具有高水平DPA(n-3)的组合物以及制备方法

相关申请的交叉引用

本申请是根据专利合作条约提出的国际申请，要求2022年3月8日提交的美国临时专利申请号US 63/317,805、2021年11月24日提交的US 63/282,714、2021年11月24日提交的US 63/282,712和2022年3月8日提交的US 63/317,797的优先权，这些申请的内容全部以引用方式并入本文。

背景技术

对于人类婴儿和幼儿、成人以及其他动物来说，期望增加有益的长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的膳食摄入，包括例如ω-3长链多不饱和脂肪酸(ω-3LC-PUFA)和ω-6长链多不饱和脂肪酸(ω-6LC-PUFA)。如本文所用，提及的长链多不饱和脂肪酸或LC-PUFA是指具有18个或更多个碳的多不饱和脂肪酸。由于认识到ω-6和ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的临床益处，促使人们努力增加这些脂肪酸在婴儿饮食中的使用(Carlson和Forsythe 2001Curr.Op.Clin.Nutr.Metab.Care 4、123-126；Birch等人，2000Develop.Med.Child Neuro.42,174-181)。此外，ω-3LC-PUFA对母体补充剂和其他类型的营养补充剂和食物的临床益处也是公认的(Barclay和Van Elswyk 2000，FUNCTIONALFOODS2000，Angus，F.和Miller C，eds.，第60-67页，Leatherhead Publishing,Surrey)。

脂肪酸是根据碳链的长度和饱和特征进行分类的。如本文所用，脂肪酸包括各种形式的脂肪酸，包括但不限于三酰基甘油、二酰基甘油、单酰基甘油、磷脂、游离脂肪酸、酯化脂肪酸和这些脂肪酸的天然或合成衍生物形式(例如，脂肪酸的钙盐，乙酯等)。短链脂肪酸具有2至约7个碳，并且通常是饱和的。中链脂肪酸具有约8至约17个碳，并且可以是饱和的或不饱和的。长链脂肪酸具有18至24个或更多个碳，并且也可以是饱和的或不饱和的，并且可存在一个或多个不饱和点，分别产生术语“单不饱和”和“多不饱和”。本发明特别关注长链PUFA(LC-PUFA)。

按照熟知的命名法，根据脂肪酸中双键的数目和位置对LC-PUFA进行分类。根据最靠近脂肪酸甲基端的双键的位置，存在LC-PUFA的两个常见系列或家族：n-3(或ω-3或ω-3(omega-3))系列在第三个碳处含有双键，而n-6(或ω-6或ω-6(omega-6))系列在第六个碳之前没有双键。因此，二十二碳六烯酸(“DHA”)具有22个碳的链长，从甲基端的第三个碳开始具有6个双键，并被命名为“22:6n-3”。其他重要的ω-3LC-PUFA包括命名为“20:5n-3”的二十碳五烯酸(“EPA”)和命名为“22:5n-3”的二十二碳五烯酸n-3(“DPA(n-3)”)。此外，ω-6LC-PUFA可与本发明结合使用。例如，命名为“20:4n-6”的花生四烯酸(“ARA”)和命名为“22:5n-6”的二十二碳五烯酸n-6(“DPAn-6”)都是合适的。

人体中不发生ω-3脂肪酸和ω-6脂肪酸的从头合成或“新”合成。ω-3和ω-6脂肪酸的前体脂肪酸分别是α-亚麻酸(18:3n-3)和亚油酸(18:2n-6)。这些脂肪酸是必需脂肪酸，并且必须在饮食中消耗，因为人类不能合成它们。人类不能将双键插入到比从分子末端开始计数的第七个碳原子更靠近ω端的位置。然而，身体可将α-亚麻酸和亚油酸分别转化为LC PUFA诸如DHA和ARA，尽管效率非常低。所有代谢转化均在不改变含有ω-3和ω-6双键的分子的ω端的情况下发生。因此，ω-3和ω-6酸是两个独立的脂肪酸家族，因为它们在人体内不能相互转化。

足月儿和早产儿都可从各自的必需脂肪酸合成LC-PUFA，但是争议集中在以下事实：母乳喂养的婴儿比配方奶粉喂养的婴儿具有更高的这些LC-PUFA的血浆浓度。该信息可被解释为暗示配方奶粉喂养的婴儿不能合成足够的这些脂肪酸以满足持续的需要，尽管DHA和ARA的血浆含量仅仅是其他组织中可用的总脂肪酸池的非常小的部分。已经证明，向婴儿配方食品中添加DHA可改善婴儿的视觉功能，并且添加DHA和ARA可改善认知发育并促进婴儿的正常生长。含有DHA和DPA(n-6)的油以及含有ARA的油的来源已被开发用于营养用途，并且这些已经被建议用于婴儿配方食品中，以更好地匹配在人类母乳中发现的LC-PUFA谱。

花生四烯酸以及它的延伸产物二十二碳四烯酸和二十二碳五烯酸被建议与二十二碳六烯酸一起纳入婴儿饮食中，因为它们在人类母乳中天然存在(Spector 1994)。

许多组织提供了关于婴儿配方食品中LC-PUFA水平的建议。例如，国际脂肪酸和脂质研究学会(ISSFAL)在1994中推荐婴儿配方食品提供60-100mg/kg/天的预形成的花生四烯酸及其相关联的长链ω-6形式(22:4(n-6)和22:5(n-6))(ISSFAL Board of Directors,ISSFAL Newsletter:4-5(1994))。ISSFAL在1999年对婴儿配方食品中的LC-PUFA提出了以下建议，以确保充分摄入LC-PUFA：亚油酸，18:2n-6，10％；α-亚麻酸，18:3，1.50％；花生四烯酸，20:4n-6，0.50％；二十二碳六烯酸，22:6n-3，0.35％；二十碳五烯酸，20:5n-3，0.10％。

确定的长链ω-3脂肪酸(DHA/DPA/EPA)的推荐日摄入量(RDI)为200mg/天(COMA(Committee on Medical Aspects of Food Policy)(1994).Annual Report.London:Department of Health)至1.2g/天(Nordic Council of Ministers(1989).NordicNutrition Recommendations，第二版)。这些RDI代表成人从3至20mg DHA+EPA/kg/天的DHA/EPA摄入量范围。来自欧洲的研究表明，成人DPA(n-3)的平均日摄入量可在25mg/天至75mg/天的范围内(Leng等人，2017Int.J.COPD.12,3171-3181)。相比之下，格陵兰因纽特人由于大量摄入海洋食物和脂类，估计每天摄入1.7至4.0g DPA(Bang等人，1980Am.J.Clin.Nutr.33,2657-2661)。

对于孕妇和哺乳期妇女，美国食品和药物管理局推荐每周食用8-12盎司海产品，诸如鲑鱼。鉴于大西洋养殖鲑鱼含有大约333mg/100g DPA，每周食用12盎司鲑鱼将提供平均162mg/天的DPA(Cladis等人，2014Lipids 49,1005-1018)。然而，西方国家的孕妇和哺乳期妇女的实际母体DPA摄入量相当低，各种研究报告为在约18mg/天与35mg/天之间(Denomme等人，2005J.Nutr.135,206-211；Garneau等人，2012Nutr.J.11,1-6；Field等人，2014 11

对于婴儿，可从关于人类母乳中DPA(n-3)含量的数据中收集用于比较目的的参考摄入量。据报道，在西方国家，人类母乳中DPA(n-3)含量占总脂肪的百分比为0.06-0.75％，与成熟母乳(0.06-0.52％)相比，在初乳(0.11-0.75％)中通常观察到更高的含量。在一项研究中，显示母乳脂肪含有0.22％的DHA、0.17％的DPA和0.04％的EPA。假定婴儿每日消耗的母乳为750mL/天，体重为3.5kg，并且母乳的平均脂肪含量为4％，则母乳喂养婴儿的DPA日摄入量在约18至约156mg/天(约5.1-44.6mg/kg/天)的范围内。对于70kg的成人，这相当于约357-3122mg DPA/天(Li等人，2016Eur.J.Lipid Sci.Technol.118,1692-1701)。

对于配方奶粉喂养的婴儿，DPA的消耗量难以确定。由于没有关于配方奶粉中DPA含量的建议，因此婴儿配方食品通常不补充DPA。据报道，与母乳喂养的婴儿相比，未补充LC-PUFA(n-3)的配方奶粉喂养的婴儿具有显著更低的血浆DPA和DHA(Socha等人，1998ActaPaediatr.87,278-283；Woltil等人，1995Am.J.Clin.Nutr.62,943-949)。

