益菌元配方、食品、保健食品、医药组合物及其用途

技术领域

本发明提供一种益菌元配方、含有该益菌元配方的食品、保健食品与医药组合物，以及该益菌元配方的用途。

背景技术

益菌元(prebiotics)作为肠内益生菌的营养源可影响肠内益生菌的组成，为健康带来益处。其中，水溶性多糖，因来源众多且制造工艺成熟，适合作为益菌元配方的原料，故被广泛使用。

益菌元配方通常选择不易因消化酶而水解的菊糖、果寡糖、葡聚糖、葡寡糖、半乳果糖及乳寡糖等水溶性多糖作为材料。

然而，以往的益菌元配方中多选择寡糖的形式，在食用后通过小肠时往往容易被兼性厌氧的乳酸菌或耐氧的双歧杆菌消耗，因而造成小肠细菌过多症(SIBO)，引起消化异常。市面上较少针对供应结肠内专性厌氧菌的代谢特性来设计产品，在供应肠内益生菌的利用上尚有改善空间。

此外，接受免疫检查点阻断(ICB)治疗的癌症患者，通常会因疗效受限而放弃，幸好近来发现通过改变肠内菌群可以大幅提升治疗有效性。而且，由于治疗的毒性增加会导致结肠炎及腹泻等不良反应，故也寻求一种能够用来保护肠黏膜和调节肠道免疫的方法。

发明内容

本发明是鉴于上述问题而完成的，其目的在于提供一种益菌元配方。并且，本发明的目的还在于提供使用此种益菌元配方制成的食品、保健食品、医药组合物及该益菌元配方的用途。

本发明提供一种益菌元配方，其包含分子量分布的主要范围0.6-107kDa的葡甘露小分子多糖，所述多糖具有β-1,4-D-吡喃葡萄糖基和β-1,4-D-吡喃甘露糖基，所述多糖的主链中的一部分甘露糖基具有键合的乙酰基。

并且，本发明可提供包含前述益菌元配方的食品、保健食品及医药组合物。

而且，本发明的益菌元配方可用于制备保护肠黏膜的制剂的用途、或调节肠道免疫的用途的制剂。前述益菌元配方的制剂在食用后能够于肠内供应诱导菌群利用，所述诱导菌群的种类包含梭菌的第IV或XIV簇或梭菌属、拟杆菌属、另枝菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属或艾克曼菌属。

前述保护肠黏膜的用途包含藉由所述诱导菌群以维持肠黏膜表皮的细胞密度的用途、减少肠黏膜的异常指数的用途、维护或改善肠黏膜屏障的功能的用途、或提高肠黏膜的免疫耐受性的用途。

前述调节肠道免疫的用途包含藉由所述诱导菌群刺激肠黏膜内先天性免疫细胞活化的用途、增加肠黏膜内孤立淋巴滤泡(isolated lymphoid follicle)的数量的用途、或促使孤立淋巴滤泡发育和成熟的用途。

另外，本发明的益菌元配方可用于制备辅助ICB治疗的用途的制剂，其是增加ICB治疗有效性的用途、和降低或预防治疗的肠毒性的用途。前述益菌元配方的制剂在食用后能够于肠内供应诱导菌群利用，促使肠黏膜内孤立淋巴滤泡数量增加和成熟后，可提供适应性CD4

根据本发明可实现保护肠黏膜、调节肠道免疫、辅助ICB治疗的功效。

附图说明

图1(A)是描绘实施例的益菌元配方经凝胶渗透层析法而获得的强度与迁移时间的关系的图，(B)是描绘三批次来源的益菌元配方(实线标示)对照标准品S1～S6(虚线标示)经凝胶渗透层析法而获得的强度与迁移时间的关系的图。

图2是描绘实施例的实验设计的示意图。

图3是各实验组的结肠组织的H&E染色影像及其局部放大图。

图4是各实验组的结肠组织的Foxp3免疫组织染色影像。

图5是各实验组的CD3

图6是各实验组的CD4

图7是各实验组的IL-6免疫组织染色影像。

图8是DSS组的孤立淋巴滤泡内T细胞的表现的染色影像。

图9是配方/DSS组的孤立淋巴滤泡内T细胞的表现的染色影像。

图10是各实验组的肠黏膜的表皮细胞密度及异常指数的统计分析图。

具体实施方式

以下参照附图详细说明本发明的实施方式。

在此，所述“相对分子量”意味着在透过凝胶渗透层析法中以标准品为基准，对照波峰的迁移时间而计算出的分子量。

此外，本发明的实施结果的验证涉及实验动物的牺牲。为符合国际动物福利保护和减少动物牺牲的“3Rs”倡议，本发明使用数量有限但已足以在科学上证明实施结果的实施例来进行说明，故以下披露的实施方式与实施例并非对本发明的权利范围的限制。

