一种寡糖衍生物与外泌体的偶联物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于抗肠道感染药物领域，具体涉及寡糖衍生物与外泌体的偶联物及其制备方法与应用，具体是在志贺毒素感染治疗中的应用。

背景技术

志贺毒素是一类由志贺氏菌和产志贺毒素大肠杆菌等病原菌所产生的毒素，由具有毒性作用的一个A亚基和具有结合活性的5个B亚基组成。志贺毒素通过B亚基结合人肠道细胞表面糖抗原Gb3,进入细胞，志贺毒素A亚基具有核糖体毒性，可以通过破坏细胞的蛋白合成能力导致细胞凋亡，进而造成溶血性尿毒症综合征等严重疾病。目前临床对产志贺毒素病菌感染的对策以输液等支持疗法为主，缺乏特异性的治疗手段。

人体细胞通常表达各种糖抗原如Gb3、Gb4、GM2、GM3等，具有结合志贺毒素的功能，常用作治疗志贺毒素病菌感染相关药物研究的原料。其中，球三糖神经酰胺Gb3是一种中性的鞘糖脂，其结构为Galα1-4Galβ1-4Glcβ-Cer。它是细胞表面的一种糖抗原，也是志贺毒素B亚基结合的天然受体。志贺毒素通过特异性识别并结合人细胞表面的Gb3启动内化途径从而进入胞内发挥毒作用。已经有研究表明，具有多价Gb3结构的中和剂可以有效地结合游离的志贺毒素，并且在动物实验中帮助小鼠避免由志贺毒素造成的致命威胁。其他的Gb4、GM2、GM3等与Gb3对志贺毒素具有相同的结合毒素的作用原理。

外泌体是指一类包含了复杂RNA和蛋白质的小膜泡，直径在40-100nm。几乎所有细胞都能分泌外泌体，其中牛奶来源的牛奶外泌体由于来源广泛、原料价格低廉、生物相容性好等优点成为了研究的热门。外泌体由于其特殊的结构，非常适合用作药物装载和递送的工具。有研究表明，通过向牛奶外泌体中装载癌症治疗化药，可以以口服递送的方式给药，在体内抑制肿瘤的生长，并且比注射游离药物显示出更低的毒副作用与免疫反应。目前尚没有以外泌体作为基础开发用于抵抗肠道感染的药物或与预防剂。

本发明中利用牛奶外泌体等外泌体作为载体，通过疏水作用在表面上高比例修饰上含Gb3等寡糖的含脂链的衍生物，形成偶联物如Gb3-mExo，可以在体外有效中和志贺毒素的受体结合功能，并抑制志贺毒素对于细胞的结合，发挥保护肠道细胞免受志贺毒素毒性的作用。

发明内容

发明目的：设计一种能够中和志贺毒素的基于外泌体的偶联物中和剂，该偶联物抑制了志贺毒素对人体细胞的结合，具有中和游离志贺毒素的毒性的能力，发挥保护人体肠道细胞的作用，是一种有效防治产志贺毒素病原菌感染的候选治疗药物。

技术方案：为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明的第一个目的是，提供一种偶联物，该偶联物是一种特异性结合志贺毒素的中和剂，由以下两个部分偶联形成：

a、外泌体，

b、寡糖衍生物，所述寡糖衍生物为连接有脂链的寡糖，所述脂链具有膜插入功能，所述脂链包括具有C18碳链结构的脂肪酸，所述寡糖为具有2-5个单糖的寡糖结构并可与毒素结合，包括Gb3、Gb4、GM2、GM3其中任意一种；

该偶联物具有以下结构式：

可选的，在本发明的一些实施例中，所述的寡糖结构含2-5个单糖，具有结合志贺毒素B亚基的活性。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述寡糖Gb3的寡糖结构为Galα1-4Galβ1-4Glc，简称为三糖；所述寡糖Gb4的寡糖结构为GlcNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc，简称为四糖；所述寡糖GM2的寡糖结构为GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc，所述寡糖GM3的寡糖结构为Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述寡糖结构与脂链的连接方式为酰胺键共价连接。

