一种用于破坏病毒囊膜结构的pH响应相转变磺酸脂质体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于破坏病毒囊膜结构的pH响应相转变磺酸脂质体及其制备方法和应用。

背景技术

近年来，各种病毒引发的疾病和疫情已经成为公共卫生的重大挑战。针对此问题，目前已经有多种抗病毒药物获得了报道，如公开号为CN115894587A的专利申请公开了一种核苷衍生物的制备及其在抗病毒药物领域中的用途，得到的化合物具有良好的抗病毒活性，适用于开发为新型抗病毒药物。

公开号为CN114605555A的专利申请公开了一种抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的双特异性中和抗体及其应用，其为双特异抗体A4-A7或者双特异抗体A7-A4，均包括纳米抗体A4和纳米抗体A7，纳米抗体A4和纳米抗体A7均包括可变区，可变区均具有3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3。

虽然疫苗、抗病毒药物和病毒中和抗体在一定程度上控制了疫情，但是，由于病毒的自我进化，各种病毒变种的出现极大地限制了这些治疗方法的效果。

抗病毒纳米颗粒因其制备简单、储存条件温和、广谱抗病毒效果优异而备受关注。大多数抗病毒纳米颗粒通过病毒中和机制抑制病毒性疾病。这些纳米颗粒可以通过与病毒结合来阻止病毒与细胞之间的接触。例如，硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)是一种位于细胞表面的高度硫酸化的蛋白多糖，也是许多病毒侵入细胞的第一个结合位点，通过对纳米颗粒进行硫酸盐基或磺酸基的修饰，可以使其实现HSPG仿生和广谱中和病毒。然而，由于大多数纳米颗粒不会破坏病毒结构，因此在纳米颗粒从病毒表面脱落后，病毒仍有可能会恢复感染细胞的能力。

病毒是一类微小且无完整细胞结构的粒子，按照病毒表面是否存在囊膜，可以将病毒简单地分为囊膜病毒和非囊膜病毒两种类型。相较于非囊膜病毒，能够引起人类疾病的囊膜病毒种类更加多样，如冠状病毒、流感病毒、艾滋病毒、乙肝病毒等。这些囊膜病毒借助膜蛋白实现对易感细胞的粘附，在膜蛋白的帮助下使病毒囊膜和细胞膜或吞噬小体膜融合，并将其基因组释放到细胞内。由于囊膜在病毒入侵过程中起着重要作用，破坏病毒囊膜可能是实现病毒灭活的一种方法。

发明内容

本发明针对病毒灭活不够理想的问题，提供一种用于破坏病毒囊膜结构的pH响应相转变磺酸脂质体，不仅可以借助硫酸乙酰肝素蛋白多糖仿生策略实现对病毒的初步中和，通过与病毒粒子竞争性结合的方式阻止病毒接触易感细胞，还可以响应溶酶体内或病毒感染引起的炎症组织低pH微环境、破坏病毒囊膜结构进而实现病毒灭活。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

第一方面，一种用于破坏病毒囊膜结构的pH响应相转变磺酸脂质体，由双链磷脂、单链脂质和辅料组成；

所述双链磷脂为二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵(DOTAP)；所述单链脂质为油酸(OA)和十六烷基磺酸钠(HSA)；所述辅料为胆固醇(Cho)。

所述DOPE结构如下，具有圆锥形分子形状。

所述DOTAP用于调节脂质体响应pH，其结构如下：

所述OA作为分子形状可调的弱电解质脂质，其结构如下：

所述HSA作为可使脂质体具备病毒粘附作用的磺酸脂质，其结构如下：

本发明破坏病毒囊膜结构的机理在于：OA的羧基亲水头部在正常生理组织高pH环境中能够保持离子形态，使其呈现大尺寸亲水头和小尺寸疏水尾的倒圆锥分子形状，与具有小尺寸亲水头和大尺寸疏水尾的圆锥形分子DOPE相契合，形成脂质双分子层结构。而当脂质体进入低pH环境后，OA的羧基会被质子化，导致其亲水头部尺寸变小，并使分子形状转变为圆锥形。此时脂质体将难以维持原本的双分子层结构，开始向结晶六角相转变。并且，脂质体中HSA提供的磺酸基团使其与病毒囊膜紧密接触，于是脂质体在相转变的过程中会进一步促进脂质体与病毒的膜融合并引起病毒囊膜发生结构性破坏，最终导致病毒的灭活。

