CD80和CD86结合蛋白组合物及其用途

本申请是申请日为2017年9月19、发明名称为“CD80和CD86结合蛋白组合物及其用途”、PCT申请号：PCT/US2017/052264、专利申请号：201780057250.0的中国发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及一种CD80和CD86结合蛋白组合物及其用途。

背景技术

用抗CTLA-4抗体进行治疗已被证明是用于增强临床前模型中的抗肿瘤免疫力的有力工具(10)。用针对CTLA-4的抗体进行的单一疗法促进对各种来源的可移植肿瘤的排斥。基于有希望的临床前肿瘤模型研究，已在不同的人类恶性肿瘤中探索针对CTLA-4的抗体的临床潜力。尽管抗CTLA-4(伊匹单抗，作为Yervoy销售，在美国专利号6,984,720中公开)已证明在治疗黑素瘤中有效，但是CTLA-4的治疗和靶向与自身免疫样毒性有关。另外，抗CTLA-4mAb诸如伊匹单抗和替西木单抗用于与抗PD-1/PD-L1抗体的组合疗法，其具有优异的治疗效果。然而，改善的治疗效果与甚至更高比率的3级和4级器官毒性相关。抑制CTLA-4的特征性副作用通常称为免疫相关不良事件(irAE)，并且最常见的irAE是皮疹、肝炎、结肠炎和内分泌病，特别是垂体机能减退。因此，在保持抗CTLA-4单克隆抗体(mAb)的癌症治疗效果的同时治疗irAE的方面在医学上存在大量未满足的需求。

发明人已证明临床证明的治疗性抗人类CTLA-4mAb和两种抗小鼠Ctla-4mAb两者均在生理学相关条件下诱导肿瘤排斥而不阻断B7-CTLA-4相互作用。因此，甚至对于可有效阻断B7-CTLA-4相互作用的mAb，这种阻断对于肿瘤排斥也不是必需的。这些数据驳斥了抗CTLA-4mAb通过检查点阻断赋予免疫治疗作用的假设(108)。为了支持这一观点，进一步表明由伊匹单抗和可能的其他抗CTLA-4mAb介导的免疫治疗效果不受阻断B7-1和B7-2的影响，这对于自身免疫疾病的发病机制至关重要。

积累的数据表明，人类CTLA-4基因通过可变剪接编码两种不同的蛋白质同种型：一种具有跨膜结构域，因此所述蛋白质可能锚定在膜中，并且另一种缺乏跨膜结构域并且预测为分泌型(sCTLA-4)(128)。重要的是，遗传学研究表明，降低可溶性同种型相对丰度的CTLA-4的多态性与多种自身免疫疾病密切相关(64)。具有自身免疫倾向等位基因的受试者表达较少sCTLA-4mRNA的事实表明sCTLA-4可能是保护性的。这一观点得到了以下支持：阿巴西普(abatacept)的广泛治疗作用(129，130)，所述阿巴西普呈可溶性CTLA-4的形式，以及一项遗传研究，其中sCTLA-4同种型的选择性消融加速小鼠中I型糖尿病的发展(131)。基于这些遗传数据，发明人已认识到显示与可溶性CTLA-4具有最差结合的抗CTLA-4抗体应产生最少的irAE。实际上，基于抗体对围产期期间用抗CTLA-4抗体治疗的小鼠的体重增加的影响，发现四种抗CTLA-4mAb之间存在强烈的相关性：伊匹单抗对sCTLA-4具有最强的结合，并且是毒性最强的抗CTLA-4，而抗体L3D10对sCTLA-4具有较弱的结合，并且毒性最小。此外，优先降低与sCTLA-4结合的人源化L3D10变体显示出与亲本抗体相比进一步改善的安全性特征。

可溶性CTLA-4分子的保护性功能进一步支持使用可溶性CTLA-4融合蛋白来减轻、减少或治疗irAE的方法。然而，由于具有抗CTLA-4mAb诱导的irAE患者具有循环抗CTLA-4mAb，所以CTLA-4融合蛋白诸如阿巴西普不仅将通过阻止他们与细胞相关的CTLA-4分子结合而降低抗CTLA-4mAb的治疗作用，还将变得无效，因为他们在与循环抗CTLA-4mAb形成免疫复合物后将从循环中清除。因此，本领域需要改进的CTLA-4免疫疗法组合物和方法。

发明内容

本发明涉及人类CTLA-4蛋白和抗B7-1和抗B7-2组合物，以及他们用于免疫疗法和治疗自身免疫疾病和炎症，以及用于减少与抗CTLA-4免疫疗法相关的自身免疫副作用的用途。具体地，本发明涉及一种CTLA-4蛋白，其表现出与癌症免疫疗法中使用的抗CTLA-4抗体的降低或消除的结合，但保留结合到B7-1和B7-2的能力。

所述CTLA-4蛋白可包括一种CTLA-4蛋白，其中抗CTLA-4抗体结合表位的氨基酸进行修饰或突变，以便与CTLA-4的野生型细胞外结构域相比，减少或消除抗CTLA-4抗体与CTLA-4蛋白的结合。CTLA-4蛋白可具有抗癌免疫治疗活性。抗CTLA-4抗体可以是伊匹单抗。CTLA-4蛋白可保留其结合B7-1和B7-2中的至少一种的能力。CTLA-4蛋白可能不阻断抗CTLA-4抗体的抗癌免疫治疗作用。

CTLA-4蛋白可包含成熟人类CTLA-4的细胞外结构域、其变体或其活性片段。CTLA-4蛋白可包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：34、36、38、39、40和46-48、其变体以及其活性片段。CTLA-4蛋白可以是可溶的。CTLA-4蛋白可包括一种CTLA-4融合蛋白，其中人类CTLA-4的细胞外结构域附接到人类免疫球蛋白重链恒定区。CTLA-4蛋白可包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO：17、19、21、22、23和42-44。CTLA-4蛋白可以是贝拉西普(belatacept)。

在另一个实施方案中，本发明涉及结合人类B7-1和B7-2中的至少一种的抗体组合物，以及他们用于免疫疗法和治疗自身免疫疾病和炎症，以及用于减少与抗CTLA-4免疫疗法相关的自身免疫副作用的用途。

本文还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文所述的蛋白质或抗体。药物组合物可包含生理学上可接受的载体或赋形剂。

另一方面，本文提供用于减少受试者中的一种或多种免疫功能或反应的方法，其包括向有需要的受试者施用CTLA-4蛋白或抗B7抗体组合物或其药物组合物。在一个具体实施方案中，本文提供用于预防、治疗或控制疾病的方法，其中希望抑制或减少一种或多种免疫功能或反应。所述疾病可以是自身免疫疾病，诸如类风湿性关节炎(RA)或幼年型特发性关节炎(JIA)。

本文所述的组合物还可用于减轻、最小化或治疗与免疫疗法相关的免疫相关不良反应。特别地，所述组合物可包含阻断或降低B7-1和B7-2功能而不影响抗CTLA-4抗体的癌症免疫治疗活性的分子。所述分子可以是CTLA-4蛋白、抗B7抗体或其药物组合物。所述分子可以是可在功能上阻断B7-1和B7-2中的至少一种与CD28和CTLA-4中的至少一种结合的抗体，并且可以是抗B7-1或抗B7-2。所述抗体可能够结合B7-1和B7-2两者，并且可包含与B7-1和B7-2两者反应的结合位点。

本文所述的组合物可与抗CTLA-4免疫疗法组合或在抗CTLA-4免疫疗法的背景下施用于可能患有癌症的受试者。所述组合物可预防性地用于在开始抗CTLA-4治疗之前或在出现irAE临床表现之前预防irAE。在另一个实施方案中，所述组合物治疗性地用于在开始抗CTLA-4治疗并诊断出临床症状之后治疗irAE。

附图说明

图1.人类CTLA-4序列。图1A示出人类CTLA-4蛋白的序列(NCBI登录号NP_005205；SEQ ID NO：1)，其中信号肽加粗体，IgV结构域加下划线并且跨膜结构域加双下划线。图1B示出阿巴西普的序列(SEQ ID NO：2)，其中CTLA-4序列加粗体示出，蛋白质的剩余部分包含IgG1 Fc区。

图2.嵌合L3D10和10D1在MC38肿瘤模型中的治疗作用。将体重大约20克的人类CTLA-4敲入小鼠用于所述研究。将1x10

图3.嵌合L3D10和10D1与抗PD-1组合的不良反应。顶图描绘实验设计。使用体重大于4克的10天大仅雌性人类CTLA-4-敲入小鼠进行研究。它们接受指示的蛋白质或其组合。箭头指示治疗时间(100μg/小鼠/治疗)。显示的数据是重量增加％的平均值和S.D.。嵌合L3D10和10D1在成年小鼠中具有相当的癌症治疗作用(图2)，但是当10D1与抗PD-1mAb组合时，看到不同的不良反应。

图4.嵌合L3D10和10D1与抗PD-1组合的不良反应。所述图示出来自图3中概述的实验的小鼠在第42天的最终体重，所述小鼠接受对照IgG、10D1+抗PD-1或嵌合L3D10+抗PD-1(每组n＝5)。在抗PD1+10D1组合中观察到显著的体重降低，这在抗PD-1+嵌合L3D10组合中未看到。

图5.嵌合L3D10和10D1与抗PD-1组合的病理学作用。组1是hIgG，组2是10D1+抗-PD1，并且组3是L3D10+抗PD1。为了进一步检查当与抗PD-1组合施用时，L3D10与10D1相比的相对毒性，研究以上图4中描述的小鼠的大体解剖结构。用10D1+PD-1处理的小鼠中的子宫/卵巢/膀胱和胸腺明显较小，而用L3D10+抗PD-1处理的小鼠中的器官与hIgG对照相当。相比之下，从用10D1处理的小鼠解剖的心脏的大小看起来更大，具有明显更白的外观。

