一种提升高温熟榨菜籽粕营养价值的方法及应用

技术领域

本发明涉及优质饲用蛋白质资源开发技术领域，具体涉及一种提升高温熟榨菜籽粕营养价值的方法及应用。

背景技术

优质蛋白质饲料资源紧缺是制约我国畜牧业可持续发展的瓶颈问题之一，开发优质蛋白质饲料原料已成为我国政府、饲料行业和科研院所共同关注的热点领域。菜籽粕是菜籽油生产过程中的副产物，我国年产量1100万吨左右，其粗蛋白含量35％-45％，氨基酸组成较均衡，是一种潜在的优质蛋白质原料。但因其抗营养因子含量和不同榨油工艺来源菜籽粕消化率的差异大，制约着菜籽粕在动物饲料中的高比例使用。

我国油菜籽的榨油加工方式主要包括冷榨、熟榨(热榨)和预压-浸提三种方式，其中熟榨是将油菜籽经过高温(不低于135℃)炒籽后，再使用螺旋压榨机或液压机进行压榨出油，该方法得到的菜籽油称为浓香型菜籽油，因其独特浓郁的香味深受消费者喜爱。据统计，大型榨油工厂生产的浓香型菜籽油产量占全国菜籽油市场近30％的份额。此外，在云贵川渝鄂等主要的油菜籽产区存在大量的小型菜籽油生产作坊，主要生产高温压榨菜籽油。因此，我国高温熟榨菜籽粕资源丰富。但是，与冷榨和预压-浸提制菜籽油的副产物菜籽粕相比，熟榨菜籽粕因油菜籽在炒籽过程中的高温处理，发生美拉德反应等，导致其品质较差，在畜禽饲粮中使用比例较小，甚至当作有机肥使用，并未实现菜籽粕资源的饲料化高效利用。具体分析制约高温熟榨菜籽粕饲料化使用的因素主要包括三个方面：(1)纤维含量高，油菜籽颗粒小，壳在菜籽粕中的比重大，导致纤维含量高；同时，油菜籽加工榨油过程中的高温炒籽会产生美拉德反应，致使菜籽粕中部分蛋白质发生变性以中性洗涤纤维(NDF)的形式存在，使得NDF含量增加到50％左右，是豆粕的3倍，显著降低了菜籽粕的有效能值和蛋白质及氨基酸消化利用率。(2)抗营养因子硫苷含量高，其不仅影响适口性，而且代谢产物如噁唑烷硫酮、异硫氰酸酯、腈类对动物的甲状腺、肝脏、肾脏等具有强毒性。(3)菜籽粕蛋白的结构复杂，抵抗蛋白酶的水解导致自身消化率低。因此，寻求有效方法对高温熟榨菜籽粕进行改造，提高其养分消化利用率、降低抗营养因子含量，使改造产物成为一种优质蛋白源，可有助于缓解我国优质饲料蛋白源紧缺现状。

微生物发酵是当前饲料原料改造常用的一种方法。关于菜籽粕发酵已有不少研究，但是尚无专门针对高温熟榨菜籽油加工副产物菜籽粕改造的报道。在已有发酵菜籽粕研究中，多数是以预压-浸提和冷榨产物为底物，虽然在抗营养因子硫苷的降解方面取得了较理想的效果，但是在复杂大分子蛋白转化成小分子肽方面程度较低，同时纤维的降解程度也不够理想，导致这些发酵菜籽粕产品还达不到优质蛋白原料的水平。同时，将已报道的菜籽粕改造工艺参数用于高温熟榨菜菜籽粕处理，改造效果差，不适用。因此，需要研制一种工艺以高温熟榨产物为底物，既能降解硫苷和纤维，又能降解大分子蛋白提高酸溶蛋白含量，进而全面改善高温熟榨菜籽粕品质，增加其在畜禽日粮中的使用量。

