一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用

技术领域

本发明属于饲料技术领域，尤其涉及一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用。

背景技术

豆粕、玉米、麦麸等谷物产品是动物饲料的主要原料，豆粕是大豆提取豆油后得到的一种副产品。豆粕中粗蛋白质含量高达30~50%，是制作动物饲料的主要原料。豆粕作为蛋白饲料，是畜禽的主食，不易被替代，并且豆粕已经成为重要的期货交易品种，使得其价格波动的影响范围广、冲击面大。豆粕价格不断攀高已成为饲料价格上涨的主要因素。在中国，大豆主产区在黑龙江，由于大豆不算主粮，不像玉米、水稻、小麦，享受国家保护性的收储政策，种植面积不断减少。豆粕对进口依赖性强，其价格波动因素不可预测。因此，饲料中豆粕替代、减量技术成为饲料制造业亟需解决的问题。

人们已经发现直接摄入豆科籽实会导致人和动物产生胰腺肿大、过敏反应、生长缓慢、日粮养分利用率下降以及一些不良生理反应的现象，这些生理反应是由大豆中含有的多种抗营养因子共同介导，其中最主要的抗营养因子为植酸。植酸在豆类、谷类等作物中普遍存在，尤其在大豆中含量高。植酸在生物体内与金属阳离子、氨基酸、蛋白质和淀粉等物质结合从而抑制这些物质的消化吸收，被称为抗营养因子。植酸酶可以降解植酸生成无机磷和磷酸肌醇，从而解除植酸的抗营养作用，从而使得饲料中有限的豆粕蛋白被畜禽充分吸收利用，这是降低饲料中豆粕用量的可行之路。畜禽消化系统缺乏植酸酶，因此不能代谢植酸，进而限制了营养素在肠道的消化吸收，降低了饲料的转化率。使用植酸酶可高效地降解饲料豆粕中的植酸含量，消除抗营养作用。因此植酸酶可以作为一种新型饲料添加剂应用于饲料工业。然而，天然植酸酶应用于饲料制备过程中酶活性易受温度、pH等影响，限制植酸酶在饲料工业的应用。因此，需要对植酸酶进行改性优化，使其适用于饲料加工环节温度、pH宽泛的条件，从而充分消除饲料中抗营养因子，实现饲料豆粕减量的目的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用，属于饲料技术领域。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

其一，本发明提供了一种植酸酶在制备饲料添加剂中的应用，其特征在于，所述植酸酶为重组枯草芽孢杆菌表达的植酸酶突变体，所述植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

进一步地，所述饲料添加剂能够用于降解饲料中的植酸。

进一步地，所述饲料添加剂能够用于降低饲料中豆粕的用量。

进一步地，所述饲料添加剂的制备方法如下：

（1）重组枯草芽孢杆菌种子液按体积比1%的比例接种10ml含40μg/mL氯霉素的LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备一级种子液；

（2）根据发酵量，将一级种子液按体积比1%的比例接种含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h制备二级种子液、多级种子液；

（3）多级种子液按体积比1%的比例接种LB培养液于发酵罐中37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～0.8时，加入0.5mol/L α-乳糖，使终浓度达到0.05mol/L，进行诱导表达，继续培养5～7小时。培养结束后，将菌液6000rmp连续流离心，收集上清酶液，冷冻干燥，密封保存。

其二，本发明提供了一种植酸酶突变体。

其三，本发明提供了一种用于表达植酸酶突变体的基因，所述植酸酶突变体的基因序列为SEQ ID NO.2。

本发明的有益效果在于，通过构建表达植酸酶突变体的重组枯草芽孢杆菌，表达的植酸酶加入粉碎的饲料原料中用混合机搅拌混匀，50~55℃作用10小时降解饲料中的植酸，然后制成饲料。植酸酶突变体比未突变的植酸酶在更宽的温度和pH范围具有较高酶活性。植酸酶突变体比未突变的植酸酶相对酶活力提高了36.79%，降解豆粕中植酸的活性提高了50.6%。植酸酶突变体处理饲料，在饲料中豆粕含量减半的情况下能达到与不添加植酸酶高豆粕含量饲料接近的料肉比。植酸酶突变体应用于饲料原料处理，能充分降解饲料原料中豆粕等谷物中存在的植酸，减轻植酸抑制蛋白质、氨基酸等营养因子消化吸收的作用，从而有效降低饲料中豆粕的用量，降低饲料成本。

附图说明

图1：未突变植酸酶和植酸酶突变体的酶活力测定。

图2：温度对植酸酶相对活力的影响。

图3：pH对植酸酶相对活力的影响。

图4：重组植酸酶对豆粕中植酸降解活性检测

具体实施方式

实施例1：基于计算机辅助设计的酶结构改造和突变体设计

枯草芽孢杆菌VTT E-68013株植酸酶氨基酸序列GenBank登录号为：WP_342088197.1。应用Discovery Studio 软件对酶氨基酸序列进行分析，同源建模。分析酶与底物结合位点，通过点突变将231位、242位芳香族氨基酸酪氨酸Tyr突变为丙氨酸Ala，降低空间位阻，增强酶与底物结合能力。植酸酶突变体氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