因此本发明的pH响应相转变磺酸脂质体能在较高pH环境下(pH 7.0以上，如7.4)保持稳定分散的脂质双分子层结构，而在低pH环境中(低于7.0，如pH6.8)则首先会发生聚集，并进一步向六角相转变。

优选地，所述(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵的摩尔量为二油酰磷脂酰乙醇胺、油酸和十六烷基磺酸钠总摩尔量的20-30％；其中阳离子脂质DOTAP的掺入能够通过改变脂质体净电荷的方法来改变脂质体的pH响应值，DOTAP含量越高，脂质体的负电性就越弱，pH响应值也就越高。优选DOTAP为DOPE、OA和HSA总摩尔量的25％。

优选地，所述二油酰磷脂酰乙醇胺、油酸和十六烷基磺酸钠的摩尔比为2:1-1.5:1-1.5。其中油酸含量的变化可以调节脂质体响应pH的相转变能力，磺酸比例的变化则与中和病毒能力相关。

优选地，所述二油酰磷脂酰乙醇胺、油酸和十六烷基磺酸钠的摩尔比为2:1:1。

所述胆固醇为双链磷脂和单链脂质总摩尔量的5-25％。胆固醇能为脂质体的氧化稳定性、物理稳定性等提供良好保障。掺入的胆固醇过少不利于脂质体的稳定，而掺入过多的胆固醇具有引起高脂血症、肿瘤等疾病的不利风险。

第二方面，本发明还提供所述的用于破坏病毒囊膜结构的pH响应相转变磺酸脂质体的制备方法，包括步骤：

步骤1，将二油酰磷脂酰乙醇胺、(2,3-二油酰基-丙基)-三甲基氯化铵、油酸、十六烷基磺酸钠和胆固醇溶解混合，旋蒸去除溶剂得到脂质薄膜；

步骤2，采用水溶液浸泡分散脂质薄膜，经超声破碎得到所述pH响应相转变磺酸脂质体。

步骤1中采用溶剂包括二氯甲烷、氯仿、甲醇中一种或多种；优选地，溶剂采用氯仿和甲醇的混合溶剂，如体积比8:2-3的三氯甲烷/甲醇混合溶剂，其中大极性甲醇促进荷电脂质的溶解。

步骤2中水溶液包括磷酸盐缓冲液、去离子水、超纯水中一种或多种。

优选地，步骤2中超声功率为40-60W，超声时间为1-15min。超声功率低则注入的能量低，无法将脂质体充分破碎；超声功率过高则会释放热量，不利于磷脂或脂质的稳定。

所述pH响应相转变磺酸脂质体粒径为30-60nm。大尺寸的脂质体需要更强的结合力才能保证其黏附在病毒表面而不脱落，因此其抗病毒能力会受到一定程度的影响。

进一步优选地，所述的用于破坏病毒囊膜结构的pH响应相转变磺酸脂质体的制备方法，包括步骤：

步骤1，使用体积比为8:2的三氯甲烷/甲醇混合溶剂溶解原料，在55℃水浴环境中通过旋转蒸发去除溶剂，并采用氮气吹干产物表面溶剂，制得脂质薄膜；

步骤2，用磷酸盐缓冲液水化脂质薄膜，并使用超声清洗器将容器壁上粘附的脂质薄膜剥离到水相溶液中，初步形成尺寸分布较宽的粗产物；

步骤3，将制得的脂膜溶液用超声波细胞破碎仪充分超声破碎，制备得到脂质体，此时脂质体尺寸分布均匀，形貌规整。

第三方面，本发明还提供所述的pH响应相转变磺酸脂质体在制备预防或/和治疗病毒引起疾病药物中的应用。

本发明基于硫酸乙酰肝素蛋白多糖仿生策略，通过改变脂质分子形状的方法实现对脂质体相转变的调控，构建了一种用于破坏病毒囊膜结构的pH响应相转变磺酸脂质体。在病毒感染初期接近于正常生理环境的高pH环境中，这一脂质体能够粘附病毒，通过包裹病毒的方式阻隔病毒与细胞的接触，实现对病毒的中和，此时病毒与脂质体形成的大块团聚物能够被细胞内吞，脂质体能够在胞内溶酶体酸性环境中发生相转变灭活病毒。而在病毒感染后期形成的炎症低pH环境中，脂质体粘附病毒后直接在胞外发生相转变破坏病毒囊膜，导致病毒基因组的泄露，实现病毒灭活功能。

