一种厚朴多酚提取物及其提取方法与应用

技术领域

本发明涉及保健产品技术领域，尤其涉及一种厚朴多酚提取物及其提取方法与应用。

背景技术

随着生活水平的提高和人们饮食习惯的改变，肥胖日益成为影响全球大量人口健康的重要问题。目前，针对肥胖的主要预防及治疗方式包括手术、药物、运动以及改善饮食等方面。一系列减肥药物包括芬特明、芬弗拉明等因其会引发心血管疾病、甲亢等副作用而被禁用，而胰脂肪酶抑制剂类药物——奥利司他已经被用作减肥药广泛应用于临床，但是长时间服用会腹泻、胀气、头痛等不良反应。因此，研究寻找天然的新型胰脂肪酶抑制剂是降低脂肪、治疗肥胖的热点之一。

厚朴为木兰科木兰属植物厚朴或凹叶厚朴的干燥干皮、根皮及枝皮，是传统中药材，多为繁殖栽培，广泛分布于南北多个省份。然而厚朴的提取物主要用于抗氧化、抗炎、抑菌、治疗心血管疾病等方面，还尚未对厚朴中更为丰富的组分进行功能研究。

因此，有必要探究厚朴提取物在降脂方面的应用。

发明内容

有鉴于此，本申请提供一种厚朴多酚提取物及其提取方法与应用，可抑制胰脂肪酶活性，体外体内降脂效果好。

为达到上述技术目的，本申请采用以下技术方案：

第一方面，本申请提供一种厚朴多酚提取物的提取方法，包括以下步骤：

S1.获取厚朴粉末；

S2.向厚朴粉末中加入乙醇溶液，进行超声浸提、浓缩，得到浓缩浸膏；

S3.在浓缩浸膏中加入萃取剂，进行萃取、浓缩、冷冻干燥，即得厚朴多酚提取物。

优选的，萃取剂为乙酸乙酯和/或正丁醇。

优选的，步骤S2中，乙醇的浓度为50-70％，超声浸提的料液比为1:10-30。

优选的，超声浸提的温度为40-55℃，超声浸提的频率为300-450W，超声浸提的时间为2-4h。

优选的，浓缩浸膏与萃取剂的料液比为1:10-20。

第二方面，本申请提供一种厚朴多酚提取物。

第三方面，本申请提供一种包含厚朴多酚提取物的胰脂肪酶活性抑制剂。

第四方面，本申请提供一种厚朴多酚提取物作为活性成分在制备降脂药物和/或降脂保健品中的应用。

第五方面，本申请提供一种包含厚朴多酚提取物的降脂药物和/或降脂保健品。

第六方面，本申请提供一种厚朴多酚提取物在抑制胰脂肪酶中的应用。

本申请的有益效果如下：本发明采用乙醇超声浸提并结合乙酸乙酯、正丁醇萃取制备的厚朴多酚提取物，该厚朴多酚提取物总酚含量高，种类丰富，包括厚朴酚、没食子酸、丹皮酚、表儿茶素、儿茶素、芹菜素、肉桂酸、芒柄花素；获得的厚朴多酚提取物具有抑制胰脂肪酶的活性，与奥利司他相比，其抑制胰脂肪酶活性相当，并且能显著降低秀丽线虫体内脂肪含量，该提取物具有开发成降脂功效的保健食品或药品的前景。

附图说明

图1为不同物质抑制胰脂肪酶活性结果对比。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本申请提供一种厚朴多酚提取物的提取方法，包括以下步骤：

S1.获取厚朴粉末；

S2.向厚朴粉末中加入乙醇溶液，进行超声浸提、浓缩，得到浓缩浸膏；

S3.在浓缩浸膏中加入萃取剂，进行萃取、浓缩、冷冻干燥，即得厚朴多酚提取物。

萃取剂为乙酸乙酯和/或正丁醇；更为优选的，萃取剂为乙酸乙酯。

步骤S2中，乙醇的浓度为50-70％，超声浸提的料液比为1:10-30；更为优选的，乙醇的浓度为50％，超声浸提的料液比为1:30，采用低浓度高料液比进行提取，可提高多酚的提取率。

