抑制CDCA2的物质在制备治疗黑色素瘤药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及抑制细胞分裂周期相关蛋白2(Celldivision cycle associated 2，CDCA2)的物质在制备治疗恶性黑色素瘤(malignantmelanoma，MM)药物中的应用。

背景技术

恶性黑色素瘤是一种起源于神经棘黑色素细胞的恶性肿瘤，具有疾病发展迅速、治疗效果欠佳、死亡率较高及预后较差等特点，且其发病具有明显的地域和种族的差异性。目前黑色素瘤主要分为皮肤型、肢端型、皮肤型及眼黑色素瘤等亚型。欧美地区，MM多发于躯干和面部，其主要与高强度的紫外线照射有关，早诊人群较多，治疗效果较好。亚洲地区包括中国在内的黄种人的MM好发于肢端，主要为肢端型，通常认为与皮肤慢性摩擦损伤，以及和色素痣的不典型增生有关，通常就诊时病灶浸润较深、溃疡率高，患者分期较晚，治疗效果较差。尽管MM在我国的发病率较低，但近年来成逐步上升的趋势，根据2015年最新发布的发病率统计看，我国的发病率约为1/10万，每年的新发病例也可达0.8-1万人，加之我国的治疗手段有限，治疗效果较差，MM已经成为了严重危害我国人民健康的疾病之一。

近年来，肿瘤的分子机制研究逐步成为肿瘤基础研究领域最热门的话题。在过去的几十年间，研究者们已在黑色素瘤中发现了多个基因突变和细胞信号通路的异常激活，这也促进了靶向治疗和免疫治疗的发展。2011年，分子靶向治疗药物BRAF抑制剂维莫非尼(Venurafenib)及免疫治疗药物CTLA-4单抗伊匹木单抗(Ipilimumab)被美国FDA批准用于MM的治疗。2013年和2014年FDA又分别批准分子靶向药MEK抑制剂曲美替尼(trametinib)和免疫检查点抑制剂PD-1单抗(纳武利尤单抗-nivolumab、帕博利珠单抗-pembrolizumab)等用于黑色素瘤的临床治疗。尽管这些药物在一定程度上革新了黑色素瘤的治疗手段，改善了黑色素瘤患者的预后，其适用患者范围的局限性以及耐药性的产生使得黑色素瘤的治疗仍然面临很大的挑战。因此，进一步探讨黑色素瘤发生发展或免疫抑制微环境的调控机制，寻找潜在的药物靶点，对改善黑色素瘤患者预后具有重要的临床意义。

发明内容

为了克服现有技术中的缺陷，本发明提供了抑制CDCA2的物质在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面是提供抑制CDCA2的物质在制备治疗黑色素瘤药物中的应用。

进一步地，上述抑制CDCA2的物质包括下述的至少一种：

特异性抑制CDCA2的小分子化合物；

特异性干扰CDCA2基因表达的干扰分子；

特异性敲除CDCA2基因的基因编辑试剂；

特异性与CDCA2基因编码的蛋白结合的抗体或配体。

本发明的第二方面是提供抑制CDCA2的物质在制备抑制黑色素瘤中PD-L1表达的试剂中的应用。

进一步地，上述抑制CDCA2的物质包括下述的至少一种：

特异性抑制CDCA2的小分子化合物；

特异性干扰CDCA2基因表达的干扰分子；

特异性敲除CDCA2基因的基因编辑试剂；

特异性与CDCA2基因编码的蛋白结合的抗体或配体。

本发明的第三方面是提供阻断CDCA2-AURKA通路的物质在制备抑制黑色素瘤中PD-L1表达的试剂中的应用。

进一步地，上述阻断CDCA2-AURKA通路的物质包括下述的至少一种：

抑制CDCA2表达的物质；和

抑制AURKA表达的物质。

本发明的第四方面是提供一种治疗黑色素瘤的药物，包括抑制CDCA2的物质和药学上可接受的载体或赋形剂。

进一步地，上述抑制CDCA2的物质包括下述的至少一种：

特异性抑制CDCA2的小分子化合物；

特异性干扰CDCA2基因表达的干扰分子；

特异性敲除CDCA2基因的基因编辑试剂；

特异性与CDCA2基因编码的蛋白结合的抗体或配体。

本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明创造性地发现抑制CDCA2能够促进黑色素瘤细胞凋亡，抑制黑色素瘤细胞增殖和迁移，并抑制PD-L1的mRNA和蛋白表达水平，为确定治疗黑色素瘤的药物靶点提供依据，对改善黑色素瘤患者预后具有重要的临床意义。