图6.用10D1与抗PD-1组合治疗导致异常红细胞生成。鉴于图5中观察到的心脏的差异，在小鼠内研究红细胞生成，并且相对于用L3D10+抗PD-1或对照抗体(hIgG)处理的组，在用10D1+抗PD-1处理的小鼠中观察到明显的差异，所述差异是非常相似的。来自用10D1+抗PD-1处理的小鼠的骨髓具有明显更白的颜色(图6A)，并且分离的血液几乎完全是白色的(图6B)。据此，当使用CD119和CD71标记物的分布分析红细胞的分化时，在10D1+抗PD-1处理的小鼠中观察到经历IV期发育的细胞数量的统计学显著降低。代表性的FACS图在图6C中示出，而概要数据在图6D中呈现。

图7.用嵌合L3D10和10D1与抗PD-1组合处理的小鼠的毒性评分。总结此组织数据并示出用10D1+抗PD-1处理的小鼠相对于用L3D10+抗PD-1处理的小鼠的高毒性评分，用L3D10+抗PD-1处理的小鼠具有仅略高于hIgG对照小鼠组的评分。

图8.L3D10和10D1显示对板固定的CTLA-4的相似结合模式。用1μg/ml的CTLA-4-His蛋白(Sino Biological，China)包被ELISA板。添加给定浓度的生物素化结合蛋白，并且使用HRP缀合的链霉抗生物素蛋白测量结合。10D1-1和10D1-2是相同抗体的两个独立材料批次。hIgG-Fc是人类Ig阴性对照。

图9.L3D10显示降低的结合可溶性CTLA-4。将给定浓度的抗人类CTLA-4mAb在板上包被过夜，在洗涤并用牛血清白蛋白封闭后，以0.25μg/m1添加生物素化CTLA-4-Fc。在温育并洗涤之后，使用HRP标记的链霉抗生物素蛋白测量捕获的CTLA-4-Fc的量。

图10.10D1+抗-PD-1在Ctla-4

图11.与10D1相比，人源化L3D10抗体的抗肿瘤活性。在人类CTLA-4敲入小鼠中使用MC38小鼠肿瘤模型，与嵌合L3D10抗体和10D1相比，研究人源化L3D10抗体的抗肿瘤活性。图11A示出体内实验的治疗方案。从接种后第7天开始，每3天给与小鼠总计4个剂量的抗体。所有人源化抗体(每组n＝6)完全根除肿瘤并且与10D1相当(图11B)。

图12.在10D1、mAb4和mAb5雌性之间针对其与抗PD-1mAb的组合毒性的比较。在出生后第10天或第11天，用四次注射抗体(100μg/小鼠/注射，每三天一次)或对照Fc处理雌性Ctla-4

各种处理之间的比较的p值如下。

图13.L3D10的人源化不影响与固定的CTLA-4的结合。如图23所述，确定人源化L3D10抗体结合固定的CTLA-4的能力。X轴指示添加到溶液中的抗CTLA-4mAb的浓度。人源化不影响与固定的CTLA-4的结合，并且所有三种人源化抗体都显示出与亲本嵌合L3D10抗体和10D1的相似结合。当使用CTLA-4-Ig代替CTLA-4-his时，观察到相似的模式。

图14.人源化进一步降低L3D10与可溶性CTLA-4的结合。如图23所述，确定人源化L3D10抗体结合可溶性CTLA-4的能力。X轴指示包被到ELISA板上的抗CTLA-4mAb的浓度。相对于亲本L3D10嵌合抗体，人源化进一步降低与可溶性CTLA-4的结合。当使用CTLA-4-Ig代替CTLA-4-his时，观察到相似的模式。

图15.人类、猕猴和小鼠CTLA-4细胞外结构域的比对。人类(Hm；SEQ ID NO：2的氨基酸1-124)，猕猴(Mk)和小鼠(Ms)CTLA-4蛋白细胞外结构域的氨基酸序列比对，并且保守氨基酸(相对于人类序列)用短划线(-)示出。为了帮助比对，小鼠序列在突出显示的位置处具有缺失和插入(相对于人类和猴序列)。已知的B7-1Ig结合位点以粗体示出并加下划线。所述序列证明人类和猴序列是高度保守的，而小鼠序列具有许多氨基酸差异。基于此序列比对，设计11种突变体(M1-M11)人类CTLA-4Fc蛋白，其并入鼠特异性氨基酸-并入到每种突变体蛋白中的氨基酸以蓝色示出。

图16A和图16B.WT(SEQ ID NO：2)和突变体CTLA-4Fc蛋白(SEQ ID NO：7-17)的氨基酸序列组成。如图所示，设计编码WT CTLA-4Fc蛋白和并入鼠Ctla-4氨基酸的11种突变体蛋白M1-M11的DNA构建体。氨基酸序列是针对成熟蛋白质，包括IgG1 Fc部分，但不包括信号肽。已知的B7-1Ig结合位点以大写字母示出并加双下划线。突变体中被替换的鼠氨基酸残基以小写体示出。蛋白质的IgG1 Fc部分加下划线。

图17A至图17D.M11中的突变(AA103-106，YLGI＞fcGm)选择性地消除与人类CTLA-4结合的抗体。显示的数据是一式两份的平均值，描绘B7-1Fc(图17A)、L3D10(图17B)、mAb4(图17C)和mAb5(图17D)结合到板包被的hCTLA-4-Fc(空心圆圈)、mCTLA-4-Fc(实心三角形)、M11(实心圆圈)和IgG1-Fc(空心三角形)的结合。

图18.L3D10、mAb4和mAb5的表位绘制成与B7-1-CTLA-4复合物的3-D结构中的B7-1结合位点相邻。B7-1结合基序和抗体表位以不同方式着色。CTLA-4上方的B7-1描绘为空间填充的条带，而CTLA-4描绘为未填充的条带。

图19.突变体CTLA-4Fc蛋白M12-M17(SEQ ID NO：18-23)的氨基酸序列组成。如图所示，设计编码并入鼠Ctla-4氨基酸的6种突变体CTLA-4Fc蛋白M12-M17的DNA构建体。氨基酸序列是针对成熟蛋白质，包括IgG1 Fc部分，但不包括信号肽。已知的B7-1Ig结合位点以大写字母示出并加双下划线。突变体中被替换的鼠氨基酸残基以小写体示出。蛋白质的IgG1 Fc部分加下划线。

图20A和图20B.鉴定保留与生物素化B7-1Fc结合的CTLA-4Fc突变体蛋白。将CTLA4-Fc融合蛋白M1-M17包被到96孔板上。将在给定浓度下的生物素化B7-1Fc与板一起温育，并且用链霉抗生物素蛋白缀合的HRP检测。显示的数据是一式两份实验的平均值。

图21A和图21B.鉴定保留与生物素化B7-1和B7-2蛋白结合的CTLA-4Fc突变体蛋白。将突变体CTLA4-Fc融合蛋白(1μg/ml)包被到96孔板上。将在给定浓度下的生物素化B7-1Fc(图21A)和B7-2Fc(图21B)与板一起温育，并且用链霉抗生物素蛋白缀合的HRP检测。显示的数据是一式两份实验的平均值。

图22A和图22B.鉴定丧失与生物素化伊匹单抗(图22A)和替西木单抗(图22B)的结合的CTLA-4Fc突变体蛋白。将突变体CTLA4-Fc融合蛋白(1μg/ml)包被到96孔板上。将在给定浓度下的生物素化抗体mAb2与板一起温育，并且用链霉抗生物素蛋白缀合的HRP检测。显示的数据是一式两份实验的平均值。

图23A和图23B.鉴定丧失与生物素化mAb4的结合的CTLA-4Fc突变体蛋白。将CTLA4-Fc融合蛋白M1-M17包被到96孔板上。将在给定浓度下的生物素化抗体mAb4与板一起温育，并且用链霉抗生物素蛋白缀合的HRP检测。显示的数据是一式两份实验的平均值。

图24A和图24B.鉴定丧失与生物素化mAb5的结合的CTLA-4Fc突变体蛋白。将CTLA4-Fc融合蛋白M1-M17包被到96孔板上。将在给定浓度下的生物素化抗体mAb5与板一起温育，并且用链霉抗生物素蛋白缀合的HRP检测。显示的数据是一式两份实验的平均值。

图25A和图25B.鉴定丧失与生物素化mAb4(图25A)和mAb5(图25B)的结合的CTLA-4Fc突变体蛋白。将突变体CTLA4-Fc融合蛋白(1μg/ml)包被到96孔板上。将在给定浓度下的生物素化抗体mAb4(图25A)或mAb5(图25B)与板一起温育，并且用链霉抗生物素蛋白缀合的HRP检测。显示的数据是一式两份实验的平均值。

图26A至图26F.伊匹单抗的治疗作用不通过阻断B7-1和/或B7-2来实现。图26A.确认抗B7 mAb的阻断活性。将表达小鼠B7-1或B7-2的CHO细胞与20mg/ml抗B7-1(上图)或抗B7-2(下图)和生物素化人类CTLA-4Fc(2mg/ml)的混合物一起温育1小时。在洗去未结合的蛋白质之后，通过PE缀合的链霉抗生物素蛋白检测细胞表面CTLA-4Fc，并通过流式细胞术测量。显示的数据是代表性FACS图，并且重复两次。图26B.实验设计图：携带MC38肿瘤的Ctla-4

图27.CTLA-4-Fc融合蛋白M11和M15针对由与抗PD-1和抗CTLA-4(伊匹单抗)的组合疗法导致的irAE保护小鼠。

图28A和图28B.CTLA4-Fc突变体M15和M17不干扰伊匹单抗的免疫治疗作用。将Ctla-4

图29A和图29B.在用人类CD34+造血干细胞重建的NSG小鼠中M15和M17-2针对伊匹单抗诱导的体重减轻的保护性作用(图29A)和M15的潜在肝毒性(图29B)。基于体重人类白细胞重建和血液中人类T细胞的％，将16只雌性人源化小鼠随机分成4组。在第0、3和6天，分别用对照人类IgG Fc(400μg/注射)、伊匹单抗(100μg/注射)+人类IgG Fc(300μg/注射)、伊匹单抗(100μg/注射)+M15(300μg/注射)或伊匹单抗(100μg/注射)+M17-2(300μg/注射)处理4组。在第18天，小鼠接受另外一次注射，其中伊匹单抗的剂量为200μg/小鼠+人类IgG Fc(300μg/注射)、伊匹单抗(100μg/注射)+M15(300μg/注射)或伊匹单抗(100μg/注射)+M17-2(300μg/注射)。使用第0天作为100％，监测小鼠30天的体重变化。图29B.在接受伊匹单抗以及M15但不接受M17-2的小鼠中观察到ALT升高。