进一步可选的，在本发明的一些实施例中，所述的寡糖衍生物由乳糖衍生物通过化学酶法合成而来，并由十八酸进行脂链修饰，所述脂链修饰为：十八酸的羧基与寡糖衍生物1号位衍生的氨基通过酰胺缩合反应进行共价连接。

在本发明的一些实施例中，所述外泌体包括牛奶外泌体，或任何培养细胞来源的外泌体，或人工合成的外泌体或者是类似的机构。其中，所述牛奶外泌体为通过超速离心法从鲜牛乳中提取的具有典型特征的外泌体。

可选的，在本发明的一些实施例中，寡糖衍生物以寡糖Gb3的衍生物为例，寡糖衍生物记作Gb3-lipid，所述的Gb3寡糖衍生物的结构如下：

Gb3-lipid

同理，其他寡糖Gb4、GM2、GM3的脂链衍生物Gb4-lipid、GM2-lipid、GM3-lipid与Gb3-lipid类似，区别在于其中的寡糖结构不同。因此，寡糖衍生物的结构通式可以记作如下所示结构：

可选的，在本发明的一些实施例中，如上式所示，当寡糖为Gb3时，所述的寡糖衍生物Gb3-lipid含有：寡糖结构为Galα1-4Galβ1-4Glc的Gb3寡糖结构(三糖)、长度为C

寡糖衍生物Gb4-lipid含有：寡糖结构为GlcNAcβ1-3Galα1-4Galβ1-4Glc的Gb4寡糖结构(四糖)、长度为C

寡糖衍生物GM2-lipid含有：寡糖结构为GalNAcβ1-4(Neu5Acα2-3)Galβ1-4Glc的GM2寡糖结构(四糖)、长度为C

寡糖衍生物GM3-lipid含有：寡糖结构为Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc的GM3寡糖结构(三糖)、长度为C

其中，寡糖结构作为寡糖衍生物Gb3-lipid、Gb4-lipid、GM2-lipid、GM3-lipid的核心组分，通过与志贺毒素B亚基特异性结合发挥中和作用，脂肪链部分作为具有疏水性的组分，具有膜插入功能，与同样性质的外泌体脂双层部分通过疏水相互作用进行自发连接，达到在外泌体表面修饰Gb3、Gb4、GM2、GM3等寡糖的目的。

可选的，在本发明中，所述志贺毒素B亚基包括志贺毒素2B亚基或志贺毒素1B亚基，所述志贺毒素2B亚基重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述志贺毒素2B亚基重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。所述志贺毒素1B亚基重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码所述志贺毒素1B亚基重组蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述的寡糖衍生物中的寡糖结构的制备方法包括以下步骤：

S1、以羟基全乙酰化的单糖衍生物作为起始化合物，该化合物具有Boc基团保护的NH

其中，寡糖Gb3中含有的单糖单元有两个半乳糖(Gal)、一个葡萄糖(Glc)，寡糖Gb4中含有的单糖单元有一个乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、两个半乳糖(Gal)、一个葡萄糖(Glc)，寡糖GM2中含有的单糖单元有一个乙酰氨基半乳糖(GalNAc)、一个唾液酸(Neu5Ac)、一个半乳糖(Gal)、一个葡萄糖(Glc)，GM3中含有的单糖单元有一个唾液酸(Neu5Ac)、一个半乳糖(Gal)、一个葡萄糖(Glc)；

S2、在半乳糖基转移酶LgtC的催化下，以UDP-Gal作为糖基供体，以化合物A作为糖基受体，发生转糖基反应，合成具有寡糖结构的化合物B。

可选的，在本发明的一些实施例中，以寡糖Gb3为例，其寡糖结构中，含有由两个单糖单元组成的乳糖结构，故其衍生物以乳糖作为起始物。具体的，所述的寡糖衍生物中的三糖结构的制备方法包括以下步骤：