超声浸提的温度为40-55℃，超声浸提的频率为300-450W，超声浸提的时间为2-4h。

厚朴粉末与萃取剂的料液比为1:10-20；优选的，浓缩浸膏与萃取剂的料液比为1:10，在此条件下，萃取效率更高。

本申请提供一种厚朴多酚提取物，总酚含量高，种类丰富，包括厚朴酚、没食子酸、丹皮酚、表儿茶素、儿茶素、芹菜素、肉桂酸、芒柄花素。

本申请提供一种包含厚朴多酚提取物的胰脂肪酶活性抑制剂，胰脂肪酶通过胰胆管系统分泌到十二指肠，与十二指肠内的消化液一起工作，在人体中负责总量50％-70％膳食脂肪的水解，本申请的厚朴多酚提取物通过抑制胰脂肪酶活性而起到降脂、预防肥胖的作用。

本申请提供一种厚朴多酚提取物作为活性成分在制备降脂药物和/或降脂保健品中的应用，该降脂药物/保健品用于降低甘油三酯的含量。

本申请提供一种包含厚朴多酚提取物的降脂药物和/或降脂保健品。

本申请提供一种厚朴多酚提取物在抑制胰脂肪酶中的应用。

以下通过具体实施例对本方案进行进一步说明。

实施例1

一种厚朴多酚提取物的提取方法，包括以下步骤：

S1.将厚朴原料在60℃烘箱干燥24h，粉碎后过60目筛得到厚朴粉末；

S2.称取500g厚朴粉末，按照料液比1：10g/mL加入50％乙醇溶液超声浸提，浸提温度为40℃，超声频率优选为300W，超声时间为2h，将得到的提取液合并、浓缩，得到浓缩浸膏；

S3.在浓缩浸膏加入分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，浓缩浸膏与乙酸乙酯料液比为1:10，将萃取液上清合并，减压旋蒸，浓缩，回收溶剂后冷冻干燥，即得厚朴多酚提取物。

实施例2

一种厚朴多酚提取物的提取方法，包括以下步骤：

S1.将厚朴原料在60℃烘箱干燥24h，粉碎后过60目筛得到厚朴粉末；

S2.称取500g厚朴粉末，按照料液比1：20g/mL加入50％乙醇溶液超声浸提，浸提温度为45℃，超声频率优选为350W，超声时间为2h，将得到的提取液合并、浓缩，得到浓缩浸膏；

S3.在浓缩浸膏加入分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，浓缩浸膏与乙酸乙酯料液比为1:20，将萃取液上清合并，减压旋蒸，浓缩，回收溶剂后冷冻干燥，即得厚朴多酚提取物。

实施例3

一种厚朴多酚提取物的提取方法，包括以下步骤：

S1.将厚朴原料在60℃烘箱干燥24h，粉碎后过60目筛得到厚朴粉末；

S2.称取500g厚朴粉末，按照料液比1：30g/mL加入50％乙醇溶液超声浸提，浸提温度为45℃，超声频率优选为400W，超声时间为4h，将得到的提取液合并、浓缩，得到浓缩浸膏；

S3.在浓缩浸膏加入分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，浓缩浸膏与乙酸乙酯料液比为1:10，将萃取液上清合并，减压旋蒸，浓缩，回收溶剂后冷冻干燥，即得厚朴多酚提取物。

实施例4

一种厚朴多酚提取物的提取方法，包括以下步骤：

S1.将厚朴原料在60℃烘箱干燥24h，粉碎后过60目筛得到厚朴粉末；

S2.称取500g厚朴粉末，按照料液比1：10g/mL加入60％乙醇溶液超声浸提，浸提温度为45℃，超声频率优选为400W，超声时间为2h，将得到的提取液合并、浓缩，得到浓缩浸膏；