图30A至图30F.基于第31天的脾T细胞分析，M15和M17-2在伊匹单抗诱导的T细胞活化中的差异作用。如图29所述处理小鼠，并在第31天处死用于流式细胞术。CD4和CD8 T细胞(图30A和图30D)、中枢记忆(CD44

图31.M15和M17对NKT细胞扩增的差异作用。如图30中详述，不同的是分析NK T细胞(CD3

图32A至图32D.M15和M17-2对Treg频率(图32A和图32B)及其CTLA-4蛋白表达(图32C和图32D)的差异作用。如图29所述处理小鼠，并在第31天处死用于流式细胞术。

具体实施方式

本发明人已发现含有突变的可溶性CTLA-4融合蛋白，所述突变阻止他们与大多数抗CTLA-4mAb结合，同时保留他们结合抗原呈递细胞(APC)上的B7-1和B7-2的能力。令人惊讶的是，这些融合蛋白在不影响抗CTLA-4的癌症治疗作用的情况下预防抗CTLA-4mAb的自身免疫不良反应。

1.定义

本文使用的术语只用于描述特定实施方案的目的，而不意图是限制性的。如说明书和所附权利要求书中所使用，除非上下文另外明确规定之外，否则单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述(the)”包括复数指示物。

对于本文所列举的数值范围，明确涵盖了其间具有相同精度的每个中间数。例如，对于6-9的范围，除了6和9外还涵盖数字7和8，并且对于6.0-7.0的范围，明确涵盖了数字6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6,9以及7.0。

如本文所用，术语“蛋白质”、“肽”或“多肽”是指任何长度的氨基酸链，无论修饰如何(例如，磷酸化或糖基化)。氨基酸可以是天然的、合成的、或天然和合成的修饰或组合。本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽，优选地重组多肽。

如本文所用，当与多肽相关使用时，术语“部分”、“区段”和“片段”是指连续的残基序列，诸如氨基酸残基，其序列形成较大序列的子集。例如，如果将多肽经受用任何常见的内肽酶诸如胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶进行的处理，则由这种处理产生的寡肽将代表起始多肽的部分、区段或片段。因此，多肽的“片段”是指多肽的任何子集，其是全长蛋白质的较短多肽。通常，片段长度为五个或更多个氨基酸。

如本文所用，术语蛋白质的“可溶性部分”意指全长多肽的不包括跨膜部分或区段的任何部分的部分。例如，对于CTLA-4，可溶性部分将包括细胞外部分(具有或不具有N末端信号序列)，但不包括跨膜部分的任何部分(或者，至少不足以降低溶解度)。因此，人类CTLA-4的ECD显示为SEQ ID NO：3(即，全长序列SEQ ID NO：1的氨基酸36-161)，其中氨基酸1-35包含信号序列，并且不包括在成熟的细胞外并且因此可溶性的蛋白质中。

如本文所用，术语“融合蛋白”定义为使用本领域已知的方法连接在一起的一个或多个氨基酸序列。因此，连接的氨基酸序列形成一种融合蛋白。本领域已知的融合蛋白包括六组氨酸肽、血凝素“HA”标签(其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson，I.A.等人(1984)“The Structure Of An Antigenic Determinant In A Protein,”Cell，37：767-778))和“flag”标签(Knappik，A.等人(1994)“An Improved Affinity Tag Based On TheFLAG Peptide For Ihe Detection And Purification Of Recombinant AntibodyFragments,”Biotechniques 17(4)：754-761)。

本发明的多肽(或其片段)的衍生物、类似物或同源物可以是(i)其中一个或多个氨基酸残基被保守性或非保守性氨基酸残基(优选地保守性氨基酸残基)取代并且此类取代的氨基酸残基可以是或可以不是由遗传密码编码的氨基酸残基；或者(ii)其中一个或多种氨基酸残基包括取代基团；或者(iii)其中成熟多肽与另一种化合物，诸如增加多肽半衰期的化合物(例如，聚乙二醇)融合；或者(iv)其中另外的氨基酸与成熟多肽，诸如前导序列或分泌序列或用于纯化成熟多肽或前蛋白序列的序列融合。根据本文的教义，此类衍生物和类似物被认为在本领域技术人员的范围内。

如本文所用，术语“抗体”旨在表示具有“可变区”抗原识别位点的免疫球蛋白分子。术语“可变区”旨在将免疫球蛋白的这种结构域与抗体广泛共享的结构域(诸如，抗体Fc结构域)区分开。可变区包含“高变区”，其残基负责抗原结合。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(即，通常为轻链可变结构域中的大约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的大约残基27-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；参考44)和/或来自“高变环”的那些残基(即，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；参考45)。“框架区”或“FR”残基是除如本文定义的高变区残基外的那些可变结构域残基。术语抗体包括单克隆抗体、多特异性抗体、人类抗体、人源化抗体、合成抗体、嵌合抗体、骆驼抗体、单链抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、胞内抗体和抗独特型(抗Id)抗体(包括例如针对本发明抗体的抗Id和抗-抗Id抗体)。特别地，此类抗体包括任何类型的(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG

如本文所用，术语“活性片段”是指天然多肽或抗体或与天然多肽或抗体具有高序列同源性(例如，至少80％、85％、90％、95％、98％或99％氨基酸序列同一性)并且保留生物活性的多肽的一部分。“生物活性”的代表性实例包括结合B7蛋白和结合其天然受体或被特异性抗体结合的能力。例如，CTLA-4的活性片段能够结合B7.1或B7.2或结合到CTLA-4的配体。在优选的实施方案中，这种片段由CTLA-4蛋白的细胞外结构域(ECD)组成。

如本文所用，术语“分离的”意指描述感兴趣的化合物(例如，多核苷酸或多肽)，其处于与化合物天然存在的环境不同的环境中，例如，诸如通过将肽浓缩到在自然界中未发现的浓度而从其天然环境中分离。“分离的”意指包括处于基本上富含感兴趣的化合物和/或其中感兴趣的化合物得以部分或基本上纯化的样品内的化合物。

“基本上相同的”可意指第一和第二氨基酸序列在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290或300个氨基酸的区域内为至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

当提及保护动物免于疾病时，“治疗(Treatment)”或“治疗(treating)”意指预防、遏制、阻遏或完全消除疾病。预防疾病涉及在疾病发作之前向动物施用本发明的组合物。遏制疾病涉及在疾病诱发之后但在其临床表现之前向动物施用本发明的组合物。阻遏疾病涉及在疾病临床表现之后向动物施用本发明的组合物。

如本文所用，与对应野生型多肽的氨基酸序列相比，“变体”多肽含有至少一个氨基酸序列改变。如本文所用，“氨基酸序列改变”可以是例如一种或多种氨基酸的取代(可为保守取代)、缺失或插入。变体也可意指氨基酸序列基本上与具有氨基酸序列的参照蛋白相同并可保留至少一种生物活性的蛋白质。变体可以是多肽的衍生物、类似物或同源物。变体也可以是多肽的可溶性部分。氨基酸的保守性取代在本领域中被认为通常涉及微小变化，即以相似特性(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸来替换氨基酸。这些微小变化可部分地通过考虑氨基酸的亲水指数来鉴定，如本领域中所理解的。Kyte等人，J.Mol.Biol.157：105-132(1982)。氨基酸的亲水指数是基于其疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是相似的亲水指数的氨基酸可被取代并仍然保留蛋白质功能。一方面，亲水指数为±2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性还可被用来揭示会产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算所述肽最大的局部平均亲水性，这是已经被报道来与抗原性和免疫原性良好关联的有用测量。美国专利号4,554,101以引用方式全部并入本文。如本领域中所理解，用亲水性值相似的氨基酸进行取代可产生保留生物活性(例如免疫原性)的肽。可利用具有在±2内的亲水性值的氨基酸彼此进行取代。氨基酸的疏水性指数和亲水性值两者均受所述氨基酸的特定侧链影响。与所述观察一致的是，与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于这些氨基酸相对的相似性，并且特别是那些氨基酸的侧链，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小以及其他特性所揭示的。

2.B7-CTLA-4相互作用和免疫疗法

T细胞最佳地介导针对抗原的免疫反应的能力需要两种不同的信号传导相互作用。首先，已排列在抗原呈递细胞(APC)表面上的抗原必须以MHC：肽复合物形式呈递给抗原特异性天然T细胞(1，2)。这种呈递通过T细胞受体(TCR)传递信号，所述T细胞受体指导T细胞启动对所呈递抗原特异的免疫反应。其次，通过APC与不同T细胞表面分子之间的相互作用介导的一系列共刺激信号首先触发T细胞的活化和增殖并最终将他们抑制(3-5)。因此，第一信号赋予免疫反应特异性，而第二信号用于确定反应的性质、量值和持续时间，同时限制对自身的免疫。这些第二信号分子中特别重要的是APC的B7.1(CD80)(6)和B7.2(CD86)(7-9)配体与T淋巴细胞的CD28和CTLA-4受体(10-12)之间的结合。

CD28(分化簇28)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)是蛋白质免疫球蛋白超家族的成员，并且参与T细胞活化的调节。CD28在原初T细胞上组成型表达，并且结合B7.1和B7.2，从而提供T细胞活化和存活所需的共刺激信号。相比之下，在T细胞活化后，CTLA-4在T细胞上上调并与CD28竞争结合到B7.1和B7.2，从而传递用于T细胞活化的抑制信号。

B7家族分子具有膜近端IgC(恒定)结构域和膜远端IgV(可变)结构域。这些配体的CD28样受体家族共享一个共同的细胞外IgV样结构域。受体-配体对的相互作用主要通过配体和受体的IgV结构域中的残基介导(Schwartz等人，Nature Immunol.，3：427-434(2002))。晶体学分析揭示，CTLA-4/B7结合界面由CDR3-来自CTLA-4的类似环的相互作用支配，其由MYPPPY基序构成(Schwartz等人，Nature，410：604-608(2001)；以及Stamper等人，Nature，410：608-611(2001))。

