胱抑素A、胱抑素A乳膏及其应用和胱抑素A乳膏的制备方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及胱抑素A、胱抑素A乳膏及其应用和胱抑素A乳膏的制备方法。

背景技术

骨质疏松是一种全身代谢性疾病，以骨组织的结构破坏和骨量减少为主要特征，显著增加了老年人发生骨折的风险，危及老年人的生命健康。衰老和女性卵巢功能的衰退导致的骨质流失是发生骨质疏松主要的风险因素。双膦酸盐等减少骨吸收的全身性治疗药物有效的抑制了骨量的丢失，但是出于对其可能导致的非典型股骨骨折、颌骨坏死等副作用以及长期治疗的疗效不确切等问题的担忧，有必要继续开发疗效确切且安全的药物。

皮肤是人体最大的器官，皮肤的变化和全身性疾病的关联在很多疾病中都有所显现，如系统性红斑狼疮患者常表现为面部蝶形红斑，肝病患者常表现出蜘蛛痣。最近的研究揭示了皮肤和骨代谢的关联，通过皮肤外用给药来预防骨质疏松或许是一种有前景的治疗手段。胱抑素A(Cystatin-A,CSTA)是一种主要由皮肤表皮层角化细胞分泌的细胞因子，衰老导致皮肤表皮变薄，角质细胞的胱抑素A分泌减少，从而减弱由胱抑素A介导的骨代谢，增加骨质流失。胱抑素A对于骨代谢具有正向调控作用，可以有效地增强骨代谢，减少骨质流失，预防骨质疏松。现有的促进胱抑素A表达的制剂虽然也能起到一定的调节作用，但是由于其复杂的作用机制，容易产生副作用，导致其并不适合作为临床用药。

目前治疗骨质疏松基本都需要依靠注射或内服药，而内服和注射用药并不适合作为预防骨质疏松的药物进行使用，然而通目前过外用药物来预防骨质疏松暂无疗效确切的治疗策略，这也导致皮肤外用的防治骨质疏松的药物还存在较大的空白。乳膏在生物医药领域运用广泛，是良好的药物载体，因此开发一款安全有效、可以在皮肤局部使用、具有预防骨质疏松功效的乳膏制剂是符合中老年人群和骨质疏松患者需要的，能够有效的减少骨质疏松性骨折的患病风险，降低老年人死亡率，提高平均寿命。

发明内容

针对上述问题，本发明提供胱抑素A、胱抑素A乳膏及其应用和胱抑素A的制备方法，主要为了解决目前缺少皮肤外防治骨质疏松的药物或现有皮肤外防治骨质疏松效果不明显等问题。

为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

本发明第一方面涉及

其中，所述胱抑素的作用浓度为20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml中任一。

其中，所述胱抑素A的作用至少表现为下述任一

1)预防缓解骨膜下成骨活动降低；

2)预防缓解骨皮质变薄；

3)增强骨代谢活性；

4)抑制表皮厚度减少。

就皮肤外用药的药体形式而言，所述防治骨质疏松的药物为乳膏，乳膏可以较好的涂覆在皮肤的外表面，并且采用皮肤外用药的方式降低了内服和注射可能产生的用药风险。防治骨质疏松的药物涂覆于皮肤后，同样可以保证胱抑素A渗入皮肤后作用在病变部位。

该防治骨质疏松的药物的药物用在骨外皮肤时，可以抑制表皮厚度减少，药物中含有的胱抑素A可以补充甚至替代皮肤中分泌胱抑素A以用于对病变部位进行作用。换言之，胱抑素A也可在制备防治骨质疏松诱发的皮肤厚度减少的药物中的应用，该药物也为皮肤外用药。

所述骨质疏松为雌激素缺乏诱发骨质疏松，比如绝经后骨质疏松，主要由雌激素缺乏导致骨量减少及骨组织结构变化，使骨脆性增多，易于骨折。

本发明第二方面涉及防治骨质疏松的乳膏，包括胱抑素A乳膏，所述胱抑素A乳膏具有下述组分

胱抑素A，及乳胶基质辅料；所述乳胶基质辅料包括甘油、卵磷脂、硬脂酸单甘油酯、羊毛酯醇、乙二胺四乙酸二钠、羧甲基纤维素、肉豆蔻酸异丙酯、对羟基苯甲酸甲酯、海藻糖、透明质素。胱抑素A乳膏还常规的含有蒸馏水。当然，本部分提及的各组分还有其他等效替代物，若进行简单的组分替换也应当视为等同于本方案。