S3.在浓缩浸膏加入分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，浓缩浸膏与正丁醇料液比为1:10，将萃取液上清合并，减压旋蒸，浓缩，回收溶剂后冷冻干燥，即得厚朴多酚提取物。

实施例5

一种厚朴多酚提取物的提取方法，包括以下步骤：

S1.将厚朴原料在60℃烘箱干燥24h，粉碎后过60目筛得到厚朴粉末；

S2.称取500g厚朴粉末，按照料液比1：10g/mL加入50％乙醇溶液超声浸提，浸提温度为40℃，超声频率优选为300W，超声时间为2h，将得到的提取液合并、浓缩，得到浓缩浸膏；

S3.在浓缩浸膏加入分液漏斗中，加入乙酸乙酯萃取，浓缩浸膏与正丁醇料液比为1:20，将萃取液上清合并，减压旋蒸，浓缩，回收溶剂后冷冻干燥，即得厚朴多酚提取物。

实施例6

一种厚朴多酚提取物的提取方法，其他内容与实施例3相同，所不同的是，步骤S2中乙醇的浓度为70％。

实施例7

一种厚朴多酚提取物的提取方法，其他内容与实施例3相同，所不同的是，浓缩浸膏与乙酸乙酯料液比为1:20。

实施例8

一种厚朴多酚提取物的提取方法，其他内容与实施例3相同，所不同的是，将乙酸乙酯替换为正丁醇。

对比例1

一种厚朴多酚提取物的提取方法，其他内容与实施例3相同，所不同的是，萃取剂为乙酸甲酯。

对比例2

一种厚朴多酚提取物的提取方法，其他内容与实施例3相同，所不同的是，将乙醇溶液替换为水。

评价测试

测试实施例1-7及对比例1-2中多酚的含量：

步骤1：标准曲线的绘制：以没食子酸(gallic acid)作为标准品，溶于50％甲醇配制不同浓度的标准品溶液，取500μL标准品溶液与250μL50％福林酚试剂混合后，反应5min，再加入500μL5％碳酸钠溶液，避光反应1h，于765nm处测定吸光度，以没食子酸的浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

步骤2：厚朴多酚提取物中多酚含量的测定：取500μL样品与250μL50％福林酚试剂混合后，反应5min，再加入500μL5％碳酸钠溶液，避光反应1h，于765nm处测定吸光度，根据标准曲线计算样品中总酚含量，总酚含量以mg gallic acid/g样品表示。结果如表1所示：

表1总酚含量测试结果

由表1可知，乙醇浓度、浸提温度、料液比、萃取溶剂、萃取料液比对制备的厚朴多酚提取物中总酚含量有较大影响，实施例3中，当乙醇的浓度为50％，超声浸提的料液比为1:30，浓缩浸膏与萃取剂的料液比为1:10时，得到的厚朴总酚含量最高。

以实施例3、实施例8为测试对象，以奥利司他为对比对象，测试本申请得到的厚朴多酚提取物在体外抑制胰脂肪酶活性的效果，结果如图1所示：

准确称取适量实施例3和实施例8中的厚朴多酚提取物粉末，用甲醇溶解配成一系列浓度的溶液。

使用pH 7.0的Tris-HCI缓冲液配制100U/mL胰脂肪酶溶液。

使用pH 7.0的Tris-HCI缓冲液配制10mM棕榈酸对硝基苯酯溶液。

整个反应体系在96微孔板中进行，总体积为200uL，包括20uL奥利司他溶液或20uL厚朴提取物溶液，50uL胰脂肪酶溶液，100uL棕榈酸对硝基苯酯溶液，剩余体积用Tris-HCI缓冲液(pH 7.0)补齐。上述反应液在37℃孵育20min后于405nm处读数。胰脂肪酶抑制率按以下公式计算：