[益菌元配方]

本发明的益菌元配方包含分子量分布的主要范围0.6-107kDa的葡甘露小分子多糖，所述多糖具有β-1,4-D-吡喃葡萄糖基和β-1,4-D-吡喃甘露糖基，所述多糖的主链中的一部分的甘露糖基具有键合的乙酰基。

<葡甘露小分子多糖>

天然的葡甘露聚糖由于分子量大，在肠内不易被細菌直接利用，故需先以人工水解。已知，由于葡甘露聚糖的分子量的差异，所形成的诱导菌群也会不同。经水解的分子可分为：3-20个糖基分子的寡糖(<4kDa)、20-1,000个糖基分子的小分子多糖(4-200kDa)、少于5,000个糖基分子的低聚糖(<1,000kDa)以及多于5,000个糖基分子的聚糖，可视需求选择。在此，人工水解可通过酸水解法、酶水解法、超声波或微波水解法等已知的水解法。

在本发明的益菌元配方中，采用分子量分布范围0.6-107kDa的葡甘露小分子多糖。若使用此种小分子多糖所制备的益菌元配方的制剂，可在食用后通过小肠时减少被兼性厌氧乳酸菌或耐氧双歧杆菌消耗，让益菌元配方可到达结肠供专性厌氧菌进行代谢。

而且，由于此种葡甘露小分子多糖在水溶液中呈直链状，故有利于同时与多个内切甘露糖苷酶(endo-1,4-β-mannosidase)进行反应而易于被肠内细菌利用。若该多糖的主链结构因延长而弯曲或折叠或缠结，则会因立体障碍影响反应进行。

并且，此种葡甘露小分子多糖的主链的一部分的甘露糖基具有键合的乙酰基，故有利于水合。若其中乙酰基的含量越丰富，则分子呈直链状的程度越高，越有利于被肠内细菌利用。

[食品]

本发明的益菌元配方还可用于制备食品。本发明的益菌元配方所制备的食品中，除了本发明的益菌元配方外，还可包含符合法规规定且不对益菌元配方的效果产生负面影响的其他食品原料及食品添加物。

[保健食品]

本发明的益菌元配方还可用于制备保健食品。本发明的益菌元配方所制备的保健食品中，除了本发明的益菌元配方外，还可包含符合法规规定且不对益菌元配方的效果产生负面影响的其他添加剂或活性成分。

[医药组合物]

本发明的益菌元配方还可用于制备医药组合物。本发明的益菌元配方所制备的医药组合物中，除了本发明的益菌元配方外，还可包含符合法规规定且不对益菌元配方的效果产生负面影响的其他添加剂或活性成分。

[保护肠黏膜、调节肠道免疫的用途]

本发明的益菌元配方的制剂经食用后可于肠内供诱导菌群利用，介导启动黏膜保护及免疫调节的机制。保护肠黏膜、调节肠道免疫的用途详如后述。

<诱导菌群>

本发明的益菌元配方是依照已知肠内菌群的代谢酶进行代谢的特性而设计，可诱导的菌群种类包含梭菌的第IV或XIV簇或梭菌属、拟杆菌属、另枝菌属、双歧杆菌属、乳杆菌属、肠球菌属或艾克曼菌属。

举例而言，本发明的益菌元配方中的葡甘露小分子多糖在肠内可直接供拟杆菌属的卵形拟杆菌(B.ovatus)或多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)的表面的糖感知/转录调节器感应，在菌体上生成特异性的内切甘露糖苷酶来执行葡甘露小分子多糖的初步水解。同时，还在菌体内生成乙酰甘露糖苷脂解酶及β-葡萄糖苷酶来分别水解乙酰基及葡萄糖基。并且，梭菌的普拉氏梭菌(F.prausnitzii)或肠道罗斯氏菌(R.intestinalis)可感应游离的5～7个糖基的初步水解产物，在菌体内生成外切甘露糖苷酶(exo-1,4-β-mannosidase)进行次级水解，经水解后游离的产物多为非还原端甘露三糖或甘露双糖，其又可供丁酸杆菌(C.butyricum)或青春双歧杆菌(B.adolescentis)的β-甘露聚糖酶(β-mannanase)水解和代谢为丁酸。在菌属之间，依靠营养互利模式进行代谢可快速使共生菌群扩张。

并且，前述初步水解的产物可供黏液内常驻菌如艾克曼菌属的嗜黏液艾克曼菌(A.muciniphila)或双歧杆菌属的假龙根双歧杆菌(B.pseudolongum)生长和制造肌苷；次级水解产物的甘露三糖可供另枝菌属利用；游离的双醣或单醣可供双歧杆菌属或乳杆菌属生长和制造乙酸或乳酸，也可供肠球菌属生长和制造乳酸以抑制大肠杆菌生长。