发明内容

本发明的目的是提供一种提升高温熟榨菜籽粕营养价值的方法及应用，相比高温熟榨菜籽粕常规发酵效果差，本技术方案能明显降低菜籽粕中硫苷和纤维含量，提高酸溶蛋白的含量，提高了高温熟榨菜籽粕的营养品质和利用率，在优质饲料资源开发中具有重要意义。

为了达到上述目的，本发明提供了一种提升高温熟榨菜籽粕营养价值的方法，包含如下步骤：

步骤1：将高温熟榨菜籽粕与水按质量比2:1混合均匀，121℃灭菌处理；

步骤2：调节步骤1中灭菌所得菜籽粕的pH至6.5-7.0，制得菜籽粕发酵底物；

步骤3：制备菌酶混合液，并将其接种至步骤2中所得的发酵底物中进行固态发酵；

步骤4：发酵结束后，将发酵产物烘干至恒重即得发酵菜籽粕成品；

其中，该菌酶混合液是由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母和纤维素酶制得。

进一步地，上述的高温熟榨菜籽粕为熟榨菜籽油加工过程中温度不低于150℃的加工副产物。

进一步地，上述的菌酶混合液是由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、酿酒酵母和纤维素酶制得，其中，枯草芽孢杆菌和酿酒酵母为菌液，黑曲霉为孢子粉，纤维素酶为酶液。

进一步地，上述接种的菌酶混合液与发酵底物的质量百分比为：枯草芽孢杆菌接种量为5～7×10

进一步地，上述的固态发酵，其条件为含水量50％-52％、35℃-37℃发酵48h。

进一步地，上述的烘干的温度为65℃。

本发明还提供了一种由上述方法制备的菜籽粕成品。

本发明提供的菜籽粕成品可用于饲料开发，尤其可用于优质蛋白饲料原料的开发中，具有显著的应用价值。

本发明的提升菜籽油加工副产物营养价值的方法，解决了高温熟榨菜籽粕常规发酵效果差、品质较低等问题，具有以下优点：

本发明通过在发酵前调节发酵底物高温熟榨菜籽粕pH值，再接种菌酶混合液发酵，发酵过程中可使菌种在底物中快速增殖并分泌复杂酶系，同时结合纤维素酶的作用，有效降解菜籽粕中的硫苷和纤维，且将大分子蛋白质降解为小肽或氨基酸，更有利用于使动物机体的吸收，提升了高温熟榨菜籽粕的营养价值和利用率。

本发明选择48h的发酵时间，在获得较好的发酵效果同时可以尽可能的控制干物质损耗，使其保持在12％以内。

通过本发明提供的方法生产的菌酶协同发酵高温熟榨菜籽粕，与发酵前底物相比，硫苷降解率>90％、中性洗涤纤维降解率>45％、酸溶蛋白增加率>700％，发酵高温熟榨菜籽粕在猪上的消化能值和代谢能值分别提高了3.07MJ/kg和3.27MJ/kg，粗蛋白的表观消化率和真消化率提高均提高了10个百分点以上，具有显著的生产实际应用价值，可完全替代仔猪保育料中的优质蛋白源豆粕。

本发明提供的发酵方法采用纯菜籽粕底物，无需添加其他辅助发酵底物例如麦麸、稻壳、蔗糖等，操作方法简单，成本低，耗时短，便于实现规模化生产。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验例1不同油菜籽榨油加工温度类型菜籽粕的发酵效果对比

对不同油菜籽榨油加工温度类型菜籽粕的发酵效果进行对比，具体如下：

(1)分别将在80℃、115℃和150℃条件下榨油后生产的菜籽粕与水按质量比2:1均匀混合，121℃灭菌处理20min；

(2)经灭菌的菜籽粕冷却后，分别接种枯草芽孢杆菌进行固态发酵，接种量(V/W)为8％，并加入适量水调整至含水量50％，37℃发酵48h；

(3)发酵结束后，将发酵产物于65℃烘干至恒重；

(4)检测发酵前后菜籽粕中的硫苷、NDF和酸溶蛋白含量。

检测结果见下表1。

表1不同榨油温度菜籽粕经枯草芽孢杆菌发酵前后主要物质含量(绝干基础)