S1、以羟基全乙酰化的乳糖衍生物作为起始化合物，该化合物具有Boc基团保护的NH

S2、在半乳糖基转移酶LgtC的催化下，以尿苷二磷酸-半乳糖UDP-Gal作为糖基供体，以化合物A作为糖基受体，发生转糖基反应，合成具有三糖结构的化合物B，即为具有三糖结构的寡糖。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述步骤S1中，所述乳糖衍生物在所述甲醇钠的甲醇溶液中的浓度为10-100mg/mL。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述步骤S1中，所述甲醇钠的甲醇溶液中，甲醇钠的浓度为1-100μL/mL。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述步骤S2中，该酶反应体系中，各反应物的浓度为：1-100mM Tris-HCl，2-100mM MnCl

可选的，在本发明的一些实施例中，所述步骤S2中，反应后，用等量无水乙醇沉淀。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述寡糖衍生物中的脂链结构的制备方法包括以下步骤：

S3、具有三糖结构的寡糖在吡啶溶液中与乙酸酐发生乙酰化反应生成羟基被全部乙酰化的化合物C，化合物C通过硅胶柱层析法纯化；

S4、化合物C在TFA和DCM的混合溶液中脱去Boc保护基使NH

S5、通过二环己基碳二亚胺和NHS方法活化十八酸的羧基，形成活性酯，再与化合物D通过酰胺缩合反应形成化合物E；

S6、化合物E在甲醇钠的甲醇溶液的条件下将乙酰基全部脱除得到脂链修饰的寡糖衍生物。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述步骤S3中，所述具有三糖结构的寡糖与乙酸酐的比例为10-100mg/mL。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述步骤S4中，所述化合物C与TFA和DCM的混合溶液的比例为1-100mg/mL。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述步骤S5中，所述活性酯以30-100倍当量与化合物D在1mL DMF与5μL DIPEA中室温搅拌反应过夜。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述步骤S6中，所述甲醇钠的甲醇溶液中，甲醇钠的浓度为10-100μL/mL。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述步骤S6中，化合物E在所述甲醇钠的甲醇溶液中的浓度为1-100mg/mL。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述寡糖衍生物的制备方法包括以下步骤：

S1、以羟基全乙酰化的乳糖衍生物作为起始化合物，该化合物具有Boc基团保护的NH

S2、在半乳糖基转移酶LgtC的催化下，以尿苷二磷酸-半乳糖UDP-Gal作为糖基供体，以化合物A作为糖基受体，发生转糖基反应，合成具有三糖结构的化合物B；

S3、化合物B在吡啶溶液中与乙酸酐发生乙酰化反应生成羟基被全部乙酰化的化合物C，化合物C通过硅胶柱层析法纯化；

S4、化合物C在三氟乙酸TFA和二氯甲烷DCM的混合溶液中脱去Boc保护基使NH

S5、通过二环己基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺NHS方法活化十八酸的羧基，形成活性酯，再与化合物D通过酰胺缩合反应形成化合物E；

S6、化合物E在甲醇钠的甲醇溶液的条件下将乙酰基全部脱除得到脂链修饰的寡糖衍生物。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述的牛奶外泌体的提取方法包括如下步骤：

首先通过高速离心除去牛奶中的乳脂肪，随后通过调节pH除去牛奶中的酪蛋白得到乳清，用滤膜过滤后经超高速离心法沉淀提取牛奶外泌体，经PBS缓冲液洗涤沉淀并重悬后得到牛奶外泌体。

可选的，在本发明的一些实施例中，用盐酸调节pH至4-5。

在本发明中，所述牛奶外泌体的提取方法包括以下步骤：

1)通过高速离心除去鲜牛乳中的乳脂肪；

2)通过调节pH至4.6除去牛奶中的酪蛋白；

3)通过超高速离心从乳清中提取牛奶外泌体。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述高速离心的离心力为10000g～15000g，所述超高速离心的离心力为100000g～150000g。

本发明的第二个目的是，提供一种偶联物的制备方法，包括以下步骤：寡糖衍生物与外泌体通过疏水作用互相结合，得到所述偶联物，所述寡糖衍生物为连接有脂链的寡糖，所述脂链包括具有C18碳链结构的脂肪酸，所述寡糖为具有2-5个单糖的结构并可与毒素结合，包括Gb3、Gb4、GM2、GM3其中任意一种。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述方法具体包括以下步骤：