<保护肠黏膜的用途>

本发明的益菌元配方的制剂可供肠内的前述诱导菌群利用，调节黏膜内的先天性免疫细胞保护肠黏膜，与肠黏膜屏障相辅相成。

在此，所述“肠黏膜屏障”是指由肠黏膜的表皮细胞、杯状细胞及其所分泌的黏液、班尼斯细胞及其所分泌的抗菌肽共同构成的屏障，可将肠内菌群与黏膜固有层内的免疫细胞分隔。

诱导菌群的肠黏膜保护的详细机制虽尚不明确，但促进表皮细胞更新是维护肠黏膜屏障功能的有效方法。表皮细胞自噬是一种细胞自主更新的模式，可使氨基酸或脂肪酸在线粒体内进行氧化磷酸化反应，加速消耗细胞内的氧气和营养。并且，若肠黏膜内缺氧，则可减少免疫细胞表现发炎因子，改善肠黏膜发炎症状，并且进一步促进更多的表皮细胞自噬。

其中，作为能够促进细胞自噬的一个实例，肠球菌因为可躲避宿主巨噬细胞的攻击，会伺机感染宿主。作为应对肠球菌感染的方式，若表皮细胞感染肠球菌，会促使表皮细胞启动细胞自噬基因，随后通过表皮细胞的调节蛋白感知，引发表皮细胞自噬，藉以清除细胞内的细菌感染。

并且，细胞自噬还可回收营养，避免营养渗漏至黏膜内，造成大肠杆菌感染。

<调节肠道免疫的用途>

诱导菌群与肠黏膜表皮的微皱褶细胞交流可能促使第3类先天免疫淋巴球(ILC3)调控初始

并且，固有层内部分淋巴球受诱导菌群的吸引，向上皮移动成为表皮间淋巴球，参与表皮细胞的更新和监视黏液内细菌的变化。表皮间淋巴球会释放细胞激素IL-6以刺激肠黏膜表皮的隐窝干细胞新生和分化，促使邻近细胞排列紧密并促进杯状细胞增加分泌黏液，以保护肠黏膜。如此，可避免各种细菌、食物抗原或化学物质对肠黏膜的伤害而造成急性或慢性的黏膜发炎、瘜肉或肿瘤生长。

[辅助免疫检查点阻断治疗的用途]

丁酸是诱导菌群中丁酸杆菌或普拉氏梭菌等的代谢产物。结肠内由于缺乏葡萄糖及氧气供应，从而限制表皮细胞进行有氧糖酵解，因此以丁酸作为主要能源。

表皮细胞将丁酸运送至线粒体内执行脂肪酸β-氧化及氧化磷酸化反应以产生能量，在缺氧环境下进一步消耗氧气，促使肠黏膜呈无氧状态。因此，氧气无法扩散至肠腔，有效维持肠腔为无氧环境以助专性厌氧菌生长和代谢。

<孤立淋巴滤泡的形成>

无氧环境可使肠黏膜内ILC3的缺氧诱导因子HIF-1α稳定，有利于合成转录因子HIF-1促进ILC3自身的细胞增生及表现维甲酸相关孤儿受体(RORγt)成为RORγt

而且，藉由微皱褶细胞的信息传递，固有层内单核吞噬细胞分泌IL-1β激素刺激RORγt

<增加免疫检查点阻断治疗有效性>

由于癌细胞对免疫检查点的抑制使得细胞毒杀性T细胞(CTLs)无法识别出癌细胞，因此在一般情况下CTLs无法发挥细胞毒杀作用。ICB治疗是利用人造抗体阻断癌细胞对免疫检查点的抑制，大幅提升免疫细胞如CTLs识别癌细胞的灵敏度，使CTLs能够识别癌细胞并发挥毒杀作用。因此，在实施ICB治疗时，患者的适应性CD8

活化的RORγt

而且，诱导菌群的代谢产物的肌苷可供应孤立淋巴滤泡内淋巴球在缺乏葡萄糖下生存的营养，通过改善T细胞的代谢适应性来增强ICB治疗。

总之，本发明的益菌元配方可促使肠黏膜内的孤立淋巴滤泡数量增加和成熟以提供适应性CD4

<降低治疗的肠毒性>

受诱导菌群刺激而成熟的孤立淋巴滤泡可提供适应性CD8

成熟的适应性CD8

并且，若要评估个体对ICB治疗的适应是否良好，可采用评估患者粪便菌群的种类及其相对丰度与前述诱导菌群对照的方式进行。

实施例

图1的(A)和(B)是分别描绘本实施例的益菌元配方及其与标准品S1～S6经凝胶渗透层析法而获得的强度与迁移时间(Rt)的关系的图。本发明的益菌元配方的分子量分布的主要范围0.6-107kDa，波峰的相对分子量为35.8kDa，次要范围的波峰的相对分子量为6300kDa、744kDa。标准品S1～S6的分子量示于表1。波峰的迁移时间会伴随凝胶渗透层析法的条件而改变。