由表1可知，不同榨油温度加工副产物菜籽粕在相同发酵条件下，发酵效果出现显著差异。80℃和115℃条件下生产的菜籽粕具有较好的发酵效果，发酵后抗营养因子NDF和硫苷含量显著降低，小分子酸溶蛋白含量显著增加；但是，150℃条件下生产的菜籽粕发酵效果较差，酸溶蛋白、NDF和硫苷含量发酵前后无明显变化。对比分析发现，80℃和115℃加工的菜籽粕原料pH值分别为5.84和5.47，而150℃加工的菜籽粕原料pH值明显降低仅为4.88。由于枯草芽孢杆菌需要偏中性的生长环境，因此，推测150℃高温熟榨生产的菜籽粕因为pH值较低，导致枯草芽孢杆菌定植难、致使发酵效果差。

实验例2高温(150℃)加工的菜籽粕调节pH值后的发酵效果测定

对经150℃加工的菜籽粕调节pH值后的发酵效果进行测定，具体如下：

(1)将150℃熟榨菜籽粕与水按质量比2:1均匀混合，121℃灭菌处理20min；

(2)灭菌菜籽粕冷却后，添加氧化钙将pH值分别调节至5.84(80℃加工菜籽粕的自然pH值)，6.5，7.0和7.5制得不同pH值菜籽粕发酵底物；

(3)接种枯草芽孢杆菌进行固态发酵，接种量为8％，并加入适量水调整至含水量50％，37℃发酵48h；

(4)发酵结束后，65℃烘干至恒重；

(5)检测发酵前后菜籽粕中的硫苷、NDF和酸溶蛋白含量。

检测结果见下表2。

表2高温菜籽粕调节pH值后经枯草芽孢杆菌发酵前后主要物质含量(绝干基础)

由表2可知，将高温菜籽粕的pH值调节至与80℃加工菜籽粕pH值相同5.84后，再接种枯草芽孢杆菌发酵，发酵结束后酸溶蛋白、NDF和硫苷含量无显著变化；但是，将高温菜籽粕pH值调节至6.5、7.0和7.5时，再接种枯草芽孢杆菌发酵，发酵结束后酸溶蛋白含量显著增加，而NDF和硫苷含量显著降低，发酵效果显著。因此，根据尽量减少其他物质引入的原则，将高温菜籽粕发酵底物的pH值确定在6.5-7.0近中性环境。

实验例3低温(80℃和115℃)加工的菜籽粕不同pH的发酵效果测定

对低温80℃和115℃加工的菜籽粕调节pH值后的发酵效果进行测定，具体如下：

(1)将80℃和115℃加工菜籽粕分别与水按质量比2:1均匀混合，121℃灭菌处理20min；

(2)灭菌菜籽粕冷却后，将pH值分别调节至6.5和7.0制得菜籽粕发酵底物；

(3)接种枯草芽孢杆菌进行固态发酵，接种量为8％，并加入适量水调整至含水量50％，37℃发酵48h；

(4)发酵结束后，65℃烘干至恒重；

(5)检测发酵前后菜籽粕中的硫苷、NDF和酸溶蛋白含量。

检测结果见下表3和表4。

表3低温80℃菜籽粕经调节pH值后的发酵前后主要物质含量(绝干基础)

表4低温115℃菜籽粕经调节pH值后的发酵前后主要物质含量(绝干基础)

由表3和表4可知，80℃和115℃加工菜籽粕在其自然pH值以及将pH值上调至6.5和7.0时，接种枯草芽孢杆菌发酵结束后，与发酵前相比，小分子酸溶蛋白含量显著增加，而NDF和硫苷含量明显降低，但3个发酵组间无显著差异。