已显示，针对CTLA-4的抗体在体外阻断CTLA-4与共刺激分子B7.1和B7.2之间的相互作用。这种阻断消除T细胞上CTLA-4介导的抑制信号，并且从而刺激可用作抗癌疗法的天然免疫反应。用抗CTLA-4抗体治疗已被证明是增强临床前模型中抗肿瘤免疫力的有力工具(10)。用针对CTLA-4的抗体进行的单一疗法促进对各种来源的可移植肿瘤的排斥。基于有希望的临床前肿瘤模型研究，已在不同的人类恶性肿瘤中探索针对CTLA-4的抗体的临床潜力。尽管抗CTLA-4(伊匹单抗，作为Yervoy销售，在美国专利号6,984,720中公开)已证明在治疗黑素瘤中有效，但是CTLA-4的治疗和靶向与自身免疫样毒性有关。抑制CTLA-4的特征性副作用通常称为免疫相关不良事件(irAE)，并且最常见的irAE是皮疹、肝炎、结肠炎和内分泌病，特别是垂体机能减退。因此，希望通过减少相关的irAE来改善抗CTLA-4抗体的安全性。

本发明人意外地发现，临床证明的治疗性抗人类CTLA-4mAb和两种抗小鼠Ctla-4mAb在生理学相关条件下诱导肿瘤排斥而不阻断B7-CTLA-4相互作用。因此，阻断CTLA-4与B7.1或B7.2的相互作用对于肿瘤排斥不是必需的，即使对于可有效阻断这些B7-CTLA-4相互作用的mAb也是如此。这些数据驳斥了抗CTLA-4mAb通过检查点阻断赋予免疫治疗作用的假设(108)。此外，本发明人已鉴定出具有降低的免疫相关毒性的抗CTLA-4抗体L3D10，从而证明癌症免疫性和irAE可以是遗传上非偶联的。

3.可溶性CTLA-4

积累的数据表明，人类CTLA-4基因通过可变剪接编码两种不同的蛋白质同种型：一种具有跨膜结构域，因此所述蛋白质可能锚定在膜中，并且另一种缺乏跨膜结构域并且预测为分泌型(sCTLA-4，SEQ ID NO：4)(128)。重要的是，遗传学研究表明，降低可溶性同种型相对丰度的CTLA-4的多态性与多种自身免疫疾病密切相关(64)。具有自身免疫倾向等位基因的受试者表达较少sCTLA-4mRNA的事实表明sCTLA-4可能是保护性的。这一观点得到了以下支持：阿巴西普的广泛治疗作用(129，130)，所述阿巴西普呈可溶性CTLA-4的形式，以及一项遗传研究，其中sCTLA-4同种型的选择性消融加速小鼠中I型糖尿病的发展(131)。

基于这些遗传数据，发明人已认识到显示与sCTLA-4具有最差结合的抗体应与最少的irAE相关联。实际上，本发明人鉴定具有降低的免疫相关毒性的抗CTLA-4抗体L3D10，其显示相对于膜结合或固定的CTLA-4与sCTLA-4具有降低的结合。基于抗体对围产期期间用抗CTLA-4抗体治疗的小鼠的体重增加的影响，发现四种抗CTLA-4mAb之间存在强烈的相关性：伊匹单抗对sCTLA-4具有最强的结合，并且是毒性最强的抗-CTLA-4，而L3D10对sCTLA-4具有最弱的结合，并且毒性最小。此外，L3D10抗体的人源化优先降低与sCTLA-4的结合，并且与亲本抗体相比似乎进一步改善安全性特征。

为了绘制L3D10亲本抗体和人源化变体的CTLA-4结合表位，发明人利用小鼠和人类CTLA-4蛋白质在物种之间与B7-1，但不与抗CTLA-4抗体交叉反应的事实。因此，本发明人设计许多人类CTLA-4Fc蛋白的突变体，其中来自人类CTLA-4蛋白的氨基酸簇被来自鼠Ctla-4蛋白的氨基酸(SEQ ID NO：5)替换。由于本研究中使用的抗CTLA-4抗体不与鼠Ctla-4结合，因此当抗体结合表位的关键残基被鼠氨基酸替换时，应消除抗人类CTLA-4抗体的结合。因此，本发明人已显示CTLA-4的L3D10结合位点绘制成与B7-1结合基序MYPPPY(SEQ IDNO：50)直接相邻。这与所证明的抗体在体外和在体内均阻断B7-CTLA-4相互作用的能力良好地相关。相比之下，伊匹单抗在生理条件下不阻断B7.1或B7.2与阿巴西普的结合，并且因此其还必须结合不包含MYPPPY基序的区域。然而，由于其未显示降低与sCTLA-4的结合，因此结合结构域必须不同于抗体L3D10。

内源性sCTLA-4通过细胞外IgV结构域的截短的C末端直接融合到细胞内结构域而产生，并没有居间的跨膜结构域。因此，在sCTLA-4中，MYPPPY基序的CTLA-4细胞外结构域C末端仅有12个氨基酸，而内源膜结合形式具有21个氨基酸。基于此，不受理论束缚，似乎结合多态性C末端结构域残基的抗体，诸如L3D10，更可能丧失对sCTLA-4的反应性。此外，本发明人已证明可能在此区域中对CTLA-4Fc蛋白中的这些氨基酸进行突变，使得它们不再结合抗CTLA-4抗体。

4.重组CTLA-4蛋白

CTLA-4Fc融合蛋白(阿巴西普，作为Orencia销售)是选择性共刺激调节剂，其包含与人类IgG1的Fc区融合的CTLA-4的细胞外结构域(在图1B中示出；SEQ ID NO：2)，所述细胞外结构域通过与B7.1和B7.2结合而抑制T细胞(T淋巴细胞)活化，从而阻断与CD28的相互作用。在体外，阿巴西普减少T细胞增殖并抑制细胞因子TNFα(TNFα)、干扰素-γ和白细胞介素-2的产生。活化的T淋巴细胞与类风湿性关节炎(RA)的发病机制有关，并且存在于RA患者的滑膜中。在大鼠胶原诱导的关节炎模型中，阿巴西普抑制炎症，减少抗胶原抗体产生，并减少干扰素-γ的抗原特异性产生。基于此临床前活性，阿巴西普已被开发并批准用于治疗人类的RA和幼年型特发性关节炎(JIA)。

虽然能够减少免疫反应，但包含内源性CTLA-4细胞外结构域的CTLA-4Fc融合蛋白诸如阿巴西普不能减少或减轻与抗CTLA-4免疫疗法相关的免疫相关毒性，因为所述两种分子的活性正在抵消。CTLA-4融合蛋白诸如阿巴西普不仅将通过直接结合到抗体来阻止他们与内源性细胞相关的CTLA-4分子结合而降低抗CTLA-4mAb的治疗作用，还将使自身变得无效，因为他们在与循环抗CTLA-4mAb形成免疫复合物后将从循环中清除。

鉴于阻断和不阻断抗CTLA-4抗体两者均具有抗肿瘤作用，并且证明减少irAE的抗体与降低与sCTLA-4的结合相关，本发明人设计一组可溶性CTLA-4蛋白，其具有防止被进行测试的大多数抗CTLA-4mAb结合的突变，同时保留其结合抗原呈递细胞上的B7-1和B7-2的能力，这对于自身免疫疾病和irAE的发病机制至关重要。由于其保留的B7结合活性，此类蛋白质可用于治疗自身免疫疾病，诸如RA和JIA。此外，此类蛋白质可与抗CTLA-4免疫疗法治疗组合使用以减少相关的irAE，同时保持免疫疗法的抗肿瘤活性完整。

a.CTLA-4蛋白

本文提供一种CTLA-4蛋白，其包含(a)成熟人类CTLA-4的细胞外结构域(SEQ IDNO：3)或小鼠CTLA-4的细胞外结构域(SEQ ID NO：6)，(b)在SEQ ID NO：24-40和46-49中的一个中列出的氨基酸，(c)前述的变体，或(d)前述的活性片段。CTLA-4蛋白可以是可溶的。CTLA-4蛋白还可包含N末端信号肽。CTLA-4蛋白可保留结合人类B7.1和B7.2的能力，但缺乏结合抗CTLA-4抗体的能力。在一个具体实施方案中，CTLA-4蛋白在生理条件下不与伊匹单抗或替西木单抗结合。特别地，CTLA-4蛋白可包含SEQ ID NO：34、36、38、39、40、46、47或48中列出的氨基酸序列。CTLA-4蛋白可以是分离的。

b.CTLA-4融合蛋白

CTLA-4蛋白可在其N-末端或C-末端与另一种蛋白质融合。所述另一种蛋白质可以是哺乳动物Ig蛋白质的一部分，其可以是人或小鼠。所述部分可包含Ig蛋白的Fc区。Fc区可包含Ig蛋白的铰链区以及CH2和CH3结构域。Ig蛋白可以是人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgA。Ig蛋白也可以是IgM，并且Fc部分可包含IgM的铰链区以及CH3和CH4结构域。在一个实施方案中，Fc区是人类IgG1，其包含SEQ ID NO：41中列出的氨基酸序列。CTLA-4蛋白可包含选自由SEQ ID NO：7-23和42-45组成的组的氨基酸序列，特别是选自由SEQ ID NO：17、19、21、22、23、42、43和44组成的组的氨基酸序列。

CTLA-4蛋白还可在其N-末端或C-末端与蛋白质标签融合，所述蛋白质标签可包括GST、His或FLAG。用于制备融合蛋白并纯化融合蛋白的方法是本领域熟知的。

5.抗B7抗体

本发明的另一个实施方案涉及一种结合人类B7-1和B7-2中的至少一种的抗B7抗体组合物。抗B7抗体可与内源性B7-1和B7-2中的一种或两种结合，并且可中和活性而不影响抗CTLA-4抗体的癌症免疫治疗活性。可将抗B7抗体人源化以使抗药物抗体最小化。抗B7抗体可以是单克隆抗体，并且可与B7-1和B7-2两者交叉反应。在又另一个实施方案中，双特异性抗体可包含两种抗体的抗原结合结构域，其分别结合到B7-1或B7-2