此外，由于通过与硫酸乙酰肝素蛋白多糖结合实现对细胞入侵的病毒种类繁多，该脂质体还具有广谱抗病毒的能力。

优选地，所述病毒包括严重急性呼吸综合征病毒、中东呼吸综合征病毒、猪德尔塔冠状病毒、人冠状病毒OC43、人冠状病毒NL63、新型冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、拉沙热病毒、单纯孢疹病毒、艾滋病毒、人乳头瘤病毒中的一种或多种。

将本发明的pH响应相转变磺酸脂质体与病毒混合孵育，降低病毒感染细胞的能力。特别是体内病毒感染严重时，体内微环境pH下降，本发明的脂质体能够聚集和进一步的相转变，进而破坏病毒囊膜结构实现病毒灭活，效果更强。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明构建的用于破坏病毒囊膜结构的pH响应相转变磺酸脂质体成分及配方明确，制备方法简单，尺寸合适，分布均匀，提高了硫酸乙酰肝素蛋白多糖仿生纳米粒子成药性的同时，还有可能能够实现大批量生产。

(2)本发明构建的脂质体能够在病毒感染初期的高pH环境中通过黏附、包裹病毒的形式中和病毒，利用自身组成及形貌与病毒包膜相似的特点与其发生膜融合，并以被细胞内吞的方式在溶酶体中发生相转变实现胞内灭活病毒。而在病毒感染后期引起的炎症组织低pH微环境中，脂质体在黏附病毒后能够直接在胞外通过相转变来破坏病毒囊膜以实现病毒灭活。故无论是在病毒感染初期还是后期，该脂质体都能实现病毒的有效杀灭。

(3)由于硫酸乙酰肝素蛋白多糖为多种病毒侵入细胞的共同结合位点，该仿硫酸乙酰肝素蛋白多糖结构的磺酸脂质体能够表现出对多种病毒的抑制效果，具有广谱抗病毒能力。

(4)相较于传统硫酸乙酰肝素蛋白多糖仿生纳米粒子病毒灭活能力较弱的问题，该脂质体能够通过相转变策略破坏病毒囊膜，引起病毒基因组的泄露，对病毒实现高效灭活。

附图说明

图1为实施例1中制备得到的pH响应相转变磺酸脂质体在pH 7.4、pH 6.8和pH 6.0环境中的冷冻透射电镜图(Cyro-EM)。

图2为实施例1中制备得到的不同DOTAP占比的pH响应相转变磺酸脂质体在pH 7.4和pH 6.0环境中的流体力学直径(a)以及DOTAP占比为25％的pH响应相转变磺酸脂质体在pH7.4和pH6.0环境中的尺寸分布(b)。

图3为应用例1中野生型新型冠状病毒(SARS-CoV-2)与pH响应相转变磺酸脂质体共孵育后在pH 7.4及pH 6.0环境中的冷冻透射电镜图。

图4为应用例2中与pH响应相转变磺酸脂质体孵育后在pH 7.4和pH 6.0环境中新冠假病毒内基因释放的RNA电泳条带及条带强度统计。

图5为应用例3中pH响应相转变磺酸脂质体对HEK-293T细胞的毒性。

图6为应用例4中pH响应相转变磺酸脂质体在pH 7.4环境中对Omicron变异型新型冠状病毒假病毒、慢病毒载体LV以及I型单纯疱疹病毒HSV-I的感染率抑制曲线及EC50。

图7为应用例4中pH响应相转变磺酸脂质体在pH 6.0环境中对Omicron变异型新型冠状病毒假病毒、慢病毒载体LV以及I型单纯疱疹病毒HSV-I的感染率抑制曲线及EC50。