实验例4菌酶协同发酵提高高温榨油菜籽粕营养价值

一、150℃高温熟榨菜籽粕灭菌后调节pH值，再进行菌酶协同发酵，具体步骤如下：

(1)菜籽粕原料的灭菌：将40g在150℃条件下榨油生产副产物菜籽粕与20mL水混合均匀，经121℃高压蒸汽灭菌20min；

(2)菜籽粕原料的预处理：待灭菌的菜籽粕冷却后，添加氧化钙将菜籽粕pH值调至6.5；

(3)发酵用菌酶混合液的制备：采用摇瓶培养法分别培养枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。枯草芽孢杆菌和酿酒酵母分别采用LB液体培养基和YPD液体培养基培养。枯草芽孢杆菌的培养温度为37℃，摇床转速200rpm培养20h，酿酒酵母的培养温度为30℃，摇床转速200rpm培养24h，得到两种菌的种子液。黑曲霉采用孢子粉形式接种，孢子粉所含孢子浓度为5×10

(4)菌酶协同固态发酵与酶解：将步骤(2)预处理后的菜籽粕发酵底物原料与步骤(3)制备的发酵用菌酶混合液均匀混合，并加入适量水调整至含水量50％，35℃发酵48h；

(5)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(4)的固态发酵结束后，将发酵菜籽粕产物于65℃干燥至恒重，得到发酵菜籽粕成品。

二、180℃高温熟榨菜籽粕灭菌后调节pH值，再进行菌酶协同发酵，具体步骤如下：

(1)菜籽粕原料的灭菌：将40g在180℃条件下榨油生产副产物菜籽粕与20mL水混合均匀，经121℃高压蒸汽灭菌20min；

(2)菜籽粕原料的预处理：灭菌菜籽粕冷却后，添加氧化钙，将菜籽粕pH值调至6.5；

(3)发酵用菌酶混合液的制备：采用摇瓶培养法分别培养枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。枯草芽孢杆菌和酿酒酵母分别采用LB液体培养基和YPD液体培养基培养。枯草芽孢杆菌的培养温度为37℃，摇床转速200rpm培养20h，酿酒酵母的培养温度为30℃，摇床转速200rpm培养24h，得到两种菌的种子液。黑曲霉采用孢子粉形式接种，孢子粉所含孢子浓度为5×10

(4)菌酶协同固态发酵与酶解：将步骤(2)预处理后的菜籽粕发酵底物原料与步骤(3)制备的发酵用菌酶混合液均匀混合，并加入适量水调整至含水量50％，35℃发酵48h；

(5)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(4)的固态发酵结束后，将发酵菜籽粕于65℃干燥至恒重，得到发酵菜籽粕成品。

对比例1

150℃高温熟榨菜籽粕灭菌后不调节pH值，再进行菌酶协同发酵，具体步骤如下：

(1)菜籽粕原料的灭菌：将40g在150℃条件下榨油生产副产物菜籽粕与20mL水混合均匀，经121℃高压蒸汽灭菌20min；

(2)发酵用菌酶混合液的制备：采用摇瓶培养法分别培养枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。枯草芽孢杆菌和酿酒酵母分别采用LB液体培养基和YPD液体培养基培养。枯草芽孢杆菌的培养温度为37℃，摇床转速200rpm培养20h，酿酒酵母的培养温度为30℃，摇床转速200rpm培养24h，得到两种菌的种子液。黑曲霉采用孢子粉形式接种，孢子粉所含孢子浓度为5×10

(3)菌酶协同固态发酵与酶解：将步骤(1)灭菌后的菜籽粕发酵底物原料与步骤(2)制备的发酵菌酶混合液均匀混合，并加入适量水调整至含水量50％，35℃发酵48h；

(4)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(3)的固态发酵结束后，将发酵菜籽粕于65℃干燥至恒重，得到发酵菜籽粕成品。

