峰。

从培养基中生长的微藻提取的“食品级”藻红蛋白提取物在肉类仿制食品中的应用：模拟鸡肉等白肉产品和牛肉等红肉产品的汉堡肉饼。

来自实施例6的水性藻红蛋白提取物用于配制模拟红肉和白肉产品的性质的汉堡肉饼。使用下表8-1所示的配方：

表7-1

白肉仿制品显示出适合作为生的产品的白肉的颜色。在68至70℃的温度范围内观察到从生的产品到熟的产品转变的颜色变化特征。感官评价未发现不利的风味影响，配方被判断为是适合使用的。

对于红肉仿制品汉堡，通过额外加入焦糖和调整水性藻红蛋白提取物比例的水平，获得了合适的生牛肉颜色。在68至70℃的温度范围内观察到从生的产品到熟的产品转变的颜色变化特征。感官评价未发现不利的风味影响，配方被判断为是适合使用的。

来自培养基中生长的微藻的整个生物质在肉类仿制食品中的应用：模拟白肉产品(例如鸡肉)和红肉产品(例如牛肉)的汉堡肉饼。

整个(解冻的冷冻)微藻(CS-174盐生红胞藻(Rhodomonas salina)，(悉尼科技大学))用于配制模拟红肉产品特性的汉堡肉饼，使用下表8-1中所示的配方：

表8-1

红肉仿制品表现出作为生的产品的适当颜色。

在市售电炉上烹饪汉堡肉饼。使用探针温度计监测内部温度并目测观察颜色变化。

在68至70℃的温度范围内观察到从生的产品到熟的产品转变的颜色变化特征。感官评价表明鲜味风味略有增强，并且没有不利的海洋风味污染。

通过纯化的藻红蛋白红海藻提取物结合铁

将来自实施例1的藻红蛋白提取物(提取包括超声处理)以2mg/mL的浓度溶解在pH为7的含有0.02％的叠氮化钠的20mM磷酸钠缓冲液中。氯化铁(II)以100mM的初始浓度溶解在相同的缓冲液中。溶解的藻红蛋白提取物与一系列浓度的氯化铁按1:1混合，以提供最终蛋白质浓度为1mg/mL，最终氯化铁浓度为0、0.25、0.5、1、2、4、8、16和32mM。

然后使用赛默飞多功能酶标仪(Thermofisher Varioskan Flash)(仪器版本4.00.52)对所有样品进行515-700nm的荧光发射扫描，荧光发射扫描使用的激发波长为498nm。R-藻红蛋白的最大发射波长为575nm，因此如果铁与蛋白质的直链四吡咯部分发生结合，则会观察到荧光的变化。图7显示了荧光铁结合结果。可以看出，随着铁浓度的增加，藻红蛋白荧光降低，表明铁与蛋白质的支链四吡咯结合，并且藻红蛋白可以与铁配位，因此是铁载体蛋白。

与藻红蛋白结合的铁的生物利用度的评估。

使用已建立的人类肠道模型-Caco-2/HT29-MTX-E12侵袭小室(transwell)模型评估与藻红蛋白结合的铁的生物利用度。通过人铁蛋白的形成来测量结合和没有结合藻红蛋白的铁的肠道吸收。

测试方案

氯化铁(II)(氯化亚铁，FeCl

氯化铁(III)(三氯化铁，FeCl

硫酸铁(II)(硫酸亚铁，FeSO

藻红蛋白

方法

生长在半透膜上的人类Caco-2(肠细胞)和HT29-MTX-E12(杯状)细胞构成肠道屏障模型。由于体内肠道屏障包含几种不同的细胞类型，因此生长了共培养物而不是单个细胞系。为了确保肠道屏障模型中的任何处理效果与细胞毒性无关，测量了响应猕猴桃食糜(kiwifruit digesta)的Caco-2/HT29-MTX-E12细胞活力。