尽管DHA在产前和产后发育中的作用已得到很好的证实，并且婴儿配方食品中经常补充DHA，但重要的是注意到DPA(n-3)的水平几乎与人类母乳中的DHA相同。DPA(n-3)是大脑中含量第二高的n-3LC-PUFA(仅次于DHA)。DPA(n-3)的具体作用仍在研究中，但它可在神经发育和功能方面发挥作用。注意到婴儿高水平的DPA(n-3)摄入(以mg/kg体重计)发生在大脑和神经组织快速发育期间。

已知DPA(n-3)能够直接转化为DHA并逆向转化为二十碳五烯酸(EPA)，这也表明它可作为这些n-3LC-PUFA在体内的储存库。

ARA通常是以最高的浓度添加到婴儿配方食品中的LC-PUFA。目前，健康和监管机构建议，应将ARA和DHA以约2:1-1:1(ARA:DHA)的近似比率添加到婴儿配方食品中。已知ω-3LC-PUFA诸如DHA的高膳食摄入可导致DHA含量增加，但也降低ARA的血浆水平。因此，将ARA以这些水平添加到婴儿配方食品中，以补偿由DHA施用引起的ARA血浆水平的下降。由于LC-PUFA成分的增加的成本，含有LC-PUFA的婴儿配方食品可能比标准婴儿配方食品更昂贵。

期望以既能提供补充DPA(n-3)的益处又在经济上可行的方式富集人类和动物组合物，包括婴儿配方食品。本发明应满足这些和其他需要。

该技术问题的解决方案由权利要求中表征的实施方式提供。

发明内容

在一个实施方式中，提供了一种食物产品，其包含(1)Sphaeroforma属的微生物，和/或从其提取的脂质；以及(2)食物材料。

在一个实施方式中，本发明提供了一种组合物，其中该组合物包含长链n-3脂肪酸，并且其中该长链n-3脂肪酸包含二十二碳五烯酸(DPA(n-3))和二十二碳六烯酸(DHA)。在一些实施方式中，该组合物是婴儿配方组合物，其中当准备供婴儿食用时，该组合物包含长链n-3脂肪酸，并且其中该长链n-3脂肪酸包含二十二碳五烯酸(DPA(n-3))和二十二碳六烯酸(DHA)。在一些实施方式中，婴儿配方组合物包含0.1-0.2g/100g总脂肪酸(FA)的量的DPA(n-3)。在一些实施方式中，组合物或婴儿配方组合物中的DPA(n-3):DHA的比率大于0.2。

本发明还提供了一种制备组合物(包括婴儿配方组合物)的方法，该方法包括将营养组分和长链n-3脂肪酸组合；其中该长链n-3脂肪酸包含DPA(n-3)和DHA；其中DPA(n-3):DHA的比率为约0.2:1至约1:1。通过该方法制备的婴儿配方组合物也包括在本发明中。

在某些实施方式中，DPA(n-3):DHA的比率大于0.2:1。在一些实施方式中，DPA(n-3):DHA的比率大于约0.3:1，大于约0.4:1，大于约0.5:1，大于约0.6:1，大于约0.7:1，或大于约0.8:1。

在某些实施方式中，DPA(n-3):DHA比率为约0.2:1至约1:1，约0.3:1至约1:1，约0.4:1至约1:1，约0.5:1至约1:1，约0.6:1至约1:1，约0.7:1至约1:1，约0.2至约0.9，约0.2至约0.8，约0.3至约0.8，约0.2:1，约0.3:1，约0.4:1，约0.5:1，约0.6:1，约0.7:1，约0.8:1，约0.9:1或约1:1。

在某些实施方式中，组合物中的DHA:DPA(n-3):EPA比率为0.01:1:0.01-0.70，优选0.20:1:0.20-0.70，或0.20-0.70:1:0.20，例如：0.2:1:0.2；0.2:1:0.25；0.2:1:0.3；0.2:1:0.35；0.2:1:0.4；0.2:1:0.45；0.2:1:0.5；0.2:1:0.55；0.2:1:0.6；0.2:1:0.65；0.2:1:0.7；0.25:1:0.2；0.25:1:0.25；0.25:1:0.3；0.25:1:0.35；0.25:1:0.4；0.25:1:0.45；0.25:1:0.5；0.25:1:0.55；0.25:1:0.6；0.25:1:0.65；0.25:1:0.7；0.3:1:0.2；0.3:1:0.25；0.3:1:0.3；0.3:1:0.35；0.3:1:0.4；0.3:1:0.45；0.3:1:0.5；0.3:1:0.55；0.3:1:0.6；0.3:1:0.65；0.3:1:0.7；0.35:1:0.2；0.35:1:0.25；0.35:1:0.3；0.35:1:0.35；0.35:1:0.4；0.35:1:0.45；0.35:1:0.5；0.35:1:0.55；0.35:1:0.6；0.35:1:0.65；0.35:1:0.7；0.4:1:0.2；0.4:1:0.25；0.4:1:0.3；0.4:1:0.35；0.4:1:0.4；0.4:1:0.45；0.4:1:0.5；0.4:1:0.55；0.4:1:0.6；0.4:1:0.65；0.4:1:0.7；0.45:1:0.2；0.45:1:0.25；0.45:1:0.3；0.45:1:0.35；0.45:1:0.4；0.45:1:0.45；0.45:1:0.5；0.45:1:0.55；0.45:1:0.6；0.45:1:0.65；0.45:1:0.7；0.5:1:0.2；0.5:1:0.25；0.5:1:0.3；0.5:1:0.35；0.5:1:0.4；0.5:1:0.45；0.5:1:0.5；0.5:1:0.55；0.5:1:0.6；0.5:1:0.65；0.5:1:0.7；0.55:1:0.2；0.55:1:0.25；0.55:1:0.3；0.55:1:0.35；0.55:1:0.4；0.55:1:0.45；0.55:1:0.5；0.55:1:0.55；0.55:1:0.6；0.55:1:0.65；0.55:1:0.7；0.6:1:0.2；0.6:1:0.25；0.6:1:0.3；0.6:1:0.35；0.6:1:0.4；0.6:1:0.45；0.6:1:0.5；0.6:1:0.55；0.6:1:0.6；0.6:1:0.65；0.6:1:0.7；0.65:1:0.2；0.65:1:0.25；0.65:1:0.3；0.65:1:0.35；0.65:1:0.4；0.65:1:0.45；0.65:1:0.5；0.65:1:0.55；0.65:1:0.6；0.65:1:0.65；0.65:1:0.7；0.7:1:0.2；0.7:1:0.25；0.7:1:0.3；0.7:1:0.35；0.7:1:0.4；0.7:1:0.45；0.7:1:0.5；0.7:1:0.55；0.7:1:0.6；0.7:1:0.65；或0.7:1:0.7。在某些实施方式中，组合物或婴儿配方组合物中的DHA:DPA(n-3):EPA比率为1:0.5:0.3。

在某些实施方式中，组合物或婴儿配方组合物中的长链n-3脂肪酸以源油的形式提供，其中源油包含含有至少约7重量％的DPA(n-3)的长链n-3脂肪酸。在其他实施方式中，源油包含含有至少约8重量％、9重量％、10重量％、11重量％、12重量％、13重量％、14重量％、15重量％、16重量％、17重量％、18重量％、19重量％、20重量％、21重量％、22重量％、23重量％、24重量％、25重量％、26重量％、27重量％、28重量％、29重量％、30重量％、31重量％、32重量％、33重量％、34重量％或35重量％的DPA(n-3)的长链n-3脂肪酸。

在某些实施方式中，婴儿配方组合物包含小于约3mg/L的量的二十碳五烯酸(EPA)。在某些实施方式中，婴儿配方组合物包含小于约60mg/L的量的EPA。在其他实施方式中，婴儿配方组合物包含约15mg/L至约30mg/L的EPA。在一些实施方式中，EPA:DHA比率高达1:1。

在某些实施方式中，婴儿配方组合物被配置为当施用于婴儿时提供至少约5mg/kg/天的DPA(n-3)。在一些实施方式中，婴儿配方组合物被配置为当施用于婴儿时提供约5mg/kg/天DPA(n-3)至约45mg/kg/天DPA(n-3)。

在所有前述实施方式的一些实施方式中，DPA(n-3)和/或DHA的来源选自由植物、油料种子、微生物、动物和前述物质的混合物组成的组。在一些实施方式中，微生物选自由藻类、细菌、真菌和原生生物组成的组。在一些实施方式中，微生物是鱼孢菌纲(Ichthyosporea)中的原生生物。在一些实施方式中，微生物是Sphaeroforma arctica。在其他实施方式中，微生物选自由破囊壶菌目(Thraustochytriales)、甲藻(dinoflagellates)和毛霉目(Mucorales)组成的组。在一些实施方式中，微生物选自由裂殖壶菌(Schizochytrium)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、隐甲藻(Crypthecodinium)和被孢霉(Mortierella)组成的组。