对比例2

150℃高温熟榨菜籽粕灭菌后调节pH值，再进行混菌发酵(不加酶)，具体步骤如下：

(1)菜籽粕原料的灭菌：将40g在150℃条件下榨油生产副产物菜籽粕与20mL水混合均匀，经121℃高压蒸汽灭菌30min；

(2)菜籽粕原料的预处理：灭菌的菜籽粕冷却后，添加氧化钙，将菜籽粕pH调至6.5；

(3)发酵菌液的制备：采用摇瓶培养法分别培养枯草芽孢杆菌和酿酒酵母。枯草芽孢杆菌和酿酒酵母分别采用LB液体培养基和YPD液体培养基培养。枯草芽孢杆菌的培养温度为37℃，摇床转速200rpm培养20h，酿酒酵母的培养温度为30℃，摇床转速200rpm培养24h，得到两种菌的种子液。黑曲霉采用孢子粉形式接种，孢子粉所含孢子浓度为5×10

(4)三菌固态发酵：将步骤(2)预处理好的菜籽粕发酵底物原料与步骤(3)制备的发酵菌液均匀混合，并加入适量水调整至含水量50％，35℃发酵48h；

(5)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(4)的固态发酵结束后，将发酵菜籽粕于65℃干燥至恒重，得到发酵菜籽粕成品。

对比例3

150℃高温熟榨菜籽粕灭菌后调节pH值，再进行枯草芽孢杆菌单菌发酵，具体步骤如下：

(1)菜籽粕原料的灭菌：将40g在150℃条件下榨油生产的菜籽粕与20mL水混合均匀，经121℃高压蒸汽灭菌20min；

(2)菜籽粕原料的预处理：灭菌的菜籽粕冷却后，添加氧化钙，将菜籽粕pH调至6.5；

(3)发酵菌液的制备：采用摇瓶培养法培养枯草芽孢杆菌，培养温度为37℃，摇床转速200rpm培养20h得到枯草芽孢杆菌的种子液。取3.2mL枯草芽孢杆菌种子液16.8mL水混合均匀制成20mL发酵菌液。接种量按占菜籽粕质量的百分比计，枯草芽孢杆菌的接种量为8％(5～7×10

(4)固态发酵：将步骤(2)预处理好的菜籽粕发酵原料与步骤(3)制备的枯草芽孢杆菌发酵液均匀混合，并加入适量水调整至含水量50％，35℃发酵48h；

(5)发酵菜籽粕成品的制备：步骤(4)的固态发酵结束后，将发酵菜籽粕于65℃干燥至恒重，得到发酵菜籽粕成品。

不同发酵条件的结果测定对比：

测定实验例4中的‘一’、‘二’和对比例1-3中菜籽粕发酵前后硫苷、中性洗涤纤维和酸溶蛋白的含量。硫苷采用氯化钯比色法测定，中性洗涤纤维(NDF)采用ANKOM-2000i型全自动纤维分析仪测定，酸溶蛋白采用NY/T3801-2020方法测定，测定结果如下表5所示：

表5高温熟榨菜籽粕发酵前后各物质含量变化(绝干基础)

由表5可知，与150℃高温熟榨的菜籽粕原料相比，实验例4中的‘一’、‘二’制备的发酵菜籽粕成品，其酸溶蛋白含量显著增加，NDF和硫苷含量显著降低，说明调整pH值后进行菌酶协同发酵，取得显著效果。同时，实验例4中‘一’与‘二’中制备的发酵菜籽粕相比，其酸溶蛋白、NDF和硫苷含量无明显差异，表明该pH值调节+菌酶协同发酵条件用于150℃和180℃高温熟榨菜籽粕的改造均能取得显著的效果。此外，实验例4中‘一’与对比例1-3制备的发酵菜籽粕相比，对比例1未调节pH值，菌酶协同发酵对酸溶蛋白、NDF和硫苷含量均无显著影响，表明pH值的调节非常重要；对比例2调节pH值后仅进行混菌发酵(不添加纤维素酶)，酸溶蛋白含量显著增加、NDF和硫苷含量显著降低，但效果明显不如实验例4中‘一’发酵菜籽粕；对比例3调节pH值后仅进行枯草芽孢杆菌单菌发酵，酸溶蛋白含量显著增加、NDF和硫苷含量显著降低，但效果也明显不如实验例4中‘一’发酵菜籽粕。上述实验例和对比例结果表明，高温熟榨菜籽粕菌酶协同发酵取得显著改良效果的条件是底物pH值需要调节到6.5-7.0，且进行菌酶协同发酵处理。