6.产生

可使用真核表达系统制备CTLA-4蛋白或抗B7抗体。表达系统可能需要在哺乳动物细胞(诸如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)中从载体表达。所述系统也可以是病毒载体，诸如可用于感染真核细胞的复制缺陷型逆转录病毒载体。CTLA-4蛋白还可由稳定的细胞系产生，所述细胞系从已整合到细胞基因组中的载体或载体的一部分表达CTLA-4蛋白。稳定细胞系可从整合的复制缺陷型逆转录病毒载体表达CTLA-4蛋白。表达系统可以是GPEx

CTLA-4蛋白质或抗B7抗体可使用例如色谱方法纯化，诸如亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水相互作用色谱法、DEAE离子交换法、凝胶过滤法和羟基磷灰石色谱法。在一些实施方案中，可将融合蛋白工程化以含有另外的含有氨基酸序列的结构域，所述氨基酸序列允许多肽被捕获到亲和基质上。例如，可使用蛋白A柱从细胞培养物上清液或细胞质提取物中分离包含免疫球蛋白结构域的Fc区的CTLA-4蛋白或抗B7抗体。另外，诸如c-myc、血凝素、多组氨酸或Flag

7.药物组合物

本发明还涉及一种药物组合物，其包含治疗有效量的一种或多种以上所述的CTLA-4蛋白和抗B7抗体，以及生理学上可接受的载体或赋形剂。优选地，本发明的组合物包含预防或治疗有效量的CTLA-4蛋白或抗B7抗体以及药学上可接受的载体

在一个具体实施方案中，术语“药学上可接受的”意指由联邦监管机构或州政府批准的或者在美国药典或其他通常认可的药典上列出，以用于动物并且更具体地为用于人类。术语“载体”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如，弗氏佐剂(完全和不完全)、赋形剂或媒介物。此类药物载体可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物和合成来源的那些油，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载体。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体载体，特别是用于可注射溶液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂乳粉、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。如果需要，组合物还可包含少量润湿剂或乳化剂或pH缓冲剂。这些组合物可采用溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、缓释制剂等的形式。

一般来说，本发明组合物的成分可以是单独或混合在一起以单位剂型(例如以干燥冻干粉末或无水浓缩物形式)提供于指示活性剂的量的密闭容器(诸如安瓿或药囊)中。当组合物待通过输注施用时，所述组合物可用含有无菌药用级水或盐水的输注瓶来分配。当组合物是通过注射施用时，可提供注射用无菌水或盐水的安瓿以使得成分可在施用之前混合。

本发明的组合物可配制成中性或盐形式。药学上可接受的盐包括但不限于，与阴离子形成的盐，诸如衍生自盐酸、磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等的盐；和与阳离子形成的盐，诸如衍生自钠、钾、铵、钙、氢氧化铁、异丙胺、三乙胺、2-乙氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等的盐。

8.治疗方法

a.自身免疫疾病

CTLA-4蛋白或抗B7抗体或其药物组合物可用于治疗炎性或自身免疫疾病。可使用B7-H4融合多肽治疗的代表性炎性或自身免疫疾病和病症包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、系统性红斑狼疮(SLE)、斑秃、痉挛性脊椎炎、抗磷脂综合征、自身免疫性阿狄森氏病、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴增生综合征(alps)、自身免疫性血小板减少性紫癜(ATP)、白塞病、大疱性类天疱疮、心肌病、腹腔口炎性皮炎、慢性疲劳综合征免疫缺陷综合征(CFIDS)、慢性炎症性脱髓鞘性多发性神经病、瘢痕性类天疱疮、冷凝集素病、冠状综合征、克罗恩病、德戈病、皮肌炎、幼年型皮肌炎、盘状狼疮、基本混合性冷球蛋白血症、纤维肌痛-纤维肌炎、格雷夫斯病、格林-巴利综合征、桥本氏甲状腺炎、特发性肺纤维化、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、Iga肾病、胰岛素依赖型糖尿病(I型)、幼年关节炎、梅尼埃病、混合性结缔组织病、多发性硬化症(MS)、重症肌无力、寻常型天疱疮、恶性贫血、结节性多动脉炎、多软骨炎、多腺体综合征、风湿性多肌痛、多发性肌炎和皮肌炎、原发性无丙种球蛋白血症、原发性胆汁性肝硬化、牛皮癣、雷诺现象、瑞特氏综合征、风湿热、结节病、硬皮病、干燥综合征、全身肌强直综合征、大动脉炎、颞动脉炎/巨细胞动脉炎、溃疡性结肠炎、葡萄膜炎、血管炎、白癜风和韦格纳肉芽肿。在一个具体实施方案中，自身免疫疾病可以是类风湿性关节炎(RA)或幼年型特发性关节炎(JIA)。可将CTLA-4蛋白或抗B7抗体或其药物组合物施用给有需要的受试者。所述受试者可以是哺乳动物，诸如人类。

CTLA-4蛋白或抗B7抗体或其药物组合物可与另一种药物(诸如缓解疾病的抗风湿药(DMARD))组合。所述药物可以是非甾体抗炎药(NSAID)，其可以是丙酸衍生物、乙酸衍生物、烯醇酸衍生物、灭酸衍生物或选择性Cox2抑制剂。药物也可以是皮质类固醇或甲氨蝶呤。药物可以是生物药物，其可以是TNF-α拮抗剂，诸如抗TNF-α抗体或结合到TNF-α的融合蛋白(Enbre1)、抗CD20 mAb、共刺激分子CD80和CD86的拮抗剂，诸如与两种分子结合的单克隆抗体或融合蛋白(CTLA-4Ig)，或者IL-1或IL-6受体的拮抗剂。CTLA-4蛋白或抗B7抗体或其药物组合物和其他药物可一起或依次施用。

b.免疫疗法

CTLA-4蛋白或抗B7抗体或其药物组合物还可用于减轻、减少或治疗癌症患者中的与抗CTLA-4免疫疗法相关的免疫相关不良事件(irAE)。CTLA-4蛋白可预防性地施用(在irAE出现之前)或治疗性地施用(在irAE出现之后)。特别地，CTLA-4蛋白或抗B7抗体或其药物组合物可与抗CTLA-4免疫疗法组合或在抗CTLA-4免疫疗法背景下施用给受试者。所述受试者可以是癌症患者。在一个实施方案中，CTLA-4蛋白或抗B7抗体或其药物组合物预防性地用于在开始抗CTLA-4治疗之前或在出现irAE的临床表现之前预防irAE。在另一个实施方案中，CTLA-4蛋白或抗B7抗体或其药物组合物治疗性地用于在开始抗CTLA-4治疗并诊断出临床症状后治疗irAE。

c.施用方法

CTLA-4蛋白或抗B7抗体或其药物组合物可通过包括但不限于肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内和皮下)、硬膜外和粘膜(例如，鼻内和口腔途径)的方法施用。在一个具体实施方案中，CTLA-4蛋白或抗B7抗体或其药物组合物通过肌内、静脉内或皮下施用。组合物可通过任何方便的途径，例如通过输注或团注、通过由上皮或粘膜层(例如口腔粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收来施用，并可与其他生物活性剂共同施用。施用可为全身性或局部的。

实施例

实施例1

嵌合L3D10抗体在引起肿瘤排斥方面具有与10D1相等的活性

在临床上，抗CTLA-4抗体伊匹单抗(mab 10D1)已显示改善癌症患者的存活率，但诱导显著的自身免疫不良反应。使用人类CTLA-4基因敲入小鼠和hu-PBL-Scid小鼠，先前已证明小鼠抗人类CTLA-4抗体减少肿瘤生长，并确定L3D10在所测试的mAb组中最有效(21)。

人类CTLA-4基因敲入小鼠(20)的可用性提供前所未有的机会来测试嵌合L3D10抗人类CTLA-4抗体与临床上使用抗-CTLA-4mAb10D1的生物活性，所述嵌合L3D10抗人类CTLA-4抗体包含亲本L3D10可变区和人类IgG1恒定结构域(Fc区)。在此人源化小鼠模型中，编码与人类CTLA-4蛋白具有100％同一性的产物的CTLA-4基因在内源性小鼠CTLA-4基因座的控制下表达。当在人类CTLA-4敲入小鼠的MC38肿瘤模型中直接比较嵌合L3D10和10D1的抗肿瘤活性时，显然两种抗体在引起肿瘤排斥方面是相当的，而肿瘤在IgG对照组中逐渐生长。图2示出来自一式两份实验的抗体治疗关于肿瘤大小的结果。

实施例2

其他免疫治疗抗体减少自身免疫不良反应

最近的临床研究揭示，抗PD-1与抗CTLA-4mAb之间的组合疗法进一步增加终末期黑素瘤患者的存活率。然而，55％的接受组合疗法的患者发展3级和4级免疫相关不良事件(irAE)。因此，开发毒性较小的抗体至关重要。已开发一种体内模型，其重演与在临床中观察到的抗CTLA-4和抗PD-1mAb的组合疗法相关的irAE。在此模型中，在围产期期间用高剂量的抗PD-1和抗CTLA-4mAb处理人类CTLA-4基因敲入小鼠(CTLA-4

为了进一步检查当与抗PD-1组合施用时的嵌合L3D10与10D1相比的相对毒性，观察了施用后42天CTLA-4

为了进一步确定L3D10相对于10D1与抗PD-1组合的毒理学，在10％福尔马林中固定至少24小时后对心脏、肺、唾液腺以及肾和肝进行组织学分析。在所研究的每种组织中，用10D1+抗PD-1处理的小鼠显示出高水平的T细胞浸润。基于炎症严重程度的毒性评分总结在图7中，其示出用10D1+抗PD-1处理的小鼠相对于用L3D10+抗PD-1处理的小鼠的高毒性评分，用L3D10+抗PD-1处理的小鼠具有仅略高于hIgG对照小鼠组的评分。