在其他实施方式中，该来源选自由转基因植物和转基因油料种子组成的组，该转基因植物和转基因油料种子选自由大豆、玉米、红花、向日葵、卡诺拉油菜籽(canola)、亚麻、花生、芥菜、油菜籽、鹰嘴豆、棉花、扁豆、白三叶草、橄榄、棕榈、琉璃苣、月见草、亚麻籽和烟草以及它们的混合物组成的组。

在其他实施方式中，该来源选自由转基因植物、转基因油料种子和转基因微生物组成的组，其中转基因包括引入聚酮合酶基因或其部分。如本领域技术人员所理解的，转基因油料种子是转基因植物的一部分。

在一些实施方式中，组合物中的DPA(n-3):DHA的比率通过将植物油、鱼油或微生物油与DHA:DPA(n-3)比率<0.7:1的第二微生物油混合而获得。在一些实施方式中，第二微生物油的DHA:DPA(n-3):EPA比率<0.7:1:<0.7。在一些实施方式中，第二微生物油由本文所述的一种或多种微生物产生。例如，第二微生物油可由选自由藻类、细菌、真菌和原生生物组成的组的微生物产生。在一些实施方式中，微生物是鱼孢菌纲中的原生生物，诸如，例如Sphaeroforma arctica。在一些实施方式中，微生物选自由破囊壶菌目、甲藻和被孢霉组成的组。在一些实施方式中，微生物选自由裂殖壶菌、破囊壶菌和隐甲藻组成的组。

本发明还提供了喂养人类或动物(包括人类婴儿)的方法，其包括向人类或动物或人类婴儿施用本发明的组合物。

本发明还提供了一种喂养人类或动物(包括人类婴儿)的方法，其包括将含有DPA(n-3)的组合物施用于人类或动物或人类婴儿，其中以至少约5mg DPA(n-3)/kg/天喂养人类或动物或人类婴儿。

在另外的实施方式中，提供了一种包含至少约7重量％的量的DPA(n-3)的微生物油，其中DPA(n-3):DHA比率大于0.2。在另外的实施方式中，提供了一种包含至少约7重量％的量的DPA(n-3)的微生物油，其中DPA(n-3):DHA比率大于1。

在一些实施方式中，微生物油包含约7至约11重量％或约8至约10重量％的量的DPA(n-3)。

在某些实施方式中，DPA(n-3):DHA比率为约0.2:1至约1:1，约0.3:1至约1:1，约0.4:1至约1:1，约0.5:1至约1:1，约0.6:1至约1:1，约0.7:1至约1:1，约0.2至约0.9，约0.2至约0.8，约0.3至约0.8，约0.2:1，约0.3:1，约0.4:1，约0.5:1，约0.6:1，约0.7:1，约0.8:1，约0.9:1或约1:1。

在一些实施方式中，微生物油包含长链n-3脂肪酸，该长链n-3脂肪酸包含按总脂肪酸的重量计至少约7％的DPA(n-3)。在一些实施方式中，微生物油包含长链n-3脂肪酸，该长链n-3脂肪酸包含按重量计至少约8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％或35％的DPA(n-3)。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约7％至约50％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约35％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约20％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约15％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约14％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约13％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约12％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约11％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约10％之间的DPA(n-3)，或按重量计约7％至约9％之间的DPA(n-3)。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约8％至约15％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约14％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约13％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约12％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约11％之间的DPA(n-3)，或按重量计约8％至约10％之间的DPA(n-3)。所有重量百分比均基于总脂肪酸的重量％。

在一些实施方式中，微生物油包含按重量计小于约5％的DHA，按重量计小于约4.5％的DHA，按重量计小于约4％的DHA，按重量计小于约3.5％的DHA，按重量计小于约3％的DHA，按重量计小于约2.5％的DHA，或按重量计小于约2％的DHA。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约1％至约5％之间的DHA，按重量计约1％至约4％之间的DHA，或按重量计约2％至约4％之间的DHA。所有重量百分比均基于总脂肪酸的重量％。

在一些实施方式中，微生物油包含按重量计小于约5％的EPA，按重量计小于约4.5％的EPA，按重量计小于约4％的EPA，按重量计小于约3.5％的EPA，按重量计小于约3％的EPA，按重量计小于约2.5％的EPA，或按重量计小于约2％的EPA。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约1％至约5％之间的EPA，按重量计约2％至约5％之间的EPA，或按重量计约3％至约5％之间的EPA。所有重量百分比均基于总脂肪酸的重量％。

在一些实施方式中，微生物油包含大于约20重量％，大于约21重量％，大于约22重量％，大于约23重量％，大于约24重量％，大于约25重量％，大于约26重量％，大于约27重量％，大于约28重量％，大于约29重量％，大于约30重量％，大于约31重量％的，大于约32重量％，大于约33重量％，大于约34重量％，或大于约35重量％的总脂肪含量。在一些实施方式中，微生物油包含约20至约40重量％之间，约20至约35重量％之间，约25至约40重量％之间，或约25至约35重量％之间的总脂肪含量。

在一些实施方式中，微生物油由选自由藻类、细菌、真菌和原生生物组成的组的微生物产生。在一些实施方式中，微生物是鱼孢菌纲中的原生生物。在一些实施方式中，微生物是Sphaeroforma arctica。在其他实施方式中，微生物选自由破囊壶菌目(Thraustochytriales)、甲藻(dinoflagellates)和毛霉目(Mucorales)组成的组。在一些实施方式中，微生物选自由裂殖壶菌(Schizochytrium)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、隐甲藻(Crypthecodinium)和被孢霉(Mortierella)组成的组。在一些实施方式中，微生物是转基因微生物，其中转基因包括引入聚酮合酶基因或其部分。

还提供了本文所述的包含油诸如微生物油的组合物。本文所述的包含微生物油的组合物的示例包括但不限于婴儿配方食品、膳食补充剂、食物组合物、饮料、治疗性饮品、营养饮品、化妆品、药物组合物等。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一张彩色附图。本专利或专利申请出版物的带有彩色附图的副本将在请求和支付必要费用后由专利局提供。

为了进一步理解本公开的性质、目的和优点，应结合附图参考以下具体实施方式，其中相同的附图标记表示相同的要素。

图1A和1B示出了所有测试菌株的DPA(n-3)百分比分布(图1A)与DPA(n-3)产量最高的菌株：MK 2847、MK 2855、MK 2857、MK 2866和MK 2867的DPA(n-3)百分比分布(图1B)的比较。

图2A-2D示出了来自所选微生物菌株MK 2847、MK 2855、MK 2857、MK 2866和MK2867的产量数据。图2A示出了22:5DPA(n-3)％的中值随时间的变化。图2B示出了22:6DHA％的中值(上图)和20:5EPA(n-3)％的中值(下图)随时间的变化。图2C示出了干重的中值(g/L)(上图)和作为FAME的脂肪％的中值(下图)随时间的变化。图2D示出了脂肪滴度的中值(g/L)(上图)和DPA(n-3)滴度的中值(g/L)(下图)随时间的变化。

图3A和3B示出了所选微生物菌株122RT-100-6H3、MK 2857、MK 2866和MK 2867在10％ CO

图4A和4B示出了所选微生物菌株122RT-100-6H3、MK 2857、MK 2866和MK 2867在10％ CO

图5A和5B示出了与其他生产菌株(9.1.5.5和GO 6.117)相比，所选微生物菌株122RT-100-6H3、MK 2857、MK 2867及其克隆(MK 2867-1和MK 2867-6)的生长(图5A)和脂质产生(图5B)。

图6A-6D示出了与其他生产菌株(9.1.5.5和GO 6.117)相比，所选微生物菌株122RT-100-6H3、MK 2857、MK 2867及其克隆(MK 2867-1和MK 2867-6)的FAME和PUFA产生。图6A示出了作为FAME的平均脂肪％随时间的变化。图6B示出了22:5DPA(n-3)％的中值随时间的变化。图6C示出了20:5EPA(n-3)％的中值随时间的变化。图6D示出了22:6DHA％的中值随时间的变化。