1)寡糖衍生物的化学酶法合成；

2)外泌体的制取；

3)寡糖衍生物与外泌体通过疏水作用互相结合，得到所述偶联物。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述寡糖衍生物与外泌体通过疏水作用互相结合的方法具体包括，所述寡糖衍生物溶于缓冲溶液中，按50-500μg·mL

可选的，在本发明的一些实施例中，所述偶联物中，每个外泌体上修饰有10

本发明是一种由外泌体与志贺毒素天然受体如Gb3这类寡糖的衍生物偶联形成的毒素中和分子，首先以乳糖衍生物为原料，通过酶联反应形成三糖结构(能与志贺毒素结合的寡糖结构)，通过化学反应连接脂链，形成寡糖衍生物如Gb3-lipid。

可选的，在本发明的一些实施例中，通过超速离心法从鲜牛奶中提取牛奶外泌体，与寡糖衍生物共孵育，通过疏水作用连接，得到所述的寡糖衍生物与牛奶外泌体的偶联物。

可选的，在本发明的一些实施例中，所述的酶联反应为半乳糖基转移酶介导的转糖基反应，所述的化学反应连接为经典的酰胺缩合反应进行的共价连接。

本发明的第三个目的是，提供一种组合物，该组合物包括上述的偶联物。组合物的形式可以是药剂、营养品等任意一种。

本发明的第四个目的是，提供一种上述的偶联物或组合物的应用，所述偶联物应用于中和志贺毒素，尤其是应用于中和志贺毒素B亚基，所述的应用包括体外中和游离志贺毒素及抑制毒素与细胞间的结合。

本发明主要是用于牛奶外泌体与包括Gb3在内的毒素配体这类具有特异性结合毒素能力的分子进行偶联的毒素中和剂的体外中和毒素应用，所述体外中和毒素应用包括酶联免疫吸附实验与流式细胞实验。

有益效果：本发明提供的寡糖衍生物与牛奶外泌体偶联物、制备方法及应用，与现有研究结果相比，具有以下优势：

(1)本发明利用牛奶外泌体负载量大的优点，将Gb3等能结合毒素的寡糖衍生物通过脂链结构引入到外泌体表面，该方法修饰效率高，在保证了外泌体完整性的同时，外泌表面能够形成高的寡糖修饰比例，每个外泌体上修饰有10

(2)该制备方法具有成本低廉、操作简便、毒素中和活性好等优点。

(3)选用的外泌体优选为牛奶外泌体，牛奶外泌体来源于传统食物，具有天然的安全性，将其与志贺毒素结合的寡糖衍生物组合制备的偶联物满足口服制剂安全性的要求，适合作为肠道感染性疾病的口服制剂用于相关感染的预防和治疗。

附图说明

图1为本发明的技术路线示意图。

图2为Gb3寡糖衍生物的合成路线。

图3为Gb3寡糖衍生物的质谱表征关键数据。

图4为Gb3寡糖衍生物的核磁氢谱表征关键数据。

图5为Gb3寡糖衍生物的核磁碳谱表征关键数据。

图6为牛奶外泌体的提取步骤示意图。

图7为牛奶外泌体的电镜与动态光散射表征关键数据。

图8为Gb3-mExo偶联物的电镜与动态光散射表征关键数据。

图9为Gb3-mExo偶联物中和志贺毒素2B亚基的酶联免疫吸附实验的关键数据。

图10为Gb3-mExo偶联物中和志贺毒素2B亚基的流式细胞实验的关键数据。

图11为Gb3(m)-mExo偶联物对志贺毒素2B亚基中和能力流式实验的关键数据。

图12为Gb3-mExo偶联物中和志贺毒素2B亚基的免疫荧光实验的关键数据。

图13为Gb3-mExo偶联物对于正常细胞的生物安全性实验的关键数据。

图14为Gb3-mExo偶联物中和志贺毒素1B亚基的流式细胞实验的关键数据。

具体实施方法

本发明属于抗肠道感染药物领域，具体涉及一种基于外泌体的志贺毒素中和剂的制备方法，如图1所示，以Gb3为寡糖代表示例，外泌体选用牛奶外泌体，制备本发明的偶联物Gb3-lipid包括步骤：