图8为应用例5中pH响应相转变磺酸脂质体在pH 7.4环境中与溶酶体(上)及与空载慢病毒LV(下)在细胞中的内吞共定位。

图9为应用例6中HEK-293T细胞分别与空载慢病毒LV、LV与pH响应相转变磺酸脂质体在pH 7.4环境下以及LV与pH响应相转变磺酸脂质体在pH 6.0环境下共孵育后的激光共聚焦图像。

图10为应用例7中野生型新型冠状病毒假病毒、慢病毒载体LV以及I型单纯疱疹病毒HSV-I的病毒灭活测试。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本领域技术人员在理解本发明的技术方案基础上进行修改或等同替换，而未脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围内。

以下具体实施方式中所采用的原料均购于市场。其中，野生型新型冠状病毒(Wide-type SARS-CoV-2)假病毒是指绿色荧光蛋白(GFP)基因整合到相应病毒囊膜中而组装成的病毒，能够感染易感细胞并表达出绿色荧光蛋白，但不具备病毒复制的能力。

实施例1pH响应相转变磺酸脂质体的制备

1)pH响应相转变磺酸脂质体的制备过程如下：

步骤一：按照摩尔比2:1:1:1:0.8分别称取DOPE、DOTAP、OA、HSA和Cho，使用体积比为8:2的氯仿/甲醇混合溶剂将各组分分别溶解配置为浓度10mM的溶液备用。

步骤二：按DOPE、DOTAP、OA、HSA和Cho的溶液加入梨形烧瓶中，再额外加入约20mL氯仿/甲醇混合溶剂以保证脂质完全溶解。在55℃水浴中旋转蒸发去除溶剂，并使用高纯氮气将瓶内残留溶剂气体吹干，即可在烧瓶内壁得到由脂质构成的薄膜

步骤三：向烧瓶中加入少量PBS，使用水浴式超声波清洗机将烧瓶内壁的脂质薄膜剥离至PBS中。

步骤四：将含有脂质的PBS溶液转移到5mL离心管中，并使用探头式超声波细胞破碎仪以60W的功率对脂质体进行超声处理2min，直至溶液由乳白色转变至乳光色，即可制备得到pH响应相转变磺酸脂质体。

2)实验结果与分析

冷冻透射电镜表征了pH响应相转变磺酸脂质体分别在pH 7.4、pH 6.8和pH 6.0环境中的形貌，结果如图1所示。制备得到的脂质体在高pH环境中呈稳定分散的球型，直径主要分布在30-60nm左右。

从图1可见，随着环境pH的降低，由于脂质体组成中弱酸性的阴离子脂质OA的亲水头被质子化，脂质体的负电性下降，粒子之间的静电排斥作用减弱，从而导致脂质体发生聚集。随着环境pH的进一步降低，OA进一步被质子化，分子形状从圆锥形转变为倒圆锥形，脂质体难以维持脂双层结构，进而引起脂质体发生大规模的聚集以及相转变。由图1可见脂质体由原本的脂双层结构转变至六角相，并能看到脂质体重新排列成的晶格条纹，说明了制备得到的脂质体具有优异的pH响应相转变能力。

实施例2

按照实施例1的制备过程，为了调节脂质体的pH响应性，使得脂质体能够在生理环境中保持稳定分散，而在溶酶体或炎症组织低pH环境中聚集并发生相转变，我们探究了掺入阳离子磷脂DOTAP的比例对pH响应性的影响，故同时也制备了DOTAP占DOPE、OA和HSA总摩尔比0％和12.5％的脂质体，其他组分占比关系不变，即DOPE、DOTAP、OA、HSA按照摩尔比2:0:1:1和2:0.5:1:1，其他步骤一致。

纳米粒度电位仪分析研究了制备得到的不同DOTAP占比的pH响应相转变磺酸脂质体分别在pH7.4和pH 6.0环境中流体力学直径，结果如图2(a)所示。在pH 7.4的环境中，随着阳离子磷脂DOTAP占比的增加，三种脂质体的流体力学直径虽然出现了一定程度的增加，但均能保持在30-60nm。而在pH 6.0的环境中，脂质体的流体力学直径则均出现了显著的升高。其中，掺有25％DOTAP的脂质体流体力学直径变化最为显著，如图2(b)所示，当环境pH从7.4降低至6.0时，其流体力学直径从55.74±5.01nm升高至976.33±5.94nm，进一步说明了脂质体发生了大规模的聚集以及相转变。