本发明第三方面涉及

其中，所述胱抑素A的作用浓度为20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml中任一。

其中，所述胱抑素A的作用至少表现为下述任一

1)预防缓解骨膜下成骨活动降低；

2)预防缓解骨皮质变薄；

3)增强骨代谢活性；

4)抑制表皮厚度减少。

其中，所述防治骨质疏松的药物的用药方式为皮肤外用；在本条中，防治骨质疏松的药物中包含了胱抑素A乳膏作为有效成分，其还可含有除胱抑素A乳膏外的其他成分。所述骨质疏松为雌激素缺乏诱发骨质疏松。

本发明第四方面涉及

S1、将油相和甘油、卵磷脂、硬脂酸单甘油酯、羊毛酯醇、乙二胺四乙酸二钠、羧甲基纤维素、肉豆蔻酸异丙酯、对羟基苯甲酸甲酯在75～80℃下融化，搅拌混合并冷却至50～55℃；

S2、进一步用超声波乳化器乳化；

S3、加入胱抑素A、海藻糖、透明质素、蒸馏水，调节pH7.8～8.0，得到含有胱抑素A乳膏。

本发明的有益效果是：

为骨质疏松的防治提供了新的药物，并且该药物可以实现皮肤外使用。通过皮肤递送胱抑素A可有效的防治骨质疏松，为防治疗骨质疏松提供一种皮肤-骨代谢调控外用药物途径，并且避免了毒副作用。

附图说明

图1为6周大小的C57/BL小鼠背部去毛后局部使用乳膏示意图；

图2为小鼠股骨骨膜骨(Pb)钙黄绿素双标记测定的代表性图像,n＝3,比例尺50μm；

图3为小鼠股骨远端及骨皮质microCT三维重构图像；

图4为小鼠股骨远端骨小梁参数及股骨中段骨皮质参数分析(n＝3,p>0.05,ns,p<0.0001,****)；

图5为小鼠股骨远端HE染色图、TRAP染色图，比例尺1mm；

图6为小鼠皮肤全层HE染色及表皮厚度统计图(n＝3,比例尺25μm；p<0.001,***,p<0.01,**)；

图7为小鼠心肝脾肺肾的HE染色图。

具体实施方式

下面结合具体的研究项目对本发明做进一步说明。

实施例1.不同含量胱抑素A乳膏对OVX小鼠的骨量变化及骨代谢的影响

(1)假手术(Sham)组(不含药物乳膏)、OVX组(不含药物乳膏)、OVX+胱抑素A乳膏(20ng/mL)、OVX+胱抑素A乳膏(40ng/mL)、OVX+胱抑素A乳膏(80ng/mL)(n＝3)，每两天在小鼠背部涂抹一次乳膏，持续两个月。

(2)微型计算机断层扫描(micro-CT)分析：分离出小鼠股骨。剥离软组织，在4％多聚甲醛中固定48小时，在SCANCOMedicalμCT40扫描仪上进行高分辨率(1微米)扫描。在SCANCOMedicalμCT40扫描仪上以高分辨率(10μm)进行扫描。(SCANCOMedical)进行高分辨率(10μm)扫描，整合时间为200ms，能量为55kVp，强度为145-μA。我们建立了股骨的横断面图像来进行骨皮质的二维形态学分析和小梁骨的三维组织形态分析。对于骨皮质，选择的分析区域为股骨长度的10％。测定骨皮质厚度(Cb.Th)。小梁骨区域兴趣区从股骨髁完全合并的第一张切片开始，延伸100张，并向近端延伸300张。将骨小梁从皮质壳中分割出来，并进行分析以确定骨小梁的体积分数(BV/TV)。

(3)组织学分析：骨骼组织被解剖，用4％多聚甲醛固定48小时。固定后，将胫骨和股骨在10％EDTA(pH8.0)中进行脱钙14天，并嵌入石蜡或最佳切割温度化合物(编号4583，Sakura)。随后，4μm矢状方向的组织切片，用于抗酒石酸的酸性磷酸酶(TRAP)。使用标准方案(Sigma-Aldrich)进行。切片被用FV10-ASW浏览器或cellSens软件(奥林巴斯)进行成像。