a、Gb3寡糖衍生物Gb3-lipid的化学酶法合成；

b、牛奶外泌体的提取；

c、上述Gb3寡糖衍生物Gb3-lipid和牛奶外泌体的偶联。

本发明所述的偶联物，能够有效地中和志贺毒素，并抑制毒素对于细胞的结合。所述的偶联物分子具有制备简单，来源广泛，安全性高等优点。

下面结合附图和实施例，对本发明作更进一步的说明。需要指出的是，所给出的实施例并未限制本发明的范围，与Gb3结合毒素功能类似的各种糖抗原寡糖如Gb4、GM2、GM3等的外泌体偶联物，这一类发挥毒素中和效果的偶联物因其具有相同的原理和效果，同样属于本发明的保护范围。同理，其他外泌体也与本实施例中的牛奶外泌体同理，同样属于本发明的保护范围。

根据下述实施例，可以更好的理解本发明。然而，本领域的技术人员应当理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

实施例1寡糖衍生物Gb3-Lipid的化学酶法合成

如图2所示，所述的Gb3寡糖衍生物的合成步骤如下：

S1、以全乙酰化乳糖衍生物(82.2mg)为原材料1，在50mL圆底烧瓶中加入20μL甲醇钠的2mL甲醇溶液，于室温条件下搅拌反应1h将乙酰基全部脱除，反应完成后滴加醋酸调节pH至6～7，用旋转蒸发仪除去溶剂后得到乳糖衍生物2(60.4mg，113.9％)，即化合物A；

S2、随后在酶反应缓冲液中进行转糖基反应，所用的酶反应体系为：5mM Tris-HCl，10mM MnCl

S3、将Gb3衍生物3(65.4mg)溶于3mL吡啶溶液中，缓慢滴加1.5mL预冷的乙酸酐发生乙酰化反应，在室温下反应6h，经TLC(BuOH：H

S4、全乙酰化Gb3衍生物4(24.56mg)在1mL TFA和DCM的混合溶液中冰浴反应1h将Boc保护基脱除，经TLC检测反应完全后用5mL甲苯洗涤2次后旋干得到带有氨基的Gb3衍生物5，即化合物D。

S5、通过二环己基碳二亚胺和NHS方法活化十八酸的羧基，形成活性酯，然后以30倍当量与Gb3衍生物5(22.34mg)在1mL DMF与5μL DIPEA中室温搅拌反应过夜，通过酰胺缩合反应将碳链连接到Gb3上，经TLC(PE：EA＝2：3)检测反应完全后使用硅胶柱层析在PE：EA＝1：2的条件下进行纯化，将溶剂旋干后得到Gb3衍生物6(21.6mg，76.5％)，即化合物E。

S6、Gb3衍生物6(21mg)在加入20μL甲醇钠的2mL甲醇溶液中于37℃条件下反应1h将乙酰基全部脱除，经TLC检测反应完全后，向反应液中加入酸性树脂将pH调节至6～7，过滤后旋干溶剂得到带有脂链的Gb3衍生物7(9.3mg，67.1％)，即本发明中所使用的Gb3寡糖衍生物。

图2为Gb3寡糖衍生物的合成路线。反应条件为a：MeONa(20μL)，MeOH(2mL)；b：Tris-HCl(5mM)，MnCl

图3、4、5为Gb3寡糖衍生物的质谱、核磁氢谱、核磁碳谱的表征关键数据。Gb3寡糖衍生物核磁表征使用的溶剂为DCM：MeOH＝1：1。上述数据显示，所制备的Gb3寡糖衍生物的分子量与结构符合预期。