[表1]

图2是描绘实施例的实验设计的示意图。在同一笼中饲养12只6～8周龄的雄性Balb/c小鼠1周后，随机将小鼠以每组3只分为4组，依照图2所示的实验设计分笼饲养，各组小鼠饲养条件如下。

[1]控制组：以常规饲料和饮用水饲养小鼠。

[2]配方组：以本发明的益菌元配方于50μL水经口管灌食，并以常规饲料和饮用水饲养小鼠。

[3]DSS组：以常规饲料和饮用水饲养小鼠，并于第21日起将饮用水改为4％ DSS(葡聚糖硫酸钠，分子量约40kDa)水溶液，作为促发炎剂。

[4]配方/DSS组：以本发明的益菌元配方于50μL水经口管灌食，同时以常规饲料和饮用水饲养小鼠，并于第21日起将饮用水改为4％ DSS水溶液。

于实施第28日牺牲小鼠，并采用常规病理评估结肠黏膜中表皮细胞和免疫细胞的表现。

图3是各实验组的结肠组织的H&E染色影像及其局部放大图。在控制组及配方组中观察到健康且完整的表皮细胞及隐窝细胞，在DSS组中观察到受损的表皮细胞或隐窝细胞的细胞核因发炎呈现滤泡状膨胀坏死而变得不明显，在配方/DSS组中观察到受损的表皮细胞或隐窝细胞皱缩进行细胞自噬(均以箭头，分别指出受损的隐窝细胞)。另一方面，在DSS组中，有大量多核球进入肠黏膜的固有层内，表示肠黏膜组织已经受到感染；相对地，在配方/DSS组中，肠黏膜的固有层内以单核球为主，维持表皮和隐窝完整。

图4是各实验组的结肠组织的Foxp3免疫组织染色影像。配方组相较于控制组在固有层(LP)内表现较多含Foxp3转录因子的天然调节性T细胞(图中的深黑色点)分布，DSS组的固有层内天然Tregs明显较少，并且在黏膜下层(S)大量分布诱导调节性T细胞(主要受TGF-β刺激表现，其作用在于抑制CD8

图5是各实验组的CD3

图6是各实验组的CD4

图7是各实验组的IL-6免疫组织染色影像，在控制组中IL-6的分泌细胞零星分布于固有层，在配方组中IL-6的分泌细胞位于表皮下方，在DSS组中之IL-6的分泌细胞聚集在黏膜下层，在配方/DSS组中的IL-6分泌细胞穿插于表皮或隐窝内。此结果与图5相对应，显示表皮间淋巴球会释放IL-6影响表皮细胞的紧密链接，加强黏膜屏障功能。

图8是DSS组的孤立淋巴滤泡内T细胞的表现的染色影像，图9是配方/DSS组的孤立淋巴滤泡内T细胞的表现的染色影像。其中，图8～9除了H&E染色影像以外，其他染色影像均为对H&E染色影像中的方框区域针对CD3

图10是各实验组的肠黏膜的表皮细胞密度及异常指数的统计分析图。配方/DSS组较DSS组呈现表皮细胞密度显著增加和异常指数显著减少，并且无异于控制组和配方组，表示配方/DSS组较DSS组具有完整的表皮和健康的黏膜组织。

在此，所述“异常指数”是用于评估肠黏膜的组织异常或组织发炎的表现，分数越高表示越异常。异常指数依据下述式算出，其评估内容和分级示于表2。

异常指数＝发炎程度×涵盖区域+发炎范围×涵盖区域+表皮新生×涵盖区域+隐窝损害×涵盖区域。(各试验组随机采集30样本由病理专家评分)

[表2]

从上述图3～10各项的比较中，可知配方/DSS组较DSS组具有完整的肠黏膜屏障功能，故可避免DSS损害肠黏膜表皮，并避免其所造成的黏膜发炎。

并且，在控制组及配方组中，驻留于孤立淋巴滤泡的CD8

而且，比较配方组与控制组在肠黏膜内的孤立淋巴滤泡的数量，以前者的数量较多且尺寸也较大，可推测此是因诱导菌群刺激先天淋巴T细胞活化和B细胞聚集。

另外，由于配方组的孤立淋巴滤泡的数量较控制组多且成熟，推测其供应CD4

执行ICB治疗前，若持续食用本发明的益菌元配方的制剂可使诱导菌群刺激孤立淋巴滤泡成熟以提供适应性CD4

【符号说明】

S1～S6：标准品

SM：黏膜上层

LP：固有层

S：黏膜下层