图7A和7B示出了MK 2867克隆(MK 2867-1和MK 2867-6)与亲本菌株的比较。图7A示出了22:5DPA(n-3)％的中值(上图)、作为FAME的中值脂肪％(中图)和干重(g/L)随时间的变化。图7B示出了两个克隆的各种参数相对于MK 2867亲本菌株的差异％。

具体实施方式

在进一步描述本公开之前，应当理解，本公开不限于以下描述的本公开的特定实施方式，因为可对特定实施方式作出变化并且仍落在所附权利要求书的范围内。还应当理解，所使用的术语是为了描述特定实施方式的目的，而不旨在进行限制。相反，本公开的范围将由所附权利要求书确定。

在本说明书和所附权利要求书中，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“该”均包括复数形式。除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语均具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。

如本文所用，量/kg/天是指每天以千克计的量除以人、动物或婴儿的体重。如本文所用，量/L是指一升旨在供婴儿食用的组合物(例如，婴儿配方食品)中的量，即，如果婴儿配方组合物被制造成干粉或浓缩液体，则当干粉或浓缩液体已与足够的液体混合以获得旨在供婴儿食用的婴儿配方组合物时，测量该量/L。当本文使用脂肪酸和其他成分的来源和量或范围时，旨在包括其中的所有组合和子组合以及具体实施方式。

除非另有说明，否则所有重量百分比均基于总脂肪酸的重量％。

在一个实施方式中，本发明涉及制备补充有LC-PUFA的婴儿配方产品和婴儿配方组合物的方法。根据美国法律的定义，婴儿配方食品是一种声称或表示仅作为婴儿食物用于特殊膳食用途的食物，因为其模拟人乳或适合作为人乳的完全或部分替代品。

提供给婴儿的脂质的质量对于生长、发育和未来的健康至关重要(Krohn等人，Macronutrient requirements for growth:fats and fatty acids.Nutrition inPediatrics:Basic Science,Clinical,Applications.Toronto:BC Decker；2008)。世界卫生组织(WHO)认为，母乳喂养是喂养婴儿的最佳选择。因此，人乳的组成为母乳替代品的理想组成提供了一些指导。成熟人乳通常含有约34％至47％的饱和脂肪酸，主要是棕榈酸(17％-25％)，约31％至43％的单不饱和脂肪酸，约12％至26％的n-6PUFA，以及约0.8％至3.6％的n-3PUFA(B.Strandvik等人，Journal of Pediatric Gastroenterology andNutrition(2015)61:1,8-17)。目前使用的大多数婴儿配方食品中的脂肪都是基于植物油的混合物，补充有来自鱼和微生物(包括藻类)油的长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，因此其组成远不如人乳脂肪复杂。例如，C22:5n-3二十二碳五烯酸(DPA(n-3))是人乳中含量第二高的LC-PUFA，仅次于C22:6n-3二十二碳六烯酸(DHA)(Lubetzky等人，Isr Med AssocJ.2012年1月；14(1):7-10；Nishimura等人，J Pediatr2013年5-6月；89(3):263-8；Martin等人，Matern Child Nutr.2012年7月；8(3):404-18；Zou等人，J Agric Food Chem.2013年7月10日；Wu等人，J Chin Med Assoc.2010年11月；73(11):581-8；Tijerina-Sáenz等人，Acta Paediatr.2009年11月；98(11):1793-8；Szlagatzys-Sidorkiewicz等人，ActaPaediatr.2013年8月；102(8):e353-9；Bobinski等人，Eur J Clin Nutr.2013年9月；67(9):966-71；Huang等人，Lipids Health Dis.2013年3月6日；12:27；Cruz-Hernandez等人，J Chromatogr.A.2013年4月5日；1284:174-9；Roy等人，Int J Food Sci Nutr.2012年12月；63(8):895-901；Samur等人，Lipids.2009年5月；44(5):405-13；Peng等人，Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids.2009年11月-12月；81(5-6):325-30；Berenhauser等人，Int J Food Sci Nutr.2012年5月；63(3):318-25)，但在婴儿配方食品中不存在。鉴于越来越多的证据表明LC-PUFA具有独立和互补的作用(S.C.DyallFrontiers in aging neuroscience(2015),7,52)，非常期望在婴儿配方食品中存在模仿人乳组合物的DPA(n-3)。

由于没有报道具有优选地为1:0.5:0.3的DHA:DPA(n-3):EPA比率的天然植物油、鱼油或微生物油，因此获得此类油的唯一选择是选择性地富集天然油的DPA(n-3)含量或用DPA(n-3)含量高的油补充天然油。因为获得所需DHA:DPA(n-3):EPA比率的选择性富集方法在技术上非常具有挑战性，因此在经济上是不可行的，其他人已经尝试通过改变产生油的微生物的生长条件来改变天然微生物油的比率。例如，Li等人(Appl Biochem Biotechnol(2017)182,67–81)将DHA:DPA(n-3)比率从1:0.2改善到1:0.4。然而，该油缺少EPA(DHA:DPA(n-3):EPA为1:0.4:>0.01)，并且DPA(n-3)水平仍然过低，不能用于为其他油补充DPA(n-3)。另一种方法是筛选产生具有高DPA(n-3)含量的油的微生物(Singh和Ward；Journal ofIndustrial Microbiology&Biotechnology(1998)20,187–191)，对微生物进行了筛选，发现棘腐霉(Pythium acanthicum)产生的DPA(n-3)量比DHA高得多，但仍产生高量的EPA(DPA(n-3):EPA比率为1:0.95)。

在一个实施方式中，本发明提供了一种解决方案，其通过提供来自微生物来源的富含天然DPA(n-3)的油来获得具有优选的1:0.5:0.3的DHA:DPA(n-3):EPA比率的组合物，包括但不限于婴儿配方组合物，所述微生物来源产生含有DHA、DPA和EPA的油，其中DHA:DPA(n-3):EPA比率为<0.7:1:<0.7(即，它们含有非零水平的DHA和EPA)。这些油避免了昂贵的富集过程，并且可与其他天然油混合以获得模仿人乳的LC-PUFA组成的婴儿配方食品。

如上所述，已建议将LC-PUFA以匹配或接近模拟人类母乳中发现的LC-PUFA谱的量包含在婴儿配方食品中。本发明的配方是基于这样一种认识，即补充有DPA(n-3)以匹配或接近模拟人类母乳中存在的DPA(n-3)的量的婴儿配方食品比目前可获得的包含LC-PUFA的婴儿配方食品具有显著优势。

由于本发明的婴儿配方食品包含多种组分，包括LC-PUFA，因此应当理解，婴儿配方食品的不同实施方式可通过参考一种或多种组分或此类组分的比率来描述。例如，组合物中DPA(n-3)的量可表示为与DHA和/或EPA的比率，或表示为配方食品中包含的DPA(n-3)的浓度，例如，在一升旨在供婴儿食用的配方食品中的浓度。也可基于期望的DPA(n-3)血浆水平，通过使用组合物中DPA(n-3)的量来描述婴儿配方食品。

因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种婴儿配方组合物，其包含的DPA(n-3)的量类似于在人类母乳中发现的量。已经表明，人类母乳中的DPA(n-3)含量可随时间变化(例如，初乳相对于成熟母乳)，并且还可以根据个体和/或环境而变化。因此，包含在本发明的婴儿配方组合物中的DPA(n-3)的量也可以变化。在一些实施方式中，婴儿配方组合物包含占配方中总脂质含量的百分比为0.06％至0.75％的DPA(n-3)。在一些实施方式中，婴儿配方组合物包含占配方中总脂质含量的百分比为0.14％至0.29％的DPA(n-3)。

在一些实施方式中，组合物中的DPA(n-3):DHA的比率大于0.2:1。在一些实施方式中，组合物中的DPA(n-3):DHA的比率大于约0.3:1，大于约0.4:1，大于约0.5:1，大于约0.6:1，大于约0.7:1，或大于约0.8:1。

在一些实施方式中，组合物(包括但不限于婴儿配方组合物)中的DPA(n-3):DHA比率为约0.2:1至约1:1，约0.3:1至约1:1，约0.4:1至约1:1，约0.5:1至约1:1，约0.6:1至约1:1，约0.7:1至约1:1，约0.2至约0.9，约0.2至约0.8，约0.3至约0.8，约0.2:1，约0.3:1，约0.4:1，约0.5:1，约0.6:1，约0.7:1，约0.8:1，约0.9:1，或约1:1。