附图说明

图1：图A显示了高通量转录组测序筛选差异基因的结果；图B显示了qPCR验证部分差异基因的内源表达的结果；图C显示了高内涵细胞增殖实验验证部分差异基因敲减对细胞增殖水平的调控作用；

图2为IHC染色验证了CDCA2在黑色素瘤中表达水平上调；

图3：图A和B分别为qPCR和WB验证CDCA2敲减模型的构建的结果；图C显示了CDCA2敲减显著抑制黑色素瘤细胞增殖；

图4：图A显示了CDCA2敲减显著促进黑色素瘤细胞凋亡，图B显示了CDCA2敲减显著抑制黑色素瘤细胞迁移；

图5：图A显示了采用转录组测序从RNA层面筛选CDCA2的潜在下游靶标的结果，图B显示了采用蛋白组学分析从蛋白层面筛选CDCA2的潜在下游靶标；

图6显示了CDCA2敲减降低AURKA在黑色素瘤细胞中的蛋白稳定性；

图7显示了MG132处理抑制了CDCA2对AURKA的蛋白表达调控；

图8显示了CDCA2敲减促进AURKA的泛素化修饰；

图9：图A显示了以AURKA为底物的E3泛素连接酶，图B显示了SMURF1过表达降低AURKA的蛋白稳定性，图C显示了采用免疫共沉淀验证CDCA2和SMURF1的蛋白-蛋白相互结合；

图10显示了CDCA2敲减抑制PD-L1的mRNA和蛋白表达水平；

图11显示了CDCA2-AURKA轴对PD-L1的调控作用。

具体实施方式

本发明提供了抑制CDCA2的物质在制备治疗黑色素瘤药物中的应用以及在制备抑制黑色素瘤PD-L1表达的试剂中的应用，为治疗黑色素瘤提供新的方向。

下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。

实施例1

1.CDCA2分子筛选和临床相关验证

(1)对16例黑色素瘤肿瘤组织以及6例癌旁正常组织进行了高通量转录组测序：

使用来自Affymetrix(加州，美国)的基因芯片杂交仪、染色机和扫描仪对16例黑色素瘤组织和6例癌旁组织的RNA进行了测序。首先，将RNA合成为一链cDNA和二链cDNA；这两条链在体外转录合成标记cRNA。然后，用分光光度计测定cRNA的浓度，并通过对cRNA的反转录合成单链cDNA。纯化后，测定cDNA浓度并转化为dUTP残片段和断裂的DNA链。利用Affymetrix专有的DNA标记试剂，将片段化的cDNA与生物素进行共价连接。最后，将cDNA制备成杂交鸡尾酒，注入芯片中，进行杂交和洗涤。洗涤染色后放入扫描机自动扫描结果。利用R软件中的Limma分析黑色素瘤样本与癌旁样本基因表达谱的显著差异。采用基于经验贝叶斯分布的线性模型计算显著性差异水平p值，并采用Benjamini-Hochberg方法对显著性差异水平(FDR)进行修正。采用EdgeR数据包对转录组表达谱数据进行数据处理以及组间差异表达分析，以表达水平差异超过2倍同时具有统计学意义(P＜0.05)作为显著差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)的筛选条件筛选在黑色素瘤组织中相比于癌旁正常组织表达水平显著上调或下调的基因(如图1A)。

(2)在表达水平上调倍数最大的DEGs中，选择部分基因(DLGAP5、ADAMDEC1、APOC1、SERPINA1、SULT1C2、GABBR1、CHAC2、CDCA2、PPM1H、W1PF1)作为候选基因，一方面采用qPCR验证这些基因在黑色素瘤细胞中的内源表达，另一方面构建相应的基因敲减黑色素瘤细胞模型并对细胞增殖表型进行了检测，结果显示所有候选基因都在黑色素瘤细胞中有所表达(图1B)且其中CDCA2的敲减对黑色素瘤细胞的增殖水平有明显的抑制作用(图1C)。