实施例3

L3D10减少对可溶性CTLA-4的结合。

L3D10和10D1显示出对板固定的CTLA-4的相似结合模式(图8)。作为L3D10相对于10D1的毒性降低，特别是与10D1相关的增加的T细胞浸润/活性的可能解释，决定研究与可溶性CTLA-4的结合。选择进行研究是因为CTLA-4多态性与多种自身免疫性疾病之间的关联与可溶性CTLA-4的缺陷产生有关(67)，并且sCTLA-4同种型的遗传沉默增加小鼠I型糖尿病的发病率(131)。此外，可溶性CTLA-4(阿巴西普和贝拉西普)是广泛用于免疫抑制的药物。根据这个想法，当观察与可溶性CTLA-4的相对结合时，观察到L3D10相对于10D1的结合的明显降低(图9)。

已证明抗CTLA-4mAb在杂合Ctla-4

体内活性证明L3D10抗体保留其抗肿瘤活性，但显示出在其他免疫治疗性抗体诸如10D1的情况下观察到的降低的自身免疫不良反应，从而指示可能增强抗肿瘤活性而不加剧自身免疫不良事件。因此，自身免疫副作用不是癌症免疫的必要代价，并且可能解耦这两种活动。L3D10的表征证明其阻断CTLA-4与B7.1和B7.2的相互作用的能力比10D1更有效。进一步的表征证明L3D10和10D1以相似的结合特征结合到固定的CTLA-4。然而，L3D10表现出对可溶性CTLA-4的结合亲和力比10D1低得多。

实施例4

人源化L3D10抗CTLA-4抗体

通过产生多个杂交序列来设计人源化L3D10抗体，所述杂交序列将亲本抗体序列的选择部分与人类框架序列融合，包括将CDR序列移植到受体框架中。使用以上实施例1中描述的人类CTLA-4敲入小鼠中的同源MC38小鼠肿瘤模型评估与10D1和嵌合L3D10抗体相比的三种人源化抗体(mAb4、mAb5和mAb6)的抗肿瘤活性。图11A示出体内实验的治疗方案；从接种后第7天开始，每3天给与小鼠总计4个剂量的抗体。如图11B所示，所有人源化抗体完全根除肿瘤并且与10D1相当。使用在杂合Ctla-4

为了测试人源化后是否可维持L3D10的优异安全性特征，将mAb4和mAb5与10D1进行比较，以确定它们与抗PD-1组合使用时的不良反应。如图12所示，当与抗PD-1组合使用时，mAb4和mAb5两者均比10D1毒性更低。

实施例5

人源化抗CTLA-4抗体的结合特征

为了确认人源化抗体保留其CTLA-4结合特征，观察了与固定化和板结合的CTLA-4的结合。人源化不影响与固定化CTLA-4的结合，并且所有3种人源化抗体显示出与亲本嵌合L3D10抗体的相似结合(图13)。然而，人源化进一步减少L3D10与可溶性CTLA-4的结合(图14)。

已证明嵌合L3D10具有与10D1相比1000倍更高的B7阻断活性。这提出了一个有趣的可能性，即阻断B7-CTLA-4相互作用可解释其缺乏irAE。然而，mAb4和mAb5均不在体外和在体内阻断B7-CTL-A4相互作用。mAb4和mAb5显示减少的irAE这一事实进一步支持了阻断B7-CTLA-4相互作用不是L3D10安全性改善的原因的观点。

鉴于提出的CTLA-4在预防自身免疫疾病中的作用，提出减少与可溶性CTLA-4的结合作为改善安全性特征的基本机制。为了测试这一假设，使用在围产期期间接受抗PD-1+抗CTLA-4mAb的雌性小鼠的生长增重作为irAE的基本指标。在接受10D1和抗PD-1两者的小鼠中观察到体重增加的严重降低，而接受mAb5+抗PD-1的那些具有最低的irAE，接着是接受mAb4的小鼠，然后是接受L3D10的小鼠(数据未显示)。与sCTLA-4结合降低的严格逆相关与中心假设一致。

实施例6

L3D10和人源化抗体的表位作图

为了绘制L3D10抗体和人源化变体mAb4和mAb5的CTLA-4结合表位，利用了小鼠和人CTLA-4蛋白与B7-1但不与抗CTLA-4抗体交叉反应的事实。抗人类CTLA-4抗体不与鼠Ctla-4交叉反应的事实可能反映细胞外结构域中人类与小鼠CTLA-4之间氨基酸序列的差异。图15示出人类、猕猴和小鼠CTLA-4细胞外结构域的比对，并且突出人类与猕猴之间的序列保守性，同时示出鼠与灵长类动物序列之间的许多差异。由于MYPPPY结合基序(SEQ IDNO：50)的保守性，小鼠和人类CTLA-4蛋白与B7-1交叉反应(72)。

因此，设计11种人类CTLA-4Fc蛋白的突变体，命名为M1-M11(SEQ ID NO：7-17)，其中来自人类CTLA-4蛋白的氨基酸簇被来自鼠Ctla-4蛋白的氨基酸替换。并入到11种突变体中的每一种中的氨基酸在图15中示出，并且WT和突变体CTLA-4Fc蛋白的氨基酸序列在图16A和图16B中示出。由于本研究中使用的抗CTLA-4抗体不与鼠Ctla-4结合，因此当抗体结合表位的关键残基被鼠氨基酸替换时，应消除抗人类CTLA-4抗体的结合。

基于野生型人类CTLA-4Fc序列构建编码11种CTLA-4Fc突变体蛋白的DNA载体，并且通过在HEK293中以0.01mL规模瞬时转染，接着通过一步蛋白A色谱法纯化来产生蛋白质，并且产量在表1中提供。许多突变似乎影响蛋白质表达，如其相对于WT人类CTLA-4Fc蛋白的产量所指示。

表1在HEK293细胞中瞬时产生的WT和突变体CTLA-4Fc蛋白。

然后通过ELISA确定嵌合L3D10和人源化抗体mAb4和mAb5结合固定化CTLA-4Fc突变体构建体的能力，其中用CTLA-4突变体蛋白以1μg/mL包被板，并且添加生物素化抗CTLA-4抗体或B7-1Ig对照蛋白，并且使用HRP缀合的链霉抗生物素蛋白测量结合。结合测定的结果在表2-5中示出。如所预期的，所有4种结合蛋白均表现出对WT CTLA-4Fc蛋白的良好剂量依赖性结合。然而，引入到M9和M10蛋白中的突变似乎改变整体结构，并且这些突变体未能结合B7-1Fc。在M2和M4中引入的突变也部分改变CTLA-4构象，如通过相对于WT蛋白的降低的结合所指示的。与此观点一致，所有这4种突变体(M2、M4、M9和M10)以低得多的产量表达(表1)。相比之下，使用与WT CTLA-4Fc蛋白的结合和B7-1Fc蛋白的结合作为参考，M11清楚地表现为表达良好的蛋白质，有效结合B7-1Fc但不能结合两种人源化抗CTLA-4抗体。其与原始L3D10的结合也降低大约100倍(表3)。如所预期的，影响整体构象的突变也影响与抗CTLA-4抗体的结合。

/>

/>

/>

/>

由于L3D10保留与M11的显著结合，因此测试了结合是否是特异性的。用人类CTLA-4-Fc(hCTLA-4Fc)、小鼠CTLA-4-Fc(mCTLA-4-Fc)、对照IgG1-Fc或所有突变体hCTLA-4-Fc包被板并测量它们与B7-1Fc连同L3D10、mAb4和mAb5的结合。大部分数据在表6中呈现。如图17所示，生物素化B7-1同样良好地结合hCTLA-4、mCTLA-4和M11。通过缺乏与IgG1-Fc的结合证明测定的特异性。有趣的是，虽然L3D10与M11的结合比与IgG1-Fc和mCTLA-4-Fc的结合更强，但是与IgG1-Fc的显著结合表明与M11结合的嵌合抗体可能是非特异性的。相比之下，人源化抗体都不与M11、mCTLA-4和IgG1-Fc对照结合。这些数据表明，M11中引入的突变选择性地消除与CTLA-4结合的L3D10、mAb4和mAb5。

使用已知的复合结构133，在3-D结构中绘制CTLA-4表位。如图18所示，这些mAb识别的表位位于B7-1覆盖的区域内。因此，与CTLA-4结合的L3D10、mAb4和mAb5将与B7-1相互排斥。mAb4和mAb5的不良阻断是由于较低的亲合力而不是独特的结合结构域。

使用多种人类CTLA-4Fc蛋白的突变体，其中来自人类CTLA-4蛋白的氨基酸簇被来自鼠Ctla-4蛋白的氨基酸替换，清楚地证明当替换紧跟CTLA-4的已知B7-1结合结构域MYPPPY的4个氨基酸时，抗体的剂量依赖性结合在很大程度上被消除。结合表位绘制成直接与B7-1结合结构域相邻的事实与所证明的L3D10抗体在体外和在体内均阻断B7-CTLA-4相互作用的能力充分相关。

实施例7

生成融合蛋白，其显示与一种或多种癌免疫治疗性抗CTLA-4mAb的结合降低

已经生成一组17种具有各种突变的CTLA-4-Fc融合蛋白，命名为M1-M17(SEQ IDNO：7-23)，其包括实施例10中鉴定的11种蛋白质(图16)加上6种另外的突变体(图19)。对M17进行进一步的突变。新突变体称为M17-1、M17-2、M17-3和M17-4(SEQ ID NO：42-45)。生成这些突变，预期他们将消除与广谱抗CTLA-4抗体的结合，但保留与CTLA-4配体CD80(B7-1)和CD86(B7-2)的结合。作为第一步，在板上包被给定浓度的融合蛋白，并且添加生物素化B7-1Fc。如图20A和图20B所示，除了2种融合蛋白(M9和M10)之外的所有融合蛋白都保留与B7-1的结合，但在M2、M4和M7中发现B7-1结合的显著降低。由于这些蛋白质在功能上较不活跃，因此这些突变体不太可能是体内预防自身免疫不良反应的最佳选择。另外的数据证明M15、M17、M17-1和M17-2保留与CD80和CD86两者的强结合(图21)。