在一些实施方式中，组合物(包括但不限于婴儿配方组合物)中的DPA(n-3):DHA:EPA比率为1:0.5:0.3。

在一些实施方式中，组合物中的长链n-3脂肪酸在源油中提供，其中源油包含长链n-3脂肪酸，该长链n-3脂肪酸包含按重量计至少约7％的DPA(n-3)。在其他实施方式中，源油包含长链n-3脂肪酸，该长链n-3脂肪酸其包含至少约8重量％的DPA(n-3)，至少约9重量％的DPA(n-3)，至少约10重量％的DPA(n-3)，至少约15重量％的DPA(n-3)，至少约20重量％的DPA(n-3)，至少约25重量％的DPA(n-3)，至少约30重量％的DPA(n-3)，或至少约35重量％的DPA(n-3)。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约7％至约50％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约35％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约20％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约15％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约14％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约13％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约12％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约11％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约10％之间的DPA(n-3)，或按重量计约7％至约9％之间的DPA(n-3)。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约8％至约15％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约14％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约13％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约12％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约11％之间的DPA(n-3)，或按重量计约8％至约10％之间的DPA(n-3)。

在一些实施方式中，源油包含按重量计小于约5％的DHA，按重量计小于约4.5％的DHA，按重量计小于约4％的DHA，按重量计小于约3.5％的DHA，按重量计小于约3％的DHA，按重量计小于约2.5％的DHA，或按重量计小于约2％的DHA。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约1％至约5％之间的DHA，按重量计约1％至约4％之间的DHA，或按重量计约2％至约4％之间的DHA。

在某些实施方式中，DPA(n-3):DHA比率为约0.2:1至约1:1，约0.3:1至约1:1，约0.4:1至约1:1，约0.5:1至约1:1，约0.6:1至约1:1，约0.7:1至约1:1，约0.2至约0.9，约0.2至约0.8，约0.3至约0.8，约0.2:1，约0.3:1，约0.4:1，约0.5:1，约0.6:1，约0.7:1，约0.8:1，约0.9:1或约1:1。

在一些实施方式中，源油中的DHA:DPA(n-3):EPA的比率为<0.7:1:<0.7。

在某些实施方式中，婴儿配方组合物包含至少20mg/L的DHA或至少40mg/L的DHA。在其他实施方式中，婴儿配方组合物包含约40至约140mg/L的DHA，约20至约200mg/L的DHA。在其他实施方式中，组合物包含小于约140mg/L的DHA或小于约200mg/L的DHA。

在某些实施方式中，婴儿配方组合物包含至少约7mg/L的DPA(n-6)，至少约13mg/L的DPA(n-6)，至少约26mg/L的DPA(n-6)，至少约40mg/L的DPA(n-6)，至少约53mg/L的DPA(n-6)，或至少约66mg/L的DPA(n-6)，至少约80mg/L的DPA(n-6)，至少约100mg/L的DPA(n-6)，至少约120mg/L的DPA(n-6)。在其他实施方式中，组合物包含小于约240mg/L的DPA(n-6)，小于约220mg/L的DPA(n-6)，或小于约200mg/L的DPA(n-6)。

在某些其他实施方式中，婴儿配方组合物包含小于约3mg/L的量的二十碳五烯酸(EPA)。在某些其他实施方式中，婴儿配方组合物包含小于约60mg/L的量的EPA。在其他实施方式中，婴儿配方组合物包含约15mg/L至约30mg/L的EPA。在一些实施方式中，EPA:DHA比率高达1:1。

在某些其他实施方式中，婴儿配方组合物被配制为在向婴儿施用时提供至少约5mg/kg/天的DPA(n-3)。在某些实施方式中，婴儿配方组合物被配制为在向婴儿施用时提供约5mg/kg/天的DPA(n-3)至约45mg/kg/天的DPA(n-3)。

本发明还提供了一种制备组合物的方法，其包括将营养组分和长链n-3脂肪酸组合；其中该长链n-3脂肪酸包含DPA(n-3)和DHA；其中DPA(n-3):DHA的比率为约0.2:1至约1:1。通过该方法制备的婴儿配方组合物也包括在本发明中。

在一些实施方式中，提供了一种制备组合物的方法，其包括将营养组分和油共混物组合，其中油共混物包含第一油和第二油，第一油包含植物油、鱼油或微生物油中的一者或多者，其中第二油是DHA:DPA(n-3)比率为<0.7:1的微生物油，优选DHA:DPA(n-3):EPA比率为<0.7:1:<0.7的微生物油。通过该方法制备的组合物也包括在本发明中。

本文提及的DPA、DHA和其他PUFA，诸如ARA和EPA，可以是天然脂质中发现的任何常见形式，包括但不限于三酰基甘油、二酰基甘油、单酰基甘油、磷脂、游离脂肪酸、酯化脂肪酸或这些脂肪酸的天然或合成衍生物形式(例如，脂肪酸的钙盐，乙酯等)。如在本发明中所用，提及的包含PUFA的油可以指仅包含单一PUFA诸如DHA的油或包含两种或更多种PUFA诸如DHA和EPA或DHA和DPA的混合物的油。

在本发明的组合物和方法中，包含至少一种PUFA的油的优选来源包括微生物来源。用于使包含营养物和/或PUFA的微生物生长的微生物来源和方法是本领域已知的(Industrial Microbiology and Biotechnology,第2版,1999,American Society forMicrobiology)。优选地，微生物在发酵罐中的发酵培养基中培养。本发明的方法和组合物适用于产生任何种类的营养物或所需组分的任何工业微生物，诸如，例如藻类、原生生物、细菌和真菌(包括酵母)。

微生物来源可包括微生物，诸如藻类、细菌、真菌和/或原生生物。优选的生物体包括选自由以下组成的组的那些：金藻(诸如茸鞭生物(Stramenopiles)界的微生物)、绿藻、硅藻、甲藻(诸如甲藻纲的微生物，包括隐甲藻属的成员，诸如，例如寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii))、酵母以及毛霉(Mucor)属和被孢霉(Mortierella)属的真菌，包括但不限于高山被孢霉(Mortierella alpina)和Mortierella sect.schmuckeri。微生物组茸鞭生物的成员包括微藻和藻样微生物，包括以下微生物组：Hamatores、Proteromonads、Opalines、Develpayella、Diplophrys、Labrinthulids、Thraustochytrids，Biosecids、Oomycetes、Hypochytridiomycetes、Commation、Reticulosaera、Pelagomonas、Pelagococcus、Ollicola、Aureococcus、Parmales、Diatoms、Xanthophytes、Phaeophytes、Eustigmatophytes、Raphidophytes、Synurids、Axodines(包括Rhizochromulinaales、Pedinellales、Dictyochales)、Chrysomeridales、Sarcinochrysidales、Hydrurales、Hibberdiales和Chromulinales。破囊壶菌包括裂殖壶菌属(物种包括aggregatum、limnaceum、mangrovei、minutum、octosporum)、破囊壶菌属(物种包括arudimentale、aureum、benthicola、globosum、kinnei、motivum、multirudimentale、pachydermum、proliferum、roseum、striatum)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)*(物种包括amoeboidea、kerguelensis、minuta、profunda、radiate、sailens、sarkariana、schizochytrops、visurgensis、yorkensis)、不动壶菌属(Aplanochytrium)(物种包括haliotidis、kerguelensis、profunda、stocchinoi)、日本壶菌属(Japonochytrium)(物种包括marinum)、阿尔托尼氏壶菌属(Althornia)(物种包括

本文已经发现，鱼孢菌纲的原生生物是DPA(n-3)的优良来源。因此，在本发明的组合物和方法中，包含至少一种PUFA的油的另一优选来源包括鱼孢菌纲的原生生物。鱼孢菌纲中的原生生物的示例包括但不限于鱼孢霉目(Ichthyophonida)，诸如Creolimaxfragrantissima、Sphaeroforma、Anurofeca richardsi、Psoropermium、Caulleryamesnili、Pirum gemmata、Abeoforma whisleri、Amoebidium、Paramoebidium、Eccrinales和Icthyophonus；以及肤孢虫目(Dermocystida)，诸如Rhinosporidium seeberi、Dermocystidium percae、Sphaerothecum destruens、Amphibiothecum penneri、Amphibiocystidium ranae和Dermocystidium salmonis。特别优选的是作为包含至少一种PUFA的油的来源的Sphaeroforma arctica。