应用验证例1：

选取24头体重接近的DLY去势公猪(约25kg)，随机分成3个处理，每个处理8个重复，每个重复1头猪。试验饲粮包括玉米-豆粕型基础饲粮、高温熟榨菜籽粕饲粮和菌酶协同发酵高温熟榨菜籽粕饲粮，其中高温熟榨菜籽粕或按‘一’制备的发酵高温熟榨菜籽粕替代基础饲粮中20％玉米+豆粕提供的能量。饲料中的维生素和矿物质满足NRC(2012)推荐的20-50kg生长猪的营养需要。试验猪预饲7d后，进行4d的代谢试验，准确记录试猪的采食量，收集排泄的全部粪便和尿液，按照ISO 9831-1998方法测定饲粮、粪便和尿液总能含量，并计算高温熟榨菜籽粕和发酵高温熟榨菜籽粕的消化能值和代谢能值，结果如下表6所示。

表6高温熟榨菜籽粕和发酵高温熟榨菜籽粕生长猪有效能值比较(绝干基础)

由表6可知，与高温熟榨菜籽粕相比，发酵高温熟榨菜籽粕能量的消化率和利用率显著提高，消化能和代谢能含量分别提高3.07MJ/kg和3.27MJ/kg，表明通过本发明的方法发酵得到的发酵高温熟榨菜籽粕品质得到显著改善。

应用验证例2：

选取24头体重接近的DLY去势公猪(约25kg)，随机分成3个处理，每个处理8个重复，每个重复1头猪。试验饲粮包括无氮日粮、高温熟榨菜籽粕饲粮和菌酶协同发酵高温熟榨菜籽粕饲粮。其中无氮饲粮用于测定生长猪的内源氮损失，高温熟榨菜籽粕饲粮和发酵高温熟榨菜籽粕饲粮分别添加35％高温熟榨菜籽粕或者按‘一’制备的发酵高温熟榨菜籽粕作为唯一蛋白来源，所有饲粮均添加0.4％Cr

表7高温熟榨菜籽粕和发酵高温熟榨菜籽粕生长猪粗蛋白质消化率比较(绝干基础)

由表7可知，与高温熟榨菜籽粕相比，发酵高温熟榨菜籽粕蛋白质的回肠消化率和粪消化率均显著提高，表明通过本发明的方法发酵得到的发酵高温熟榨菜籽粕品质得到显著改善。

应用验证例3：

选取120头体重接近的DLY断奶仔猪(约7.6kg)，随机分成5个处理，每个处理8个重复，每个重复3头猪。试验饲粮包括玉米-豆粕-鱼粉基础饲粮，以及高温熟榨菜籽粕按25％、50％、75％和100％等氮替代基础饲粮中的豆粕。试验期35天。考察仔猪的生长性能，结果如下表8所示。

表8发酵高温熟榨菜籽粕不同比例替代基础饲粮中的豆粕对仔猪生长性能的影响

由表8可知，与基础饲粮组相比，发酵高温熟榨菜籽粕25％、50％、75％和100％替代豆粕后均能明显改善试验期仔猪的平均日采食量和平均日增重，降低料肉比，表明通过本发明的方法发酵得到的发酵高温熟榨菜籽粕的饲用效果达到甚至超过了豆粕，提示改发酵高温熟榨菜籽粕达到与豆粕相当甚至更优的饲料蛋白源。

综上可知，本发明提供的发酵方法可以显著提高菜籽粕的营养价值和利用率，操作方法简单，成本低，耗时短，便于实现规模化生产，在饲料领域如饲料原料的开发和饲料的制备中具有显著的应用价值，尤其在优质蛋白饲料原料的开发和豆粕替代品的制备中具有重要的意义。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。