应用例1：使用冷冻电镜表征脂质体在不同pH下与病毒的作用模式

1)实验步骤

首先用超速离心将用甲醛灭活的野生型新型冠状病毒(SARS-CoV-2)浓缩至10^10PFU/mL。吸取少量SARS-CoV-2浓缩液，与等体积脂质体混匀后置于37℃培养箱中孵育1小时。孵育结束后通过向样品中逐滴加入100mM柠檬酸溶液的方式来调整溶液pH至所需范围，再将样品孵育10min。然后吸取少量的样品至辉光处理过的多孔碳膜上，并使用冷冻制样机通过液态乙烷将病毒溶液快速冷却至玻璃态，最后用冷冻电镜在-185℃的条件下观察病毒和脂质体之间的相互作用方式。

2)实验结果与分析

如图3所示，野生型新型冠状病毒在不同pH环境中的形貌差异不大，说明病毒在低pH环境中依旧具有感染细胞的能力。在将病毒与脂质体共孵育后可以观察到，即使脂质体在高pH环境中也能和病毒发生较强的相互作用，甚至还能与病毒发生膜融合。而在低pH环境中，脂质体发生了明显的相转变，与此同时还能够破坏病毒的囊膜结构。

应用例2：RNA凝胶电泳测试脂质体在低pH环境中破坏病毒结构引起病毒基因组的泄露

1)实验步骤

将30μg/mL脂质体与10^8TU/mL慢病毒混合后在37℃培养箱中孵育1h，随后通过向其中逐滴加入100mM柠檬酸溶液将其pH调至合适的范围。将处理后的溶液加入截留分子量为100kDa的超滤管中，5000rpm离心15min并收集下层滤液。

将0.8g琼脂糖加入100mL 1×TEA后，将溶液放入微波炉中加热使琼脂糖融化，并在其固化前向其中加入5μL Goldview核酸染料，混合均匀后倒入模具中静置凝固制得凝胶。随后取5μL含病毒RNA的滤液，将其与1μL6×loading buffer混合均匀后加入琼脂糖凝胶孔中。在120V电压条件下电泳15min后使用荧光及化学发光成像仪进行成像，并对各条带的灰度值进行定量分析。

2)实验结果及分析

参见图4，脂质体在低pH环境中孵育的病毒RNA滤液荧光强度明显高于高pH环境。对灰度值进行定量分析后发现低pH环境中脂质体导致病毒的RNA泄漏量大约是高pH环境下的2倍。该pH响应相转变磺酸脂质体能够在低pH环境下破坏病毒囊膜结构，并引起病毒内部基因组的泄露。

应用例3：CCK-8法检测pH响应相转变磺酸脂质体的细胞毒性

1)实验步骤

将NIH-3T3细胞以每孔10000个细胞的密度接种于96孔板，培养过夜使细胞贴壁。用含10％FBS的新鲜DMEM高糖培养基将脂质体分别稀释至50μg/mL，100μg/mL，150μg/mL，200μg/mL，300μg/mL。96孔板中每5个复孔为一组，向每孔中加入200μL稀释好的脂质体，并在37℃培养基中孵育24h。之后吸弃培养液，向每孔中加入100μL CCK-8溶液，37℃培养2h后，使用酶标仪检测各孔在450nm处的吸光度。

2)实验结果与分析

参见图5，本发明设计的pH响应相转变磺酸脂质体未对NIH-3T3细胞表现出明显的细胞毒性。

应用例4：pH响应相转变磺酸脂质体广谱抗病毒能力

1)实验步骤

将新型冠状病毒受体ACE2过表达的HEK-293T细胞以20000个细胞每孔的密度接种于48孔板，提前孵育24h。将pH响应相转变磺酸脂质体用Omicron变异型新型冠状病毒假病毒梯度稀释，于37℃培养箱孵育1h后直接加入到接种的细胞中，或用1M HCl将溶液pH调整至6.0，然后加入到接种的细胞中。37℃培养2天后，使用流式细胞仪检测细胞内绿色荧光蛋白的表达，用于表征细胞受病毒感染的情况。与仅加入病毒组细胞的绿色荧光蛋白表达情况做对比，得到不同浓度pH响应相转变磺酸脂质体抑制新型冠状病毒的抑制效率以及半最大有效浓度(EC50)。