虽然本发明的方法可用于产生可在多种微生物中产生的PUFA形式，但为了简洁、方便和说明起见，本发明的具体实施方式将讨论用于使能够产生包含ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸的脂质的微生物，特别是能够产生DHA(或密切相关的化合物诸如DPA、EPA或ARA)的微生物生长的方法。更优选地，微生物选自由具有ATCC编号20888、ATCC编号20889、ATCC编号20890、ATCC编号20891和ATCC编号20892的识别特征的微生物组成的组。还优选的是施氏被孢霉(Mortierella schmuckeri)的菌株(例如，包括具有ATCC 74371的识别特征的微生物)和高山被孢霉(例如，包括具有ATCC 42430的识别特征的微生物)的菌株。还优选的是寇氏隐甲藻的菌株，包括具有ATCC编号30021、30334-30348、30541-30543、30555-30557、30571、30572、30772-30775、30812、40750、50050-50060和50297-50300的识别特征的微生物。还优选的是衍生自前述任一者的突变菌株以及它们的混合物。产油微生物也是优选的。如本文所用，“产油微生物”被定义为能够以脂质形式积累大于其细胞重量20％的微生物。产生PUFA的转基因微生物也适用于本发明。这些可包括已经过基因改造的天然产生PUFA的微生物以及不天然产生PUFA但已经过基因改造以产生PUFA的微生物。

合适的生物体可从许多可用的来源获得，包括从自然环境中收集。例如，美国模式培养物保藏中心(American Type Culture Collection)目前列出了许多可公开获得的上述微生物菌株。如本文所用，任何生物体或任何特定类型的生物体包括野生菌株、突变体或重组类型。培养或生长这些生物体的生长条件是本领域已知的，并且这些生物体中的至少一些的合适生长条件公开于例如美国专利号5,130,242、美国专利号5,407,957、美国专利号5,397,591、美国专利号5,492,938和美国专利号5,711,983中，这些专利全都以引用方式整体并入本文。

在本发明的组合物和方法中，包含至少一种PUFA的油的另一优选来源包括动物来源。因此，在一些实施方式中，包含至少一种PUFA的油是水生动物油。动物来源的示例包括水生动物(例如鱼、海洋哺乳动物和甲壳类动物，诸如磷虾和其他磷虾类(euphausids))和从动物组织(例如脑、肝、眼等)提取的脂质以及动物产品，诸如蛋或奶。

本发明还提供了包含微生物油的共混物以及微生物油和植物油的共混物的组合物。

婴儿配方食品的营养成分是本领域已知的，本领域技术人员能够调节配方组合物以包括本发明的PUFA水平和比率。例如，婴儿配方食品通常包含蛋白质组分，其占婴儿配方食品的总热量的约6％至约25％；碳水化合物组分，其占婴儿配方食品的总热量的约35％至约50％；和脂质组分，其占婴儿配方食品的总热量的约30％至约50％。这些范围仅作为示例提供，并不旨在限制。

合适的脂肪来源的示例通常包括高油酸红花油、大豆油、分馏椰子油(中链甘油三酯，MCT油)、高油酸向日葵油、玉米油、卡诺拉油菜籽油、椰子油、棕榈和棕榈仁油、水产动物油、棉籽油、核桃油、小麦胚芽油、芝麻油、鱼肝油和花生油。可酌情使用上文列出的任何单一脂肪或它们的任何组合。其他合适的脂肪对本领域技术人员而言是显而易见的。

婴儿配方食品的其他组分通常包括例如蛋白质、碳水化合物、维生素和矿物质。适用于婴儿的蛋白质来源的示例通常包括酪蛋白、乳清、脱脂炼乳、脱脂乳、大豆、豌豆、大米、玉米、水解蛋白质、游离氨基酸、在与蛋白质的胶体悬浮液中含有钙的蛋白质来源。可酌情使用上文列出的任何单一蛋白质或它们的任何组合。其他合适的蛋白质对本领域技术人员而言是显而易见的。

婴儿配方食品的第三组分是碳水化合物来源。碳水化合物是婴儿生长所需的容易获得的能量的主要来源，并且保护婴儿免于组织分解代谢。在人乳和大多数标准乳基婴儿配方食品中，碳水化合物是乳糖。可用于婴儿配方食品的碳水化合物种类繁多。适用于婴儿的碳水化合物的示例通常包括水解玉米淀粉、麦芽糖糊精、葡萄糖聚合物、蔗糖、乳糖、玉米糖浆、玉米糖浆固体、大米糖浆、葡萄糖、果糖、高果糖玉米糖浆和难消化的低聚糖诸如低聚果糖(FOS)。可酌情使用上文列出的任何单一碳水化合物或它们的任何组合。其他合适的碳水化合物对本领域技术人员而言是显而易见的。

本发明的婴儿配方食品通常包括补充的维生素和矿物质。可添加到本发明的婴儿配方食品中的维生素和矿物质的示例通常包括维生素A、维生素B

本发明的婴儿配方食品可制备成任何适用于婴儿的产品形式，包括可重构粉末、即饮液体和可稀释液体浓缩物，这些产品形式在营养配方食品领域都是熟知的。如本申请中所用，婴儿配方组合物中存在的组分的量是指当配方食品准备好供婴儿食用时的量。应当理解，在可重构粉末或可稀释液体浓缩物的情况下，各组分的量将进行调节，使得在婴儿配方组合物重构或稀释时，该量如本文所述。因此，例如，提到通过对一份婴儿配方食品例如添加一份水来稀释的婴儿配方组合物，其中该婴儿配方组合物在准备好供食用时具有给定的组分浓度，旨在涵盖在通过添加水准备好供食用之前具有两倍于给定量的组分浓度的婴儿配方组合物。制备婴儿配方食品的方法是本领域技术人员已知的。例如，含PUFA的油可在制造过程中的合适点直接添加到液体配方组合物中。

根据本发明的婴儿配方食品可任选地进行灭菌，并随后在即食基础上使用或可作为浓缩物储存。可通过对如上制备的液体配方食品进行喷雾干燥来制备浓缩物，并且该配方食品可通过再水化浓缩物来进行重构。婴儿配方浓缩物是稳定的液体并具有合适的保存期限。

在另一个实施方式中，油在添加到配方组合物中之前微囊化。用于PUFA的微囊包封的包衣的选择取决于其无毒性、所需的粒度和在此类组合物的加工条件下的稳定性，特别是灭菌。任何常规可接受的基本上不透氧的包衣都可用于本发明。此类常规的微囊化方法和包衣材料完全在本领域技术人员的知识范围内，并且具体的微囊化方法和包衣不是本发明所特有的。这些方法中的一些包括喷雾干燥，诸如其中将PUFA乳化到聚合物溶液中，并喷雾干燥以制备细颗粒。约250μm的颗粒适于包含在根据本发明的婴儿配方食品中。当将PUFA掺入到可熔脂肪或蜡中时，因为乳液仅需冷冻到其熔点以下以形成颗粒，因此该方法称为喷雾-冷冻。可用于包封PUFA的另一种包封方法是凝聚。其他合适的技术包括界面聚合、热熔包封、相分离包封(溶剂去除和溶剂蒸发)、自发乳化、溶剂蒸发微囊包封、溶剂去除微囊包封、凝聚和低温微球形成和相转化纳米包封(PIN)。通常，微囊包封的PUFA形成自由流动的粉末，其适于添加到组合物的粉末实施方式中。这些和其他包封技术以及包封油描述于美国临时专利申请序列号60/805,590中，其全文以引用方式并入本文中。

对于本发明的粉末实施方式，上述使用方法还包括用合适的水性液体，优选水将粉末重构。此类稀释可以是足以提供具有本文详细描述的特征的LC-PUFA强化的婴儿配方食品的量。对于本发明的粉末实施方式，此类粉末通常为可流动的或基本上可流动的颗粒组合物的形式，或至少为可容易地用勺子或类似的其他装置舀取和测量的颗粒组合物的形式，其中该组合物可容易地由预期使用者用合适的水性流体(通常为水)重构以形成液体婴儿配方食品。在本文中，“立即”使用通常是指在约48小时内，最通常在约24小时内，优选在重构后立即使用。这些粉末实施方式包括喷雾干燥的、附聚的、干混的或其他已知的或以其他方式有效的颗粒形式。产生适于一次食用的体积所需的营养粉末的量可以变化。