测量响应所有样品的Caco-2/HT29-MTX-E12细胞活力以确定肠道屏障模型的治疗浓度。使用非细胞毒性样品浓度可确保肠细胞测定中的任何处理效果与细胞毒性无关。使用CyQUANT细胞增殖测定法测量细胞活力以评估细胞活力，如下所述：

·将9×10

·7天后，去除生长介质(DMEM，10％胎牛血清)，并使用Hank平衡盐溶液(HBSS)缓冲液来(通过机器人)洗涤细胞。

·项目样品在HBSS中制备，并使用多通道移液器添加到细胞中。细胞在37℃和5％的CO

·16-18小时后去除处理物并用HBSS洗涤，然后将稀释在HBSS缓冲液中的CyQUANT试剂应用于细胞(使用机器)。

·一小时后，在485nm激发波长和530nm发射波长下测量荧光。

生长在半透膜上的人类Caco-2(肠细胞)和HT29-MTX-E12(杯状)细胞构成肠道屏障模型。共培养物在侵袭小室上生长，如下所述：

·Caco-2细胞和HT29-MTX-E12细胞烧瓶在约90％融合时传代。

·使用血细胞计数器(或库尔特计数器)对细胞进行计数以确定每mL的细胞数。

·将0.6mL生长介质(无细胞)添加到侵袭小室的基底外侧腔中。

·将0.2mL的Caco-2/HT29-MTX-E12细胞溶液小心地添加到顶端腔中，以获得3.6×10

·共培养物在侵袭小室上生长21天，每2-3天更换一次介质。

·在21天时，使用Millicell伏特计从顶端到基底外侧腔测量跨上皮电阻(或TEER)(图1)。这些测量表明细胞层的完整性，确保细胞被极化并且完整的屏障已准备好进行实验。所有TEER测量值均高于280Ω.cm

·在实施样品处理之前，在第21天测量所有跨上皮电阻(TEER)读数并记录。

·铁样品和藻红蛋白在HBSS中以非细胞毒性浓度制备。

·将生长介质从细胞中除去并替换(replace)为HBSS 2小时以耗尽细胞中的胎牛血清(存在于生长介质中)。

·将HBSS去除并替换为样品处理物2小时。

去除处理物、替换为HBSS，并孵育过夜。

·16-18小时后，用PBS清洗细胞(顶端侧)，然后使用胰蛋白酶从侵袭小室膜上去除细胞。

·通过离心5分钟来收集细胞。

·根据制造商的说明进行Abcam铁蛋白测定。

使用非配对t测试分析来自铁蛋白测定的结果的明显差异。当P<0.05时，差异被认为是明显的。所有统计分析均使用GraphPad Prism5软件进行。

结果

测量响应含有和不含有8mg/mL的藻红蛋白的铁溶液的细胞活性。具有8mg/mL藻红蛋白的100、50和25mm铁溶液表现出超过80％的细胞活性，并在肠道模型中进行了测试。

所有样品处理均在80μM抗坏血酸存在下进行。先前涉及肠道细胞模型中铁蛋白形成的研究使用抗坏血酸来改善肠道对铁的吸收(Mahler et al.Characterization ofCaco-2and HT29-MTX cocultures in an in vitro digestion/cell culture modelused to predict iron bioavailability,Journal of Nutritional Biochemistry；20:494-502,2009.)以及模拟通常在人类中存在的抗坏血酸盐(50和100μM)的生物水平(Badu-Boateng,C.and Naftalin,R.J.Ascorbate and ferritin interactions:Consequencesfor iron release in vitro and in vivo and implications for inflammation,FreeRadic Biol Med.,133:75-87,2019)。

尽管与用铁溶液、抗坏血酸和藻红蛋白处理的细胞相比，用100μM铁溶液和抗坏血酸处理的细胞之间没有观察到明显差异，但在没有铁的情况下，与所有其他铁溶液相比，藻红蛋白加抗坏血酸产生相似的铁蛋白产生。这可能是铁的初始处理浓度(100μM)和藻红蛋白的初始处理浓度(8mg/mL)太高而无法观察到这两种成分之间的协同作用。