(3)探究CDCA2在黑色素瘤中的表达水平以及其与肿瘤的恶性程度的关系：使用的组织芯片购自西安阿利纳生物科技股份有限公司(T17-1430TMA2024)，其中黑色素瘤组织136个，良性黑色素细胞痣组织181个。采用组织芯片T17-1430 TMA2 024进行免疫组化，检测组织样本中CDCA2的表达。将5μm石蜡包埋的组织芯片脱蜡后，用柠檬酸盐提取抗原。用3％H

2.CDCA2对黑色素瘤进展的调控作用的体外验证

(1)细胞模型构建和细胞表型检测：根据RNA干扰序列设计原理，以目的基因为模板设计RNA干扰目标序列，再合成单链DNA寡聚体，目的基因序列和RNA干扰目标序列如下表1。将单链DNA寡聚体转化为双链DNA寡聚体，再与线性化载体连接形成重组载体。将重组载体与携带荧光标签(绿色荧光蛋白)的慢病毒共转染到293T细胞中，获得含有目的基因干扰序列的慢病毒。慢病毒感染黑色素瘤细胞(2×10

a.细胞模型验证：采用荧光定量聚合酶链反应(qPCR)检测各组细胞中CDCA2的mRNA表达水平，采用免疫印迹(western blot，WB)检测CDCA2的蛋白表达水平，明确细胞模型构建效率。

b.细胞增殖水平检测：感染慢病毒的黑素瘤细胞在对数生长期被胰蛋白酶消化并重悬。细胞转移到96孔板，每孔1500个细胞。96孔板在同一时间点用Celigo(NexcelomBioscience，Massachusetts，USA)连续5天扫描以获得图像。利用图像分析软件对扫描图像中的细胞进行计数，绘制连续5天的细胞生长曲线。实验重复3次。

c.流式细胞术检测细胞凋亡步骤：当A375和SK-MEL-28细胞生长至70％覆盖率时，收集细胞，用D-Hanks和4℃预冷的1×结合缓冲液洗涤。用1×结合缓冲液200μL重悬细胞。在细胞悬液中加入10μL Annexin V-APC(eBioscience，California，USA)，室温黑暗孵育15min。采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

d.细胞迁移侵袭表型检测：采用Transwell实验检测各组细胞的迁移率：根据Transwell试剂盒(3422，corning Company，NY，，USA)的操作说明，在感染慢病毒的A375和SK-MEL-28细胞上进行Transwell实验，以评估细胞的迁移能力。1×10

表1用于敲除CDCA2基因的目的基因序列和shRNA序列

qPCR和WB的结果显示通过shCDCA2慢病毒的转染黑色素瘤细胞A375和SK-MEL-28中CDCA2的mRNA表达和蛋白表达均显著降低，说明基因敲减细胞模型的成功构建(图3A-B)。接下来的细胞表型检测则显示CDCA2敲减显著降低了黑色素瘤细胞的增殖(图3C)和迁移(图4B)能力，同时促进细胞凋亡(图4A)，这些结果均再次证实了CDCA2对黑色素瘤进展的潜在促进作用。

实施例2

1.CDCA2调控黑色素瘤进展的下游靶标的探索和验证

a.转录组学：采用Illumina平台的转录组学测序技术分析shCtrl组和shCDCA2组黑色素瘤细胞的转录组表达谱，EdgeR语言包进行组间差异分析，以组间表达水平差异超过2倍(上调或下调)同时具有统计学意义(P＜0.05)为阈值筛选显著差异表达基因(DEGs)，并在此基础上进行下游细胞功能/通路的富集分析；

b.蛋白组学：采用ITRAQ技术分析shCtrl组和shCDCA2组黑色素瘤细胞的蛋白质表达谱，使用与转录组相同的条件筛选差异表达蛋白(DEPs)；

基于shCtrl组和shCDCA2组黑色素瘤细胞(3v3)采用转录组测序(图5A)以及ITRAQ蛋白组学分析(图5B)从RNA层面以及蛋白层面分别对CDCA2的下游调控因子进行了探索。经过对结果的综合分析发现，CDCA2对已知在黑色素瘤的进展以及免疫逃逸中发挥了重要作用的PD-L1的mRNA水平有显著的正向调控作用，同时CDCA2具有在蛋白层面调控AURKA表达水平的功能。