本发明还提供了喂养人类或动物(包括人类婴儿或幼年动物)的方法，其包括向人类或动物施用本发明的组合物。例如，本发明提供了一种喂养人类或动物(包括人类婴儿或幼年动物)的方法，该方法包括向人类或动物施用组合物，其中该组合物包含长链n-3脂肪酸，并且其中该长链n-3脂肪酸包含二十二碳六烯酸(DHA)、二十二碳五烯酸(DPA(n-3))和任选的二十碳五烯酸(EPA)；任选地包含长链n-6脂肪酸。在该实施方式中，DPA(n-3):DHA的比率大于0.2。在另一个实施方式中，本发明提供了一种喂养人类或动物的方法，其包括向人类或动物施用组合物，其中该组合物包含长链n-3脂肪酸，其中该组合物中的长链n-3脂肪酸以源油形式提供，其中该源油包含长链n-3脂肪酸，该长链n-3脂肪酸包含至少约7重量％的DPA(n-3)，源油中的DHA:DPA(n-3)比率为<0.7:1。当施用于婴儿或幼年动物时，该组合物可被配制为提供至少约5mg/kg/天的DPA(n-3)。在另一个实施方式中，本发明提供了一种喂养人类或动物的方法，其包括向人类或动物施用组合物，其中该组合物包含DPA(n-3)，其中该组合物还包含DHA；并且其中DPA(n-3):DHA的比率大于0.2:1。

本发明还提供了一种喂养婴儿的方法，其包括向婴儿施用含有营养组分、DHA和DPA(n-3)的婴儿配方组合物，其中以至少约5mg DPA(n-3)/kg/天喂养婴儿。在一些实施方式中，本发明提供了一种喂养婴儿的方法，其包括向婴儿施用本文所述的任何婴儿配方组合物。

在一些实施方式中，该方法还包括将含有营养组分以及DHA和DPA(n-3)的婴儿配方食品粉末溶解在水中，以获得包含所述营养组分和所述LC-PUFA的溶液。

本发明的营养配方食品可包装和密封在一次性或多次使用的容器中，然后在环境条件下储存最长至约36个月或更长，更通常约12至约24个月。对于多次使用的容器，这些包装可被打开并且然后被覆盖，以供最终使用者重复使用，条件是被覆盖的包装然后被储存在环境条件下(例如，避免极端温度)并且内容物在约一个月左右内使用。

早产儿需要附加的营养物以支持其生长，并且处于与早产相关的疾病的风险中。通常用专门为这些婴儿设计的商业婴儿配方食品或其母乳喂养早产儿。喂养早产儿的另一种方法是用乳或配方食品强化剂补充早产儿乳、库存的足月儿乳、其他合适的乳或婴儿配方食品。此类补充的乳或配方食品可更充分地提供若干营养物的水平，以满足这些婴儿的需要。本申请的另一个发明提供了包含LC-PUFA的早产儿营养强化剂组合物。具体地讲，早产儿营养强化剂组合物包含DPA(n-3)，并且在其他实施方式中，可包含DHA、EPA和/或ARA。强化剂组合物通常是粉末或油，其可任选地补充一定水平的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质。强化剂组合物被配制为当添加到乳或配方食品中时提供如上文针对婴儿配方组合物所述的LC-PUFA的量和比率。例如，强化乳或配方组合物可包含阈值量的DPA(n-3)，可具有为约1:0.3至1:0.8的DHA:DPA(n-3)比率，或具有来自本文所述的各种发明的其他限制。强化剂组合物可以是所得强化乳或配方食品中DPA(n-3)、DHA、EPA和/或ARA LC-PUFA中的一者或多者的唯一来源，或者可补充非强化乳或配方食品中LC PUFA的量。本申请的另一个发明是一种制备强化早产儿乳或配方食品的方法，其包括将婴儿乳或配方食品与所述的组合物组合。

本申请的另一个发明是一种向早产儿提供补充营养物的方法，其包括向早产儿施用强化乳或配方食品，其中通过向婴儿乳或配方食品中添加如上所述的早产儿营养强化剂组合物来制备该乳或配方食品。

本申请的另一个发明是一种用于促进早产儿生长的方法，其包括向早产儿施用强化乳或配方食品，其中通过向婴儿乳或配方食品中添加如上所述的早产儿营养强化剂组合物来制备该乳或配方食品。

本发明还提供了一种补充有LC-PUFA的婴儿膳食补充剂组合物。具体地讲，该婴儿膳食补充剂组合物包含DPA(n-3)，并且在其他实施方式中，可包含DHA、EPA和/或ARA。婴儿膳食补充剂还可任选地补充一定水平的蛋白质、脂肪、维生素和矿物质。婴儿膳食补充剂组合物被配制为提供如上文针对婴儿配方组合物所述的LC-PUFA的量和比率，特别是包括当此类补充剂与婴儿配方食品分开食用时的每日摄入参数。然而，在一些实施方式中，可将婴儿膳食补充剂添加到婴儿配方食品中。本发明主题的婴儿膳食补充剂可被配制为在24小时期间内一次或多次以部分剂量(即分次剂量)施用，在24小时期间内施用单剂量，在24小时期间内施用双倍剂量，或在24小时期间内施用双倍剂量以上。分次剂量、双倍剂量或其他多倍剂量可在24小时期间同时服用或在不同时间服用。

可用于婴儿膳食补充剂组合物发明的对婴儿适口的口服制剂组合物是本领域已知的。婴儿膳食补充剂组合物可例如与惰性稀释剂或与可吸收的可食用载体一起口服施用，或者可将其包封在硬壳或软壳明胶胶囊中，或者可将其压制成片剂，或者可将其直接与膳食的食物混合。对于口服施用，可将婴儿膳食补充剂组合物与赋形剂混合，并以可食用片剂、含片、锭剂、胶囊、酏剂、混悬剂、糖浆、糯米纸囊剂等形式使用。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可包含以下：粘合剂，诸如黄蓍胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，诸如磷酸二钙；崩解剂，诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸等；润滑剂，诸如硬脂酸镁；以及甜味剂，诸如蔗糖、乳糖或糖精，或调味剂，诸如薄荷、冬青油或樱桃调味剂。当剂量单位形式是胶囊时，除了上述类型的材料之外，它还可含有液体载体。各种其他材料可作为包衣存在或以其他方式改变剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可用虫胶、糖或两者包衣。糖浆或酏剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料以及调味剂诸如樱桃或橙调味剂。水包油乳剂可能更适合于婴儿口服使用，因为它们是水混溶性的，因此它们的油性被掩盖。此类乳剂在药物科学中是众所周知的。

在本发明的另一个实施方式中，提供了包含至少约7重量％的DPA(n-3)的量的微生物油，其中DPA(n-3):DHA比率大于0.2。

在一些实施方式中，微生物油包含约7至约11重量％或约8至约10重量％的量的DPA(n-3)。

在一些实施方式中，DPA(n-3):DHA比率为约0.2:1至约1:1，约0.3:1至约1:1，约0.4:1至约1:1，约0.5:1至约1:1，约0.6:1至约1:1，约0.7:1至约1:1，约0.2至约0.9，约0.2至约0.8，约0.3至约0.8，约0.2:1，约0.3:1，约0.4:1，约0.5:1，约0.6:1，约0.7:1，约0.8:1，约0.9:1，或约1:1。

在一些实施方式中，微生物油包含长链n-3脂肪酸，该长链n-3脂肪酸包含至少约7重量％的DPA(n-3)。在一些实施方式中，微生物油包含长链n-3脂肪酸，该长链n-3脂肪酸包含至少约8重量％的DPA(n-3)，至少约9重量％的DPA(n-3)，至少约10重量％的DPA(n-3)，至少约15重量％的DPA(n-3)，至少约20重量％的DPA(n-3)，至少约25重量％的DPA(n-3)，至少约30重量％的DPA(n-3)或至少约35重量％的DPA(n-3)。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约7％至约50％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约35％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约20％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约15％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约14％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约13％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约12％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约11％之间的DPA(n-3)，按重量计约7％至约10％之间的DPA(n-3)，或按重量计约7％至约9％之间的DPA(n-3)。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约8％至约15％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约14％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约13％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约12％之间的DPA(n-3)，按重量计约8％至约11％之间的DPA(n-3)，或按重量计约8％至约10％之间的DPA(n-3)。

在一些实施方式中，微生物油包含按重量计小于约5％的DHA，按重量计小于约4.5％的DHA，按重量计小于约4％的DHA，按重量计小于约3.5％的DHA，按重量计小于约3％的DHA，按重量计小于约2.5％的DHA，或按重量计小于约2％的DHA。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约1％至约5％之间的DHA，按重量计约1％至约4％之间的DHA，或按重量计约2％至约4％之间的DHA。

在一些实施方式中，微生物油包含按重量计小于约5％的EPA，按重量计小于约4.5％的EPA，按重量计小于约4％的EPA，按重量计小于约3.5％的EPA，按重量计小于约3％的EPA，按重量计小于约2.5％的EPA，或按重量计小于约2％的EPA。在一些实施方式中，微生物油包含按重量计约1％至约5％之间的EPA，按重量计约2％至约5％之间的EPA，或按重量计约3％至约5％之间的EPA。