将HEK-293T细胞以20000个细胞每孔的密度接种于48孔板，提前孵育24h。将pH响应相转变磺酸脂质体用慢病毒载体LV梯度稀释，孵育1h后直接加入到接种的细胞中，或用1M HCl将溶液pH调整至6.0，然后加入到接种的细胞中。37℃培养2天后，使用流式细胞仪检测细胞内绿色荧光蛋白的表达，用于表征细胞受病毒感染的情况。与仅加入病毒组细胞的绿色荧光蛋白表达情况做对比，得到不同浓度pH响应相转变磺酸脂质体抑制新型冠状病毒的抑制效率以及半最大有效浓度(EC50)。

将Vero细胞接种于48孔板，提前孵育24小时。将pH响应相转变磺酸脂质体用I型单纯疱疹病毒梯度稀释，于37℃中孵育1小时后直接加入到接种的细胞中，或用1M HCl将溶液pH调整至6.0，然后加入到接种的细胞中。37℃培养6天后，吸取100μL病毒细胞培养物，用核酸提取试剂盒(磁珠法)和全自动核酸提取仪提取病毒核酸，并使用qPCR检测核酸水平。与仅加入病毒组的核酸水平做对比，得到不同浓度pH响应相转变磺酸脂质体抑制新型冠状病毒的抑制效率以及半最大有效浓度(EC50)。

2)实验结论

参见图6、图7，pH响应相转变磺酸脂质体对Omicron变异型新型冠状病毒假病毒在pH 7.4和pH 6.0下的EC50分别为54.31μg/mL和11.77μg/mL，对慢病毒载体LV在pH 7.4和pH6.0下的EC50分别为27.15μg/mL和5.162μg/mL，对I型单纯疱疹病毒HSV-I在pH 7.4和pH6.0下的EC50分别为6.08μg/mL和1.81μg/mL。该pH响应相转变磺酸脂质体在高pH和低pH环境中都能在安全的浓度下有效抑制多种不同病毒的感染，具有广谱抗病毒的能力。

应用例5：pH响应相转变磺酸脂质体和病毒在溶酶体中的共定位

1)实验步骤

将HEK-293T细胞以200000个细胞每皿的密度接种于激光共聚焦培养皿中，并在37℃培养箱中孵育24h使其贴壁。将标记有罗丹明B的PE磷脂以1％的浓度掺入脂质体中以制备罗丹明B负载的脂质体。用无血清无酚红的新鲜DMEM高糖培养基将罗丹明B负载的脂质体稀释至200μg/mL，并将脂质体溶液加入激光共聚焦皿中，于37℃孵育2h使细胞进行充分的内吞。然后将溶液吸出，用PBS清洗3遍后，用50nM的Lysotraker溶酶体染料孵育细胞1h，吸弃孵育液后用PBS清洗3遍。之后向培养皿中加入4％的多聚甲醛溶液，常温下孵育10min以固定细胞。吸弃多聚甲醛溶液后用PBS清洗细胞三次。清洗完后向培养皿中加入1μg/mL的DAPI溶液，室温孵育15min后再用PBS清洗3遍，最后向培养皿中加入1mL PBS以保持细胞状态。最后使用激光共聚焦显微镜观察脂质体(红色荧光)和溶酶体(绿色荧光)的共定位。

将空载的慢病毒与10μM亲脂性染料DiO混合后置于37℃摇床上孵育15min。之后用截留分子量为100kDa的超滤管在4℃、5000rpm条件下离心15min，并用PBS洗涤三次以除去多余的荧光染料，即可制备得到病毒包膜带有绿色荧光的DiO-LV。