式中：A

由图1可知，乙酸乙酯部位厚朴多酚提取物(实施例3)和正丁醇部位厚朴多酚提取物(实施例8)以及奥利司他对胰脂肪酶的抑制作用，结果显示三种物质均具有较好的胰脂肪酶抑制活性，其中乙酸乙酯部位提取物对胰脂肪酶的抑制率高于正丁醇部位提取物，但稍低于奥利司他。乙酸乙酯部位对胰脂肪酶的半数抑制浓度IC

以实施例3、实施例8为测试对象，测试本申请得到的厚朴多酚提取物在体内降脂的效果，结果如表2所示：

准确称取实施例3和实施例8中的厚朴多酚提取物粉末，用DMSO溶解配成50mg/mL母液储存在-80℃备用。

秀丽线虫的扩大培养：将适量E.coli OP50菌悬液涂布在NGM平板中央位置，在超净台吹干后置于37℃培养箱中倒置培养24h。待长菌的NGM平板降至常温后，用线虫挑针挑取需要的线虫株系接种在NGM平板上，在20℃条件下培养。当NGM平板上长满大量线虫后，用酒精灯火焰灼烧金属勺末端，切割有线虫的培养基并将其接在新的NGM板上，在20℃继续培养。

秀丽线虫的同步化：将处于产卵期的线虫用M9缓冲液从NGM板上洗下来放入1.5mL离心管中，静置后弃去上清，反复用M9洗三次除去线虫身上黏附的菌。最后一次弃去上清后，在离心管中加入1mL线虫裂解液，迅速剧烈振荡15min至虫体完全裂解，10000rpm/min常温离心1min，弃去上清，得到的沉淀用M9缓冲液清洗4次，最后将含有线虫虫卵的M9缓冲液滴在涂有E.coli OP50的NGM板上，在超净台晾干后放在20℃培养箱中培养，可以获得同时期的线虫子代。

高脂饮食线虫模型的建立：用96孔板培养，每孔加入100μL S-complete培养基，将同步化至L4期的野生型线虫用挑针挑取至S-complete培养基中，每孔挑取10～15条线虫，挑取线虫的时间设为第0天。在96孔板最外面一圈每孔加入200μL M9缓冲液防止水分蒸发，密封后放入20℃培养。其中设置仅含有DMSO的空白对照组、仅添加2％ D-葡萄糖的高脂组，以及添加120μg/mL厚朴乙酸乙酯部位多酚提取物和120μg/mL厚朴正丁醇部位多酚提取物高糖处理组。培养线虫三天后收集不同处理组的线虫用M9缓冲液洗3次，在冰上充分研磨，再在4℃下10000rpm/min离心5min，按照南京建成生物科技有限公司的甘油三酯(TG)、BCA测定试剂盒说明书步骤测定线虫匀浆液上清中甘油三酯、蛋白质含量，每个实验重复三次，结果见表2。

由表2可知，与空白对照组相比，饮食中添加了2％ D-葡萄糖的高脂组中秀丽线虫体内的甘油三酯TG含量显著提高，为空白对照组的2.73倍，而加入120μg/mL厚朴乙酸乙酯部位多酚提取物(实施例3)和120μg/mL厚朴正丁醇部位多酚提取物(实施例8)后，线虫体内的TG含量(mmol/g Protein)显著降低，分别为高脂对照组线虫体内TG含量的67.9％(实施例3)和76.9％(实施例8)，表明厚朴多酚提取物具有较好的降脂作用，可以应用于具有降脂功效的产品开发。

表2厚朴多酚提取物对高脂秀丽线虫体内TG含量的影响

以上结果可知，本发明利用乙醇超声浸提结合萃取剂得到的厚朴多酚提取物具有较好的抑制胰脂肪酶活性及体内降脂效果，尤其是萃取剂为乙酸乙酯时，具有改善脂代谢紊乱和减肥方面的潜力。

以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。