用25μM或50μM铁溶液和4mg/mL或8mg/mL藻红蛋白处理细胞。结果列于表10-1。

表1.在用不含藻红蛋白和含有藻红蛋白的不同铁溶液处理的侵袭小室(transwell)膜上生长的Caco-2/HT29-MTX-E12细胞中铁蛋白的产生。

注意：*表示与用铁溶液和4mg/mL或8mg/mL藻红蛋白溶液处理的细胞相比，用铁溶液处理的细胞之间存在明显差异。#表示与用4mg/mL藻红蛋白溶液处理的细胞相比，用铁溶液处理的细胞之间存在明显差异。^表示与用8mg/mL藻红蛋白溶液处理的细胞相比，用氯化铁(III)溶液处理的细胞之间存在明显差异。使用非配对t测试(GraphPad Prism 5)确定统计差异。

与仅用氯化铁或硫酸亚铁处理的细胞相比，用4mg/mL藻红蛋白和50μM氯化铁或硫酸亚铁共同处理细胞，明显提高了铁蛋白的产生。在硫酸亚铁存在下，与8mg/mL藻红蛋白共同处理明显增加了铁蛋白的产生。

与仅用不同铁溶液处理的细胞相比，用4mg/mL或8mg/mL藻红蛋白和25μM氯化亚铁、氯化铁或硫酸亚铁共同处理细胞，明显提高了铁蛋白的产生。与铁溶液处理相比，仅用4mg/mL藻红蛋白(即不添加铁)的处理也明显增加了铁蛋白的产生。类似地，仅用8mg/mL藻红蛋白(即不添加铁)的处理明显增加了铁蛋白，但仅与氯化铁处理相比。

藻红蛋白在体外可以提高铁的生物利用度并促进铁蛋白的产生。在食品中包含藻红蛋白可以提高肠道对铁的吸收和铁蛋白的产生，尤其是与较低水平的铁结合时。

定量生物质中R-PE含量的示例性方法

方法改编自书籍章节：Dagmar B.Stengel和Solène Connan(编)的“NaturalProducts From Marine Algae:Methods and Protocols,Methods in MolecularBiology,vol.1308”，斯普林科学商业媒体，纽约2015(Springer Science Business MediaNew York 2015)中，Justine Dumay、Michèle

以下方法举例说明了基于495和565nm处的吸收峰的计算，然而，应当理解的是，可以对PE样品进行相应的计算，证明在495-503nm(例如，495、496、497、498、499、500、501、502或503nm)和540-570nm(例如，约540、545、550555、560、565、570nm)范围内有相应的峰。

1、准确称取大约1g生物质加入到10mL带刻度的离心管中

2、加入去离子水至约5mL

3、用高剪切混合器(UltraTurrax T8速度6)均质化30秒，同时保持管冷(冰浴)

4、用去离子水定容至10mL刻度

5、在4度下搅拌30分钟

6、在4度下离心20分钟，4000g

7、将上清液倒入25mL容量瓶中

8、向沉淀中加入去离子水至约5mL

9、用高剪切混合器(Ultra Turrax T8速度6)均质化30秒，同时保持管冷(冰浴)

10、用去离子水定容至10mL刻度

11、在4度下搅拌30分钟

12、在4度下离心20分钟，4000g

13、将上清液与25mL容量瓶中的第一次提取物混合

14、用去离子水定容至25mL

15、测量350和750nm之间的吸光度值。

藻红蛋白含量(mg/mL)可根据Beer和Eshel方程估算(Beer S.,and Eshel A.,(1985)Determining phycoerythrin and phycocyanin concentrations in aqueouscrude extracts of red algae.Aust J Mar Freshw Res 36:785–793):

PE＝[(A