将HEK-293T细胞以200000个细胞每皿的密度接种于激光共聚焦培养皿中，并在37℃培养箱中孵育24h使其贴壁。把200μg/mL罗丹明B负载的脂质体与10^6TU/mL DiO-LV置于无血清无酚红的新鲜DMEM高糖培养基中孵育1h，随后加入培养皿中于37℃孵育2h使细胞进行充分的内吞。然后吸弃溶液，用PBS清洗细胞3遍后用4％多聚甲醛固定，清洗3遍后用DAPI染色，再清洗3遍后加入1mL PBS保持细胞形态。最后使用激光共聚焦显微镜观察脂质体(红色荧光)和病毒(绿色荧光)的共定位。

2)实验结果与分析

参见图8，上图显示脂质体能够被摄取到细胞内部，并与细胞内溶酶体存在明显的荧光共定位现象。下图显示的脂质体与病毒的共定位表明脂质体能够和病毒一起被内吞到细胞内部。两者说明，本发明制备的pH响应相转变磺酸脂质体在高pH环境下能够与病毒结合后以细胞内吞的方式在溶酶体酸性环境中发生相转变灭活病毒。

应用例7：pH响应相转变磺酸脂质体在低pH环境下对病毒的胞外灭活

1)实验步骤

将HEK-293T细胞以200000个细胞每皿的密度接种于激光共聚焦培养皿中，并在37℃培养箱中孵育24h使其贴壁。把200μg/mL罗丹明B负载的脂质体与10^6TU/mL DiO-LV置于无血清无酚红的新鲜DMEM高糖培养基中孵育1h后用1M HCl将溶液pH调至6.0，随后加入培养皿中于37℃孵育2h。然后吸弃溶液，用PBS清洗细胞3遍后用4％多聚甲醛固定，清洗3遍后用DAPI染色，再清洗3遍后加入1mL PBS保持细胞形态。最后使用激光共聚焦显微镜观察脂质体(红色荧光)和病毒(绿色荧光)与细胞(蓝色荧光)的相互作用情况。

2)实验结果与分析

参见图9，在pH 6.0的环境下，病毒的绿色荧光基本上没有出现在细胞内，说明在低pH环境中，脂质体能够在胞外破坏病毒结构，实现病毒灭活，阻止其感染细胞。

应用例8：pH响应相转变磺酸脂质体病毒灭活能力

1)实验步骤

将ACE2过表达的HEK-293T细胞接种于96孔板中，提前孵育24h。将pH响应相转变磺酸脂质体与野生型新型冠状病毒假病毒于37℃孵育1h。使用pH 7.4和pH 6.0的PBS分别将病毒溶液稀释10倍后再用培养基梯度稀释10^5倍。将稀释后的病毒加入接种于孔板的细胞中，培养48h后用荧光显微镜统计细胞绿色荧光蛋白的表达情况，并根据荧光照片及稀释倍数计算出病毒的滴度。

将HEK-293T细胞接种于96孔板中，提前孵育24h。将pH响应相转变磺酸脂质体与慢病毒载体LV孵育1h。使用pH 7.4和pH 6.0的PBS分别将病毒溶液稀释10倍后再用培养基梯度稀释10^5倍。将稀释后的病毒加入接种于孔板的细胞中，培养48h后用荧光显微镜统计细胞绿色荧光蛋白的表达情况，并根据荧光照片及稀释倍数计算出病毒的滴度。

将Vero细胞接种于96孔板中，在37℃培养箱中培养24h。将pH响应相转变磺酸脂质体与I型单纯疱疹病毒孵育1h。使用pH 7.4和pH 6.0的PBS分别将病毒溶液稀释10倍后再用培养基梯度稀释10^5倍。将稀释后的病毒加入接种于孔板的细胞中，培养6天后吸取100μL病毒细胞培养物，用核酸提取试剂盒(磁珠法)和全自动核酸提取仪提取病毒核酸，并使用qPCR检测核酸水平。

2)实验结果与分析

参见图10，在pH 7.4条件下，与脂质体作用后的病毒在经过PBS的大量稀释后能够恢复感染细胞的能力，且感染滴度与纯病毒组相差不大，说明在pH 7.4条件下，脂质体主要依靠对病毒的粘附作用实现对病毒的中和。而若将与脂质体共孵育的病毒置于低pH环境中，即使进行高倍稀释，病毒滴度还是会有明显的下降，病毒依旧不会恢复感染细胞的能力，说明脂质体在低pH环境中能够实现对病毒的灭活，并且这种灭活具有广谱的性质。