接下来，评估了这些突变蛋白(M1-M17和M17-1至M17-4)是否已丧失与抗CTLA4mAb的结合，这些抗CTLA4 mAb被批准临床使用或正在开发用于临床疗法。总共测试了4种mAb。对于mAb1(伊匹单抗)，融合蛋白M11、M13、M15、M17、M17-1、M17-2和M17-3已丧失结合，并且因此可用于预防由此mAb诱导的自身免疫疾病(图22A)。对于由mAb2(替西木单抗)诱导的自身免疫疾病，M15、M17、M17-2和M17-3将是有效的(图22B)。对于mAb4和mAb5，M11、M12、M14和M16可能是最有效的，但M3和M17也可起作用(图23、图24和图25)。

因此，如表7中总结的，CTLA4-Fc融合蛋白M17具有用于预防由抗CTLA4抗体诱导的自身免疫疾病的广谱活性。M17-3显示出与抗CTLA4抗体的低结合但与B7-1和B7-2的低结合。然而，M17-2显示出与B7-1和B7-2的更好结合，但是对于广泛范围的抗人类CTLA-4mAb显示出可接受的低交叉反应性。

表7

鉴定CTLA4-Fc融合蛋白，其保留与B7-1的结合，但不与抗CTLA4 mAb的结合。相对结合由“+”或“-”表示，其中“++++”是最强的结合并且“-”表示没有结合。ND＝未确定。

/>

实施例8

阻断B7-1和B7-2不阻止伊匹单抗的免疫治疗作用

用结合到B7-1/B7-2的CTLA-4-Fc突变体治疗抗CTLA-4免疫治疗相关不良反应的关键要求是阻断B7-1和B7-2不影响免疫治疗作用。由于具有Cd80(编码B7-1)和Cd86(编码B7-2)的靶向突变的小鼠不具有Treg(17)并因此表达非常少的Ctla4，因此通过使用饱和剂量的抗B7-1(1G10)和抗B7-2(GL-1)mAb测试此预测，所述抗B7-1和抗B7-2 mAb分别阻断人类CTLA-4与mB7-1和mB7-2的结合(图26A)。如图26B所示，用伊匹单抗联合对照Ig或与抗mB7-1和抗mB7-2 mAb组合治疗携带MC38肿瘤的小鼠。使用的抗mB7 mAb完全掩盖PBL中的所有B7-1和B7-2，因为它们与新抗mB7 mAb的结合降低至在具有Cd80和Cd86的靶向突变的小鼠中观察到的结果(dKO)(图26C，图26D)。使用在肿瘤攻击后第22天收集的血清评估抗B7-1和抗B7-2 mAb对B7的功能性阻断，以评估抗人类IgG抗体反应，并通过对伊匹单抗的抗体反应被消除的事实来确认(图26E)。重要的是，mB7的饱和阻断不影响伊匹单抗诱导的肿瘤排斥，因为抗mB7和对照Ig治疗的小鼠对伊匹单抗具有同等的反应性(图26F)。这些数据指示抗B7-1和抗B7-2以及不结合抗CTLA-4抗体的B7结合的CTLA-4融合蛋白可用于治疗与抗CTLA-4免疫疗法相关的irAE，同时保持保护性免疫治疗活性完整。

实施例9

使用CTLA-4融合蛋白治疗与抗CTLA-4和抗PD-1组合疗法相关的自身免疫不良反应。

与抗CTLA-4和抗PD-1的组合疗法代表最有效的癌症免疫疗法。然而，由于超过50％的接受免疫疗法的患者发展irAE，迫切需要开发治疗或预防irAE的治疗方法。如实施例8中所证明的，伊匹单抗(mAb1)的免疫治疗作用不受B7-1和B7-2的阻断的影响。这些发现促使我们测试突变体CTLA-4Fc是否可用于治疗与伊匹单抗+抗PD-1组合疗法相关的irAE。由于伊匹单抗不与CTLA-4-Fc融合蛋白M11或M15(贝拉西普)结合，因此测试了贝拉西普或M11或M15的共同施用是否可改善irAE，使用延迟生长作为irAE的读出(参见实施例2)。如图27所示，低剂量的M11(100μg/注射)或M15(200μg/注射)预防irAE。除了M11和M15之外，还可使用具有相似性质的其他蛋白质，包括M13、M16和M17。

实施例10

鉴定不干扰抗CTLA4免疫治疗活性的融合蛋白

为了确定CTLA-4-Fc融合蛋白是否干扰抗CTLA4免疫治疗作用，在第7、10、13和17天用对照IgG Fc(200μg/注射)或伊匹单抗(100μg/注射)组合对照IgGFc(100μg/注射)或CTLA4融合蛋白阿巴西普、M15或M17(100μg/注射)对携带MC38肿瘤的小鼠进行注射。肿瘤生长速率在图28A中示出，而小鼠存活至早期移除终点在图28B中示出。如所预期的，阿巴西普消除伊匹单抗的免疫治疗作用。相比之下，M15和M17不干扰伊匹单抗的治疗作用。

实施例11

用人类造血系统重建的NSG小鼠中T细胞活化的调节及其相关的不良反应

为了确定CTLA-4融合蛋白对体内人类T细胞活化和相关irAE的影响，用人类造血干细胞重建3周大的NSG小鼠并监测T细胞活化。如图29至图32所示，不同的CTLA-4mAb似乎对T细胞表型和伊匹单抗的不良反应具有不同的作用。因此，如图29A所示，用伊匹单抗治疗可防止NSG小鼠体重增加，并且这可通过共同施用M15或M17-2来预防。有趣的是，当与伊匹单抗联合使用时，M15诱导丙氨酸转氨酶升高(图29B)。这些数据表明，当与伊匹单抗联合使用时，M15可能诱发肝损伤。重要的是，当M17-2与M15联合使用时，没有观察到这种作用。

为了理解M15与M17之间差异的免疫学基础，在第31天处死NSG小鼠并分析T细胞子集的组成。如图30所示，M17诱导更多的中枢记忆T细胞，同时减少效应T细胞。效应T细胞的减少可解释减少的不良反应，因为这是迁移到器官中而导致免疫破坏的子集。此外，由于NKT细胞是肝炎的主要介质，所以基于CD56和CD3两者的表达比较M15和M17-2对NKT细胞的影响。如图31所示，M17-2减少NKT的数量，而M15将其增强。

调节性T细胞抑制自身免疫疾病和癌症免疫性。因此，希望减少Treg以增强癌症免疫性。然而，如果减少太严重，可能诱导自身免疫疾病。与B7-CD28相互作用在小鼠中生成和维持Treg中的关键作用一致，M15和M17-2两者均显著降低了Treg的％(图32A和图32B)。然而，M15在减少Treg方面远远更有效(图32A和图32B)。此外，来自M15处理的小鼠的Treg具有显著更低的CTLA-4(图32C和图32D)。鉴于CTLA-4在体内Treg功能中的重要作用，来自M15处理的小鼠的Treg可能在功能上受损。因此，Treg的严重减少与CTLA-4蛋白水平的选择性降低相结合表明当与伊匹单抗联合使用时M15可诱导自身免疫破坏的有趣可能性。

在本说明书中提到的所有出版物和专利申请以引用的方式并入本文，其程度如同具体地和单独地指出每个单独的出版物或专利申请以引用的方式整体并入。尽管本发明结合其具体实施方案进行描述，但是应了解能够进行另外的修改，并且此申请意图覆盖大体上根据本发明的原理而对本发明进行的任何变动、使用或适应性改变，并且包括属于本发明所属领域的已知或习用实施手段并且可适用于本文所列出的基本特征的此类偏离本公开的内容。

本发明具体涉及：

1.一种CTLA-4蛋白，其包含CTLA-4的突变体细胞外结构域，其中与CTLA-4的野生型细胞外结构域相比，所述CTLA-4蛋白表现出与抗CTLA-4抗体的降低的结合，其中所述抗CTLA-4抗体具有抗癌免疫治疗活性。

2.如项1所述的CTLA-4蛋白，其中所述抗CTLA-4抗体是伊匹单抗。

3.如项1或2所述的CTLA-4蛋白，其中所述CTLA-4蛋白具有结合B7-1和B7-2中的至少一种的能力。

4.如项3所述的CTLA-4蛋白，其中所述CTLA-4蛋白不阻断所述抗CTLA-4抗体的抗癌免疫治疗作用。

5.如以上项中任一项所述的CTLA-4蛋白，其中所述突变体细胞外结构域的序列包括选自由SEQ ID NO：34、36、39、40和46-48组成的组的氨基酸序列。

6.如以上项中任一项所述的CTLA-4蛋白，其中所述CTLA-4的突变体细胞外结构域与人类免疫球蛋白蛋白的Fc区融合。

7.如项6所述的CTLA-4蛋白，其中所述CTLA-4蛋白的序列包括选自由SEQ ID NO：17、19、22、23和42-44组成的组的氨基酸序列。

8.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如以上项中任一项所述的CTLA-4蛋白和生理学上可接受的载体或赋形剂。

9.一种治疗受试者中的与抗CTLA-4免疫疗法相关的免疫相关不良事件的方法，其包括向有需要的受试者施用阻断B7-1和B7-2功能而不影响抗CTLA-4抗体的癌症免疫治疗活性的分子。

10.如项9所述的方法，其中所述受试者接受用抗CTLA-4抗体进行的治疗。

11.如项10所述的方法，其中所述受试者患有癌症。

12.如项9-11中任一项所述的方法，其中所述分子是包含CTLA-4的突变体细胞外结构域的CTLA-4融合蛋白，其具有结合B7-1和B7-2中的至少一种的能力并表现出与CTLA-4的野生型细胞外结构域相比，与具有抗癌免疫治疗活性的抗CTLA-4单克隆抗体的降低的结合。

13.如项12所述的方法，其中所述抗CTLA-4抗体是伊匹单抗。

14.如项12所述的方法，其中所述融合蛋白的序列包括在SEQ ID NO：17中列出的氨基酸序列。

15.如项12所述的方法，其中所述融合蛋白的序列包括在SEQ ID NO：23中列出的氨基酸序列。

16.如项12所述的方法，其中所述融合蛋白是贝拉西普。

17.如项12所述的方法，其中所述CTLA-4融合蛋白是如项6所述的CTLA-4蛋白。

18.如项9-11中任一项所述的方法，其中所述分子是能够在功能上阻断B7-1和B7-2中的至少一种与CD28和CTLA-4中的至少一种的结合的抗体。

19.如项18所述的方法，其中所述抗体是抗B7-1。

20.如据项18所述的方法，其中所述抗体是抗B7-2。

21.如项18所述的方法，其中所述抗体能够与B7-1和B7-2两者结合。

22.如项21所述的方法，其中所述抗体包含与B7-1和B7-2两者反应的结合位点。

23.如项21所述的方法，其中所述抗体包含两种不同的抗原结合片段(Fv)，其中一种抗原结合片段与B7-1结合，并且一种抗原结合片段与B7-2结合。

24.如项23所述的方法，其中所述抗体结合片段仅含有IgH的可变区。

25.一种使受试者中的与癌症免疫疗法相关的自身免疫性不良事件最小化的方法，其包括将有效量的如项6所述的CTLA-4蛋白施用给有需要的受试者。

引用的参考文献

10.Leach DR，Krummel MF，Allison JP.Enhancement of antitumor immunityby CTLA-4blockade[see commentsJ.Science.1996；271(5256)：1734-6.