(4)骨代谢分析：处死小鼠前10天及前3天分别给予腹腔注射20g/g体重的钙黄绿素。麻醉小鼠，颈椎脱白处死，解剖分离两侧股骨，置于PLP中固定24小时，避光固定保存。交由行硬组织包埋和超薄切片，切片避光保存，立即摄片。新鲜的组织切片，在荧光显微镜下观察，采集图像。

结果分析：如图2中所示，小鼠股骨骨膜下骨的动态形成过程，反映成骨活性。相较于Sham组，OVX组两次钙黄绿素沉积线的宽度明显变小，而相较于OVX组，不同浓度的CSTA处理组可以有效增加两次钙黄绿素沉积线之间的宽度，且40ng/mL和80ng/mL处理组宽度增加更明显；结果表明，OVX减弱了小鼠股骨骨膜下骨的成骨活动，但是20ng/mL、40ng/mL和80ng/mL CSTA处理均可预防该成骨活动的降低，且40ng/mL和80ng/mL处理组的效果更好。如图3中所示，CT成像重构了小鼠股骨远端到中段的整体结构，并通过3D分析重构了股骨远端骨小梁的结构以及股骨中段的骨皮质。可以看出OVX处理后骨小梁变的稀疏，而40ng/mL以及80ng/mL处理组的股骨远端骨小梁并没有因为OVX处理而明显减少；股骨中段骨皮质的厚度变化也与上述表现一致，即OVX使骨皮质变薄，而CSTA处理可以有效的预防OVX导致的骨皮质变薄。如图4中所示，对骨小梁参数BV/TV进行了统计学分析，40ng/mL和80ng/mL处理组的BV/TV结果与OVX处理组有显著差异，对骨皮质厚度Cb.Th进行测量，20ng/mL、40ng/mL、80ng/mL处理组与OVX处理组有显著差异；结果表明，40ng/mL和80ng/mL的CSTA乳膏处理可以有效的预防骨小梁的减少和骨皮质变薄。如图5中所示，HE染色从组织学层面显示不同处理组股骨远端的组织结构，可以看出，相较于Sham组，OVX组股骨远端的骨小梁明显减少，而40ng/mL以及80ng/mLCSTA处理组的骨小梁数量较多；TRAP共定位染色的结果反应破骨细胞的数量，各CSTA处理组未观察到明显的破骨细胞抑制，而破骨细胞活动和骨的分解代谢相关，表明CSTA乳膏并不能够减弱骨的分解代谢活，提示其可能主要通过更多的增加合成代谢来抑制OVX介导的骨质流失。

实施例2.不同含量胱抑素A乳膏对OVX小鼠的皮肤厚度的影响

(1)假手术组(不含药物乳膏)、OVX组(不含药物乳膏)、OVX+胱抑素A乳膏(20ng/mL)、OVX+胱抑素A乳膏(40ng/mL)、OVX+胱抑素A乳膏(80ng/mL)(n＝3)，每两天在小鼠背部涂抹一次乳膏，持续两个月。

(2)组织学分析：骨骼组织被解剖，用4％多聚甲醛固定48小时。固定后，将胫骨和股骨在10％EDTA(pH8.0)中进行脱钙14天，并嵌入石蜡或最佳切割温度化合物(Sakura,4583)。随后，4μm冠状位方向的组织切片，用于HE染色。切片被用FV10-ASW浏览器或cellSens软件(奥林巴斯)进行成像。

结果分析：如图6中所示，统计学结果显示，相较于Sham组，OVX组皮肤表皮厚度变薄，而20ng/mL、40ng/mL以及80ng/mLCSTA处理组的表皮厚度与OVX处理组相比有显著性的增加，表明三种不同浓度的CSTA乳膏均可以缓解OVX介导的皮肤表皮厚度减少。

实施例3.胱抑素A乳膏生物毒性

组织学分析：心肝脾肺肾被解剖，用4％多聚甲醛固定48小时，固定脱水，并嵌入石蜡或最佳切割温度化合物(Sakura,4583)。随后，4μm矢状方向的组织切片，用于HE染色分析。切片被用FV10-ASW浏览器或cellSens软件(奥林巴斯)进行成像。

结果分析：如图7中所示，为了评估CSTA乳膏的生物相容性。对Sham组及40ng/mLCSTA处理组进行了心肝脾肺肾的染色，HE染色结果显示不同处理组的关键脏器无明显器质性损害。

本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。