实施例2牛奶外泌体的提取

如图6所示，牛奶外泌体的提取步骤如下：

将牛奶分装至50mL离心管中，在4℃，13,000×g条件下离心30min。离心后挑去表面脂肪，收集下方的脱脂牛奶。向脱脂牛奶中逐渐滴加2M盐酸将pH调节至4.6，观察到大量白色酪蛋白沉淀生成，在4℃，10,000×g条件下离心60min，除去沉淀取乳清。将乳清用0.22μm的滤膜过滤，然后再次分装到50mL离心管中，使用超高速离心机在4℃，135,000×g条件下离心60min，所得沉淀即为牛奶外泌体。使用PBS将外泌体润洗3次重悬后保存在-20℃条件下。

图7为牛奶外泌体的透射式电子显微镜和动态光散射的表征关键数据。图A为外泌体的透射电镜观察结果图，图B为动态光散射测量外泌体水合粒径和Zeta电位结果图。结果显示，提取的外泌体具有典型的囊泡结构，平均水合动力学粒径为132.8nm，Zeta电位为-9.71mV，与已有的研究结果相符。

实施例3Gb3与牛奶外泌体偶联物的制备

将Gb3-lipid配成1mg·mL

图8为Gb3-mExo偶联物的电镜与动态光散射表征关键数据。图A、B、C分别是Gb3(l)-mExo，Gb3(m)-mExo和Gb3(h)-mExo的透射电镜观察结果图和动态光散射测量偶联物水合粒径和Zeta电位结果图。图D为各偶联物与外泌体的水合动力学粒径对比柱状图，图E为偶联物与外泌体的Zeta电位对比柱状图。结果显示，Gb3(l)-mExo，Gb3(m)-mExo和Gb3(h)-mExo的平均水合动力学粒径分别为137.2nm，167.2nm和168.9nm，Zeta电位分别为-13.5mV，-18.5mV和-10.8mV，说明Gb3修饰后的外泌体与修饰前相比，水合粒径普遍增大，Zeta电位普遍减小，Gb3(l)-mExo，Gb3(m)-mExo的膜结构依然保持和外泌体类似的囊泡结构，但是Gb3(h)-mExo的形态发生了变化，并没有观察到典型的外泌体结构。

实施例4Gb3寡糖衍生物与牛奶外泌体偶联物的体外中和活性

本发明中使用的目的蛋白为重组的志贺毒素2B亚基蛋白，其氨基酸序列与核苷酸如序列表所示，其中含有用于检测的Myc标签与用于纯化的6×His标签，由大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行原核表达。

将商品化的FSL-Gb3配置为2μg·mL

图9为Gb3寡糖衍生物与牛奶外泌体偶联物中和志贺毒素B亚基的酶联免疫吸附实验的关键数据。图A为Gb3(l)-mExo对志贺毒素的中和ELISA结果图，图B为Gb3(m)-mExo对志贺毒素的中和ELISA结果图，图C为Gb3(h)-mExo对志贺毒素的中和ELISA结果图。结果显示，Gb3(l)-mExo和Gb3(m)-mExo都能以浓度依赖的形式中和志贺毒素，Gb3(l)-mExo和Gb3(m)-mExo的对500nM Stx2B半抑制用量分别为每毫升1.72×10

实施例5不同Gb3与牛奶外泌体偶联物对志贺毒素2B亚基中和能力的验证

本发明中中和志贺毒素2B亚基的流式细胞实验使用的模型细胞为Gb3高表达的结肠癌细胞HT29。

使用胰蛋白酶消化并收集培养瓶中的HT29肿瘤细胞，将细胞浓度调整至8×10

图10为Gb3-mExo偶联物中和志贺毒素2B亚基的流式细胞实验的关键数据。图10A为流式细胞术位移直方图。图10B为根据图10A数据绘制的平均荧光强度(MFI)的直方图。结果显示，与阴性对照相比，阳性对照组观察到显著位移，说明Stx2B蛋白富集在了细胞表面。另外，与阳性对照组相比，牛奶外泌体处理组并没有明显区别，说明牛奶外泌体自身没有中和志贺毒素2B亚基的能力。而偶联物Gb3(l)-mExo，Gb3(m)-mExo都具有较强的志贺毒素2B亚基中和能力，其中Gb3(m)-mExo完全抑制了志贺毒素2B亚基对细胞的结合，而Gb3(h)-mExo则中和能力较差。