在一些实施方式中，微生物油包含大于约20重量％，大于约21重量％，大于约22重量％，大于约23重量％，大于约24重量％，大于约25重量％，大于约26重量％，大于约27重量％，大于约28重量％，大于约29重量％，大于约30重量％，大于约31重量％的，大于约32重量％，大于约33重量％，大于约34重量％，或大于约35重量％的总脂肪含量。在一些实施方式中，微生物油包含约20至约40重量％之间，约20至约35重量％之间，约25至约40重量％之间，或约25至约35重量％之间的总脂肪含量。

在一些实施方式中，微生物油由本文所述的一种或多种微生物产生。优选的微生物包括选自由以下组成的组的那些：金藻(诸如茸鞭生物界的微生物)、绿藻、硅藻、甲藻(诸如甲藻纲的微生物，包括隐甲藻属的成员，诸如，例如寇氏隐甲藻)、酵母以及毛霉属和被孢霉属的真菌，包括但不限于高山被孢霉和施氏被孢霉。微生物组茸鞭生物的成员包括微藻和藻样微生物，包括以下微生物组：Hamatores、Proteromonads、Opalines、Develpayella、Diplophrys、Labrinthulids、Thraustochytrids、Biosecids、Oomycetes、Hypochytridiomycetes、Commation、Reticulosaera、Pelagomonas、Pelagococcus、Ollicola、Aureococcus、Parmales、Diatoms、Xanthophytes、Phaeophytes、Eustigmatophytes、Raphidophytes、Synurids、Axodines(包括Rhizochromulinaales、Pedinellales、Dictyochales)、Chrysomeridales、Sarcinochrysidales、Hydrurales、Hibberdiales和Chromulinales。破囊壶菌包括裂殖壶菌属(物种包括aggregatum、limnaceum、mangrovei、minutum、octosporum)、破囊壶菌属(物种包括arudimentale、aureum、benthicola、globosum、kinnei、motivum、multirudimentale、pachydermum、proliferum、roseum、striatum)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)*(物种包括amoeboidea、kerguelensis、minuta、profunda、radiate、sailens、sarkariana、schizochytrops、visurgensis、yorkensis)、不动壶菌属(Aplanochytrium)(物种包括haliotidis、kerguelensis、profunda、stocchinoi)、日本壶菌属(Japonochytrium)(物种包括marinum)、阿尔托尼氏壶菌属(Althornia)(物种包括

本文已经发现，鱼孢菌纲的原生生物是DPA(n-3)的优良来源。因此，另一种优选的微生物是Ichthyospora纲的原生生物。鱼孢菌纲中的原生生物的示例包括但不限于鱼孢霉目(Ichthyophonida)，诸如Creolimax fragrantissima、Sphaeroforma、Anurofecarichardsi、Psoropermium、Caullerya mesnili、Pirum gemmata、Abeoforma whisleri、Amoebidium、Paramoebidium、Eccrinales和Icthyophonus；以及肤孢虫目(Dermocystida)，诸如Rhinosporidium seeberi、Dermocystidium percae、Sphaerothecum destruens、Amphibiothecum penneri、Amphibiocystidium ranae和Dermocystidium salmonis。特别优选的是Sphaeroforma arctica。

在一些实施方式中，微生物选自由藻类、细菌、真菌和原生生物组成的组。在一些实施方式中，微生物是鱼孢菌纲中的原生生物。在一些实施方式中，微生物是Sphaeroformaarctica。在其他实施方式中，微生物选自由破囊壶菌目(Thraustochytriales)、甲藻(dinoflagellates)和毛霉目(Mucorales)组成的组。在一些实施方式中，微生物选自由裂殖壶菌(Schizochytrium)、破囊壶菌(Thraustochytrium)、隐甲藻(Crypthecodinium)和被孢霉(Mortierella)组成的组。

在一些实施方式中，微生物是转基因微生物，其中转基因包括引入聚酮合酶基因或其部分。

还提供了包含本文所述的微生物油的组合物。本文所述的包含微生物油的组合物的示例包括但不限于婴儿配方食品、膳食补充剂、营养补充剂、食物组合物、饮料，治疗饮料、营养饮料、化妆品、药物组合物等。

还提供了能够产生本文所述的微生物油的微生物菌株，以及由这些微生物菌株产生的微生物油和包含该微生物油的组合物。本发明还提供了保藏在藻类和原生动物培养物保藏中心(Culture Collection of Algae and Protozoa)的保藏编号为CCAP 3067/1的微生物菌株或由其衍生的菌株，以及由这些微生物菌株产生的微生物油和包含该微生物油的组合物。

实施例

实施例1

菌株选择

筛选了若干种微生物菌株，以识别产生高水平DPA(n-3)的菌株。微生物菌株在22.5℃下，在2X SDFMO培养基(1000ppm Cl-，10％ CO

表1

在筛选出的顶级菌株中，DPA(n-3)效力在～7-11％范围内。饱和物是大多数产生的脂肪酸(FA)。所有测试菌株的DPA(n-3)产量与产量最高的菌株(MK 2847、MK 2855、MK2857、MK 2866和MK 2867)的比较分别示于图1A和1B中。

来自各个菌株MK 2847、MK 2855、MK 2857、MK 2866和MK 2867的数据示于图2A-2D中。图2A示出了22:5DPA(n-3)％的中值随时间的变化。图2B示出了22:6DHA％的中值(上图)和20:5EPA(n-3)％的中值(下图)随时间的变化。图2C示出了干重的中值(g/L)(上图)和作为FAME的脂肪％的中值(下图)随时间的变化。图2D示出了脂肪滴度的中值(g/L)(上图)和DPA(n-3)滴度的中值(g/L)(下图)随时间的变化。

实施例2

发酵条件的评价

如表2所述，在不同的培养基条件、CO2和温度下评价了前四种菌株的DPA(n-3)和脂质产生动力学。

表2

1

2

图3A和3B示出了生长和脂质产生数据，比较了10％ CO

图4A和4B示出了PUFA产量数据，比较了10％ CO

来自在2X SDFMO、1000ppm Cl

表3

与22.5℃相比，在27℃和环境CO

将实施例1中收集的数据与该数据进行比较，表明DPA(n-3)产量往往变化很大，尤其是在MK 2857菌株中。然而，DPA(n-3)％在MK 2867菌株的两个实验之间是一致的。

实施例3

后续筛选

该筛选评价并比较了122RT-100-6H3、MK 2867和各种生产菌株的生长、脂肪酸谱和脂质产生动力学，以确定DPA(n-3)油在供人类或动物食用的组合物(包括婴儿配方组合物)中的潜在用途。

发酵条件类似于实施例2(2X SDFMO培养基，pH 7.5，10％ CO2，22.5℃)。

生长和脂质产生动力学如图5A和5B所示。GO 6.117和9.1.5.5菌株比菌株MK2857、MK 2867+克隆具有更高的脂肪％和碳转化效率。

测试菌株的PUFA谱如图6A-6D所示。菌株MK 2867(及其克隆MK 2867-1和MK 2867-6)和MK 2857比GO 6.117和9.1.5.5菌株产生更高的DPA(n-3)％。在所有菌株中，具有10％DPA(n-3)的MK 2867显示出最高效力。菌株122RT-100-6H3的独特之处在于脂肪％适中，DPA、EPA高，DPA(n-3)％适中。

因为菌株9.1.5.5通常在SDFMB培养基上生长，所以比较了该菌株在SDFMO和SDFMB上的性能。菌株9.1.5.5在SDFMB中的性能略高于SDFMO，但所有关键指标(生物质、脂肪滴度、脂肪％、FA谱)的趋势相当，因此验证了上述比较菌株9.1.5.5和在SDFMO培养基上生长的其他菌株的数据。

MK 2867克隆(MK 2867-1和MK 2867-6)与亲本菌株的比较示于图7A和7B中。

本说明书中引用的所有参考文献均以引用方式并入本文，如同每份参考文献被具体和单独地指出以引用方式并入。任何参考文献的引用是针对其在申请日之前的公开内容，并且不应被解释为承认由于先前的发明，本公开无权先于此参考文献。

应当理解，上述要素中的每一个或两个或更多个要素一起也可在不同于上述类型的其他类型的方法中找到有用的应用。无需进一步分析，前述内容将充分揭示本公开的要点，使得其他人可通过应用现有知识容易地将其适用于各种应用，而不遗漏从现有技术的角度来看，相当地构成所附权利要求中阐述的本公开的一般或特定实施方式的基本特征的特点。前述实施方式仅以示例的方式呈现；本公开的范围仅由以下权利要求书限定。