108 Guinan，E.C.et al.Transplatation of anergic histoincompatible bonemarrow allografts.N.Engl.J.Med.340，1704-1714，doi：10.1056/NEJM199906033402202(1999).

128 Magistrelli.G.et al.A soluble form of CTLA-4generated byalternative splicing is expressed by nonstimulated human Tcells.Eur.J.Immunol.29，3596-3602，doi：10.1002/(SICI)1521-4141(199911)29：11<；3596：：AID-IMMU3596>；3.0.CO；2-Y(1999).

64 Ueda，H.et al.Association of the T-cell regulatory gene CTLA-4 withgusceptibility to autoimmune disease.Nature 423，506-511(2003).

129 Kremer，J.M.et al.Treatment of rheumatoid arthritis by selectiveinhibition of T-cell activation with fusion protein CTLA-4Ig.N.Engl.J.Med.349，1907-1915，doi：10.1056/NEJMoa035075(2003).

130 Abrams，J.R.et al.CTLA-4Ig-mediated blockade of T-cellcostimulation in patients with psorigsis vulgaris.J.Clin.Invest.103，1243-1252，doi：10.1172/JCI5857(1999).

131 Gerold，K.D.et al.The soluble CTLA-4 splice variant protects fromtype 1 diabetes and potentiates regulatory T-cell function.Diabetes 60，1 955-1963，doi：10.2337/db11-0130(2011).

132 Peach，R.J.et al.Complementarity determining region 1(CDR1)-andCDR3-analogous regions in CTLA-4and CD28 determine the binding to B7-1.J.Exp.Med.180，2049-2058(1994).

1.Townsend ARM，Tothbard J，Gotch FM，Bahadur G，Wraith D，McMichaelAJ.The epitope of influenza nucleoprotein recognized by cytotoxic lymphocytescan be defined with short synthetic peptides.Cell.1986；44：959-68.

2.Zinkernagel RM，Doherty PC.Restriction of in vitro T cell-mediatedcytotoxicity in lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic orsemiallogeneic system.Nature.1974；248：701-2.

3.Lafferty KJ，Prowse SJ，Simeonovic CJ，Warren HS.Immunobiology oftissue transplantation：a return to the passenger leukocyte concept.Annu RevImmunol.1983；1：143-73.

4.Liu Y，Linsley PS.Costimulation of T-cell growth.Curr OpinImmunol.1992；4(3)：265-70.

5.Schwartz RH.Costimulation of T lymphocytes：the role or CD28，CTLA-4，and B7/BB1 in interleukin-2 production and immunotherapy.Cell.1992；71(7)：1065-8.

6.Freeman GJ，Freedman AS，Segil JM，Lee G，Whitman JF，Nadler LM.B7，a newmember of the Ig superfamily with unique expression on activated andneoplastic B cells.J Immunol.1989；143(8)：2714-22.

7.Freeman GJ，Gribben JG，Boussiotis VA，Ng JW，Restivo VA，Jr.，LombardLA，et al.Cloning of B7-2：a CTLA-4counter-receptor that costimulates human Tcell proliferation[see comments].Science.1993；262(5135)：909-11.

8.Hathcock KS，Laszlo G，Dickler HB，Bradshaw J，Linsley P，HodesRJ.Identification of an altemative CTLA-4ligand costimulatory for T cellactivation[see comments].Scienee.1993；262(5135)：905-7.

9.Wu Y，Guo Y，Liu Y.A major costimulatory molecule on antigen-presenting cells，CTLA-4ligand A，is distinct from B7.J Exp Med.1993；178(5)：1789-93.

10.Leach DR，Krumimel MF，Allison JP.Enhancement of antitumor immunityby CTLA-4blockade[see comments].Science.1996；271(5256)：1734-6.

11.Linsley PS，Brady W，Urnes M，Grosmaire LS，Damle NK，LedbetterJA.CTLA-4 is a second receptor for the B cell activation antigen B7.J ExpMed.1991；174(3)：561-9.

12.Linsley PS，Clark EA，Ledbelter JA.T-cell antigen CD28 mediatesadhesion with B cells by interacting with activation antigen B7/BB-1.ProcNatl Acad Sci USA.1990；87(13)：5031-5.

21.May KF，Roychowdhury S，Bhatt D，Kocak E，Bai XF，Liu JQ.et al.Anti-human CTLA-4monoclonal antibody promotes T cell expansion and irmmunity in ahu-PBL-SCID model：a new method for preclinical screening of costimulatorymonoclonal antibodies.Blood.2005；105：1114-20.PubMed PMID：15486062.

20.Lute KD.May KF，Lu P，Zhang H，Kocak E，Mosinger B，ct al. Human CTLA-4-knock-in mice unravel the quantitative link between tumor immunity andautoimmunity induced by anti-CTLA-4antibodies.Blood.2005.PubMed PMID：16037385.

49.Keler，T.et al.Activity and safety of CTLA-4 blockade combined withvaccines in cynomolgus macaques.J.Immunol.171，6251-6259(2003).

50.Wing，K.et al.CTLA-4 control over Foxp3+regulatory Tcellfunction.Science 322，271-275，doi：10.1126/science.1160062(2008).

66.Quteshi，O.S.et al.Trans-endocytosis of CD80 and CD86：a molecularbasis for the cell-extrinsic function of CTLA-4.Science 332，600-603，doi：10.1126/science.1202947(2011).

30.Walunas，T.L，et al.，CTLA-4can function as a negative regulator of Tcell activation.Immunity，1994.1(5)：p.405-13.

31.Krummel，M.F.and J.P.Allison，CD28 and CTLA-4 have opposing effectson the response of T cells to stimulation.J Exp Med，1995.182(2)：p.459-65.

52.Simpson，T.R.et al.Fc-dependent depletion of tumor-infiltratingregulatory Tcells co-defines the efficacy of anti-CTLA-4therapy againstmelanoma.J.Exp.Med.210，1695-1710，doi：10.1084/jem.20130579(2013).

55.Korman，A.J.，Peggs，K.S.&Allison，J.P.Checkpoint blockade in cancerimmunotherapy.Adv.Immunol.90，297-339，doi：10.1016/S0065-2776(06)90008-X(2006).

56.Ribas，A.et al.Tremelimumab(CP-675，206)，a cytotoxic T lymphocyteassociated antigen 4 blocking monoclonal antibody in clinical development forpatients with cancer.Oncologist 12，873-883，doi：10.1634/theoncologist.12-7-873(2007).

57.Ribas，A.et al.Phase III randomized clinical trial comparingtremelimumab with standard-of-care chemotherapy in patients with advancedmelanoma.J.Clin.Oncol.31，616-622，doi：10.1200/JCO.2012.44.6112(2013).

58.Lee，K.M.et al.Molecular basis of T cell inactivation by CTLA-4[InProcess Citation].Science 282，2263-2266(1998).

59.Marengere，L.E.et al.Regulation of T cell receptor signaling bytyrosine phosphatase SYP association with CTLA-4[published errata appear inSciencce 1996 Dec 6；274(5293)1597and 1997 Apr4；276(5309)：21].Science 272，1170-1173(1996).

60.Liu，Y.Is CTLA-4a negative regulator for T-cell activation？Immunol.Today18，569-572(1997).

61.Tivol，E.A.et al.Loss of CTLA-4 leads to massivelymphoproliferation and fatal mnltiorgan tissue destruction，revealing acritical negative regulatory role of CTLA-4.Immunity 3，541-547(1995).

62.Waterhouse，P.et al.Lymphoproliferative disorders with earlylethality in mice deficient in CTLA-4[see comments].Science 270，985-988(1995).

63.Bachmann，M.F.，Kohler，G.，Ecabert，B.，Mak，T.W.&Kopf，M.Cutting edge：lymphoproliferative disease in the absence of CTLA-4 is not T cellautonomous.J.Immunol.163，1128-1131(1999).

64.Bachmann，M.F.et al.Normal pathogen-specific immune responsesmounted by CTLA-4-deficient T cells：a paradigm reconsidered.Eur.J.Immunol.31，450-458(2001).

65.Nguyen，T.V.，Ke，Y.，Zhang，E.E.&Feng，G.S.Conditional deletion of Shp2tyrosine phosphatase in thymocytes suppresses both pre-TCR and TCRsignals.J.Immunol.177，5990-5996(2006).

72Peach RJ，Bajorath J，Brady W，Leytze G，Greene J，Naemura J，etal.Complementarity determining region 1(CDR1)-and CDR3-analogous regions inCTLA-4 and CD28 determine the binding to B7-1.J Exp Med.1994；180(6)：2049-58.

17.Proietto AI1，Lahoud MH，Wu L.Distinct functional capacities ofmouse thymic and splenic dendritic cell populations.Immunol CellBiol.2008Nov-Dec；86(8)：700-8.doi：10.1038/icb.2008.63.Epub 2008Sep 9.