实施例6Gb3与牛奶外泌体偶联物对志贺毒素2B亚基剂量依赖中和能力的流式细胞术验证

优选的，在本实施例中，以Gb3(m)-mExo为例进行定量中和志贺毒素2B亚基能力的流式验证实验。

细胞处理，样品制备与流式实验方法与实施例5基本相同。其中需要指出的是，实验组采用浓度梯度的Gb3(m)-mExo与相同浓度的Stx2B进行共孵育来检测不同浓度的偶联物对志贺毒素2B亚基毒素的中和效率。

图11为Gb3(m)-mExo偶联物对志贺毒素2B亚基中和能力流式实验的关键数据。图11A为不同浓度的Gb3(m)-mExo偶联物对250nM Stx2B蛋白抑制效果的流式位移图，1：对照组；2:500nM Stx2B；3～9：500nM Stx2B与不同浓度的Gb3(m)-mExo实验组，图11B为根据图11A数据所绘制的折线图。结果显示，Gb3(m)-mExo能以浓度依赖的形式抑制志贺毒素2B亚基毒素对细胞的结合，在最大浓度下能基本完全抑制Stx2B对细胞的结合，而随着使用Gb3(m)-mExo浓度的降低，中和效果显著下降，当稀释到设定最低浓度时，已经观察不到中和效果，与理论结果相符。

实施例7Gb3与牛奶外泌体偶联物对志贺毒素中和能力的免疫荧光验证

使用胰蛋白酶消化并收集培养瓶中的HT29肿瘤细胞，将细胞浓度调整至8×10

图12为偶联物中和志贺毒素2B的免疫荧光实验的关键数据。其中纵向4列从左向右分别是阴性对照组，250nM Stx阳性对照组，250nM Stx+有效组分12.5mg·mL

实施例8Gb3与牛奶外泌体偶联物的安全性(细胞毒性)检测

本发明中检测偶联物对细胞的毒性作用实验中使用的模型细胞为人正常肠上皮细胞NCM460。

使用胰蛋白酶消化并收集培养瓶中的NCM460细胞，将细胞浓度调整至5×10

图13为Gb3-mExo偶联物对于正常细胞的生物安全性实验的关键数据。结果显示，在12-24h的时间段内，Gb3寡糖衍生物与牛奶外泌体偶联物没有对NCM460细胞的活性造成显著影响，表明偶联物具有较高的生物安全性。

实施例9不同Gb3与牛奶外泌体偶联物对志贺毒素1B亚基中和能力的验证

与实施例5为实验步骤一样，区别是将中和的毒素对象替换为志贺毒素1B亚基。

图14为Gb3-mExo偶联物中和志贺毒素1B亚基的流式细胞实验的关键数据。图14A为流式细胞术位移直方图。图14B为根据图14A数据绘制的平均荧光强度(MFI)的直方图。结果显示，与阴性对照相比，阳性对照组观察到显著位移，说明Stx2B蛋白富集在了细胞表面。另外，与阳性对照组相比，牛奶外泌体处理组并没有明显区别，说明牛奶外泌体自身没有中和志贺毒素1B亚基的能力。而偶联物Gb3(l)-mExo，Gb3(m)-mExo都具有较强的志贺毒素1B亚基中和能力，其中Gb3(m)-mExo抑制效果最好，Gb3(h)-mExo则抑制效果较差。

综上所示，本发明实施例所述的寡糖衍生物与牛奶外泌体偶联物以从鲜牛奶中提取出的外泌体为基础，与寡糖衍生物分子中所带脂链通过疏水作用组合而成。本发明在牛奶外泌体上修饰能与志贺毒素结合的寡糖分子，尤其是其天然受体Gb3的寡糖衍生物，所形成的偶联物中偶联物的寡糖衍生物比例高达2.56×10

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。