2.CDCA2通过泛素化途径调控AURKA蛋白稳定性以及表达水平的分子机制探索

a.蛋白稳定性检测：用含有shCDCA2序列的慢病毒感染A375细胞。在培养基中加入CHX(0.2mg/mL)抑制翻译，并在规定时间(0、2、4、8h)制备细胞裂解液，然后对20μg总蛋白进行WB处理，以评估AURKA蛋白水平。

b.泛素化分析：慢病毒感染A375细胞24h后，在培养液中加入MG-132(20μM)，与细胞共孵育6h，裂解A375细胞获得总蛋白，WB法检测AURKA蛋白水平。将细胞裂解液与适量抗体在4℃孵育过夜，再与20μL微球在4℃孵育2h。结合蛋白复合物用IP裂解缓冲液洗涤两次后，与泛素抗体进行WB检测泛素水平。

由图6可知，CDCA2敲减显著降低了AURKA在黑色素瘤细胞中的蛋白稳定性，而进一步的探究显示将细胞使用蛋白酶体抑制剂MG132处理后CDCA2对AURKA的蛋白表达调控作用受到了严重的抑制(图7)，这显示CDCA2可能是通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)所介导的蛋白降解作用来影响AURKA的蛋白稳定性以及蛋白表达水平。我们也检测了CDCA2对AURKA泛素化水平的调控作用，其结果也与预期一致，CDCA2的敲减显著促进了AURKA的泛素化修饰(图8)。

c.为深入探究CDCA2调控AURKA泛素化的途径，我们首先采用Ubibrowser在线工具预测了以AURKA为底物的E3泛素连接酶(图9A)并选取其中可能性最高的SMURF1来进行验证，与上述类似的检测显示SMURF1过表达能够显著降低AURKA的蛋白稳定性(图9B)。

d.免疫共沉淀实验：提取A375细胞总蛋白，用BCA蛋白测定试剂盒(23225，HyClone-Pierce)测定蛋白浓度。总蛋白与抗体在4℃孵育过夜，再与20μL珠在4℃孵育过夜。蛋白-抗体-珠复合物用IP裂解缓冲液洗涤3次，用SDS-PAGE分离，然后转移到PVDF膜上。之后，步骤与western blot相同，最后使用化学发光成像仪进行化学发光和成像。

由图9C可知，CDCA2与SMURF1具有蛋白-蛋白相互结合作用，这可能是其影响SMURF1所介导的CDCA2泛素化的分子途径。

实施例3 CDCA2通过AURKA调控PD-L1进而影响黑色素瘤免疫逃逸

1.采用qPCR和WB验证CDCA2对PD-L1表达水平的调控作用，其结果显示CDCA2敲减显著抑制了PD-L1的mRNA和蛋白表达水平(图10)。

2.根据RNA干扰序列设计原理，以AURKA目的基因为模板设计RNA干扰目标序列，再合成单链DNA寡聚体。将单链DNA寡聚体转化为双链DNA寡聚体，再与线性化载体连接形成重组载体shAURKA。以CDCA2目的基因为模板设计引物扩增序列，再利用OCR扩增制备目的基因片段。目的基因片段与线性化载体连接形成重组载体OE-CDCA2。将重组载体与携带荧光标签(OE-CDCA2和shAURKA载体分别采用绿色荧光蛋白/红色荧光蛋白)的慢病毒共转染到293T细胞中，获得含有目的基因干扰序列或目的基因片段的慢病毒。将OE-CDCA2和shAURKA慢病毒同时感染黑色素瘤细胞(2×10

由结果可知，CDCA2过表达能显著上调PD-L1的mRNA和蛋白表达水平，而AURKA的敲减则能在此基础上抑制PD-L1的表达，显示出CDCA2-AURKA轴对PD-L1的调控作用(图11)。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。