实施例2：表达植酸酶的重组枯草芽孢杆菌构建

1.1基因合成

（1）根据植酸酶突变体氨基酸序列SEQ ID NO.1合成植酸酶突变体DNA序列SEQ IDNO.2，上下游分别添加

（2）根据枯草芽孢杆菌VTT E-68013株WP_342088197.1的氨基酸序列合成未突变的植酸酶DNA序列SEQ ID NO.3。上下游分别添加

1.2 重组表达载体的构建

(1)利用限制性内切酶

(2)利用限制性内切酶

(3)将phytase-Mut和pHT43核酸片段用T4 DNA连接酶连接，将phytase和pHT43核酸片段用T4 DNA连接酶连接，分别转化到大肠杆菌E .coli DH5α感受态细胞中，提取质粒，BamHI和SmaI双酶切鉴定，获得重组表达质粒pHT43-phytase-Mut和pHT43-phytase。

1.3 表达植酸酶、植酸酶突变体的重组枯草芽孢杆菌菌株构建

（1）重组质粒pHT43-phytase-Mut经酶切、测序鉴定正确后电转化枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞，涂布40μg/mL氯霉素平板，挑取单菌落于5 mL的含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为种子液，命名为WB800N-phytase-Mut。

（2）重组质粒pHT43-phytase经酶切、测序鉴定正确后转化枯草芽孢杆菌WB800N感受态细胞，涂布40μg/mL氯霉素平板，挑取单菌落于5 mL的含40μg/mL氯霉素LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为种子液，命名为WB800N-phytase。

1.4 植酸酶、植酸酶突变体的表达

（1）0.1ml种子液按体积比1%的比例转接10ml含40μg/mL氯霉素的LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为一级种子液。

（2）10ml一级种子液按体积比1%的比例转接1000ml含40μg/mL氯霉素的LB培养液，37℃，250 r/min摇床培养12 h作为二级种子液。

（3）校准发酵罐的pH电极、溶氧电极，并进行蠕动泵的流量校准。

（4）发酵罐通气培养，按发酵罐容积的70％配LB制培养基70L，用1mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至7.0～7.2，按培养基总体积0.02%加入消泡剂。灭菌后待发酵罐内培养液冷却到 37℃时加入40μg/mL氯霉，将700ml二级种子液加入发酵罐中，37℃培养，待菌液的OD600值达到0.6～0.8时，加入0.5mol/L α-乳糖，使终浓度达到0.05mol/L，进行诱导表达，继续培养5～7小时。整个培养过程中，发酵罐参数设置为搅拌速度500～800r/min，罐内压力 9psi，温度37℃，设定DO值 (溶解氧) 在 20％以上。培养结束后，将菌液6000rmp连续流离心，收集上清酶液。

实施例2：未突变的植酸酶与植酸酶突变体的酶学性质检测

1.1将250μL酶液（0.005 mg/mL）与750 μL 0.25 mol/L醋酸钠缓冲液（pH 4.5）混匀后加入离心管中，作为重组植酸酶的酶活力测定样品。向实验组中加入2 mL 1.5mmol/L植酸钠溶液（0.25 mol/L醋酸钠缓冲液，pH4.5），向对照组中加入2 mL终点混合液（钼酸铵/钒酸铵/硝酸），充分混匀。于37 ℃反应30 min后，立即向实验组中加入2 mL终点混合液，对照组中加入2 mL 1.5 mmol/L植酸钠溶液，并充分混匀，然后于415 nm处测定光吸收值。植酸酶活力单位（U）定义为：在37℃、pH 4.5的条件下，每分钟从1.5 mmol/L植酸钠溶液中释放出1 μmol/L无机磷所需要的植酸酶量为一个酶活力单位（U）。

未突变植酸酶和植酸酶突变体的酶活力如图1所示，未突变的植酸酶的酶活力为3576.74U/mg，植酸酶突变体的酶活力为4892.69U/mg，突变后酶活力提高了36.79%。

1.2 最适温度

温度对酶相对活力的影响如图2所示。未突变的植酸酶的最适温度为55℃，植酸酶突变体的在50℃、55℃相对酶活力均接近100%，且植酸酶突变体的酶活力在较宽温度范围内保持较高相对活力。因此植酸酶突变体比未突变的植酸酶能在更宽的温度范围内保持较高酶活力。

1.3 最适 pH

pH对酶相对活力的影响如图3所示。从图中可以看出，未突变的植酸酶和植酸酶突变体的最适pH均为7.0，但是植酸酶突变体的酶活力在较宽pH范围内保持较高相对活力，而未突变的植酸酶相对活力对pH较敏感，酶活力因pH变化衰减程度较大。因此植酸酶突变体比未突变的植酸酶具有更好的pH稳定性。

实施例3：枯草芽孢杆菌表达重组植酸酶对豆粕中植酸降解活性检测

1.1 豆粕中植酸含量测定方法

1.1.1 样品制备、提取及净化

豆粕磨粉，过1.0mm筛，密封并标明标记。称取试样10.0g，加入10mL的硫酸钠-盐酸提取液（100g无水硫酸钠溶于1.2%浓度的盐酸溶液中，定容至1000mL），震荡提取2h后离心30min（4000r/min），收集的上清液用提取液继续定容至50mL，过滤后4℃冰箱保存。取上清液2.0mL和15%三氯乙酸 2.0mL于10mL玻璃试管中，混匀，4℃静置2h后离心，吸取上清液，用0.7mol/L NaOH调节pH值为6.0~6.5，加水定容至25mL。

1.1.2 制作标准曲线

吸取植酸溶液（准确称取1.56g纯度≥90%的植酸钠，加水溶解并定容至100mL，配得10.0mg/mL植酸钠溶液。使用前水稀释至0.1mg/mL）0mL、0.04mL、0.1mL、1.0mL、2.0mL、5.0mL于6支10mL管中，稀释至5mL，制得含有植酸0mg、0.004mg、0.01mg、0.1mg、0.2mg、0.5mg的系列溶液，加入4mL 反应溶液（三氯化铁-磺酸水杨酸溶液：取1.5g三氯化铁和15g磺酸水杨酸加水溶解并定容到500mL。使用前稀释15倍），静置20min后取清液加入比色皿中，500nm处测定吸光度，保证吸光度在0.2~0.8范围内。绘制标准曲线时以吸光度为纵坐标，植酸含量为横坐标（GB 5009.153）。

1.1.3 测定

吸取5mL豆粕溶液加入10mL离心管中，加入4 mL反应溶液，混匀，离心10min（2500r/min）后获得的上清液即为测定液；不加样品溶液，得比色空白溶液。将测定液和比色空白溶液分别倒入比色杯中，用空白液调“零点”，在500nm波长下测定吸光度。试样8次重复，2次平行比色，可在标准曲线上查得试液中植酸含量。

试样中植酸含量按公式计算：X=（m2×25×50）/（m1×5×V）

式中：X（g/kg）：试样中植酸含量；m2（mg）: 5mL供试液中的植酸质量；25（mL）：洗脱液定容体积；m1（g）：试样质量；5（mL）：测定用的试液体积；V（mL）：供净化的提取液体积；50（mL）：提取液定容体积。

结果保留3位有效数字，绝对差值不得超过平均数的5%。

1.2豆粕中植酸降解效果检测

取1kg豆粕粉两份，分别加入未突变的植酸酶、植酸酶突变体各1g，搅拌均匀，在55℃保温12小时，每过1个小时取样测定样品中植酸含量，计算植酸降解效率。

1.3结果

从图4中可以看出，未突变的植酸酶反应10小时达到最大降解率61.38%，植酸酶突变体反应9小时达到最大降解率92.44%。植酸酶突变体比未突变的植酸酶降解豆粕中植酸的活性提高了50.6%。

实施例4：植酸酶处理的豆粕减量饲料对白羽肉鸡生长性能的影响试验

1.1饲料制备

饲料一：将玉米60%、小麦麸10%、豆粕15%、鱼粉10%、骨粉1.5%酵母粉3%、食盐0.5%，配比的饲料原料用混合机搅拌混匀，烘干，经粉碎机粉碎，造粒；

饲料二：将玉米60%、小麦麸17.5%、豆粕7.5%、鱼粉10%、骨粉1.5%酵母粉3%、食盐0.5%，配比的饲料原料用混合机搅拌混匀，烘干，经粉碎机粉碎，造粒；

饲料三：将玉米60%、小麦麸17.5%、豆粕7.5%、鱼粉10%、骨粉1.5%酵母粉3%、食盐0.5%、未突变的植酸酶0.1%，配比的饲料原料用混合机搅拌混匀，55℃保温10h，烘干，经粉碎机粉碎，造粒；

饲料四：将玉米60%、小麦麸17.5%、豆粕7.5%、鱼粉10%、骨粉1.5%酵母粉3%、食盐0.5%、植酸酶突变体0.1%，配比的饲料原料用混合机搅拌混匀，55℃保温10h，烘干，经粉碎机粉碎，造粒。

1.2 动物试验

（1）400只1日龄健康白羽肉鸡随机分为4组，100只/组，隔离饲养；

（2）每天8：00和16：00各饲喂一次，自由采食、饮水，试验期为40天，饲养期间按照白羽肉鸡常规免疫程序免疫和饲养管理，实验结束统计鸡料肉比。

表1 植酸酶处理的豆粕减量饲料对白羽肉鸡生长性能的影响

从表1可以看出，未突变的植酸酶和植酸酶突变体处理饲料饲喂白羽肉鸡均能降低料肉比，植酸酶突变体效果更为突出。植酸酶突变体处理饲料，在饲料中豆粕含量减半的情况下能达到与不添加植酸酶高豆粕含量饲料接近的料肉比。