一种间充质细胞3D球的玻璃化冻存方法

技术领域

本发明涉及生物材料和多细胞组织冷冻保存领域，尤其涉及一种间充质细胞3D球的玻璃化冻存方法。

背景技术

间充质干细胞(MSCs)作为一种新的医学治疗方法已经引起了研究领域的极大关注。它具有很强的再生和免疫调节特性，在治疗退行性疾病、炎症和自身免疫性疾病以及许多其他医学需求未得到满足的疾病中具有潜在的用途。在早期临床试验中，间充质干细胞表现出极佳的安全性。监管机构现已批准MSCs治疗欧洲克罗恩病肛周瘘、日本类固醇难治性急性移植物抗宿主病(GvHD)以及加拿大和新西兰儿童GvHD。因此，MSCs疗法现在正在成为多种适应症的既定疗法。

与传统的二维(2D)贴壁培养相比，3D培养系统被证明可以通过改变细胞相互作和分子变化来增强MSCs旁分泌活性。2D培养表面具有高基础粘附和强制细胞极性；3D培养系统减少了强迫极性和过度的基础扩散，使3D细胞能够采用更有利于MSC旁分泌功能的生理形态。此外，与2D单层培养相比，细胞-细胞和细胞-基质相互作用的3D上调与MSCs旁分泌功能增加之间存在公认的相关性，能更好地模拟体内微环境，体内治疗效果就可以更好的在体外实验中模拟出来；在移植后也能在体内存活更长时间。但是3D培养的缺陷在于周期较长，在培养和收集期间需要消耗人力，现养现用的时间成本非常高。

细胞冻存是通过利用低温环境，减缓细胞生长速率，减少细胞新陈代谢，从而达到长期储存细胞的技术。目前的细胞冻存能达到的最低温度是-196℃，置于液氮中，储存的时间可长达几年，甚至十几年之久。细胞冷冻过程中对细胞损伤最大的就是细胞内冰结晶，其次是细胞外冰结晶。细胞内结晶会直接扎破细胞膜，从而导致细胞死亡。其次，在冷冻降温的过程中，细胞还会经历渗透性休克、重结晶等损害，降温过程越久，细胞死亡数量会更高。目前大多实验室使用的冻存方法都是慢速冻存，及用冻存液将细胞混匀后，-3℃/min降温至-80℃，再放入液氮中保存。这种方法会使细胞长期暴露于危险中，而且只适用于单细胞样品。玻璃化冻存是近年来为提高细胞存活率而使用率逐渐提高的冻存方法，它使用高浓度冻存液置换细胞内水分，防止细胞内结晶，并且急速降温，使细胞内容物从液态迅速转化为玻璃化状态，最大限度减少重结晶对细胞的损伤。但是玻璃化冻存需要特殊的载体装置，且冻存细胞量有限，操作复杂，相关耗材的价格比较昂贵，从而导致其不能广泛应用，近年来主要用于胚胎、胰岛、卵母细胞等做多细胞组织样品。

发明内容

针对人脐带来源间充质干细胞3D球玻璃化冻存中，冻存液浓度不确定、难以渗透到3D球内部，冻存过程中细胞外结晶损伤和冻存操作中的物理损伤等，本发明提供一种人脐带来源间充质细胞3D球玻璃化冻存方法，操作简单，细胞复苏后存活率高，细胞性能好。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案如下：一种间充质细胞3D球的玻璃化冻存方法，所述冻存方法包括以下步骤：

步骤(1)间充质干细胞3D培养成间充质干细胞3D球；

步骤(2)收集步骤(1)间充质干细胞3D球进行微流控包胶操作：将间充质干细胞3D球分散在水相溶剂中，混合均匀；调整油相溶剂与水相溶剂的流速比，使其形成油包水的微液滴，确保每个微液滴中包裹一个间充质干细胞3D球，收集于低吸附培养皿中；将培养皿中收集微液滴放在蓝光下进行照射固化40-90s，形成包裹了固态水相溶剂的间充质细胞3D球，使用30-37℃的生理盐水对间充质细胞3D球进行冲洗，洗净油相溶剂，最后收集在PBS中备用；

步骤(3)间充质干细胞3D球玻璃化冻存：将步骤(2)收集的间充质细胞3D球放入冻存液I中，室温孵育10-15min；随后将冻存液I去除，加入冻存液II，0-4℃孵育10-15min；孵育结束后，快速将间充质干细胞3D球转移至尼龙网片上，再将尼龙网放于无菌纸上吸干多余的冻存液；用无菌镊子夹住盛有间充质干细胞3D球的尼龙网片，快速放入液氮中，30-60s后放入提前预冷的细胞冻存管中，拧上管盖，放入细胞液氮储存罐中。

作为优选，所述微流控包胶操作中油相和水相的配方如下：

以配置100mL油相溶剂计算：取3.75-4mL的表面活性剂span80于离心管中，加入矿物油定溶至100mL；

以配置5mL水相溶剂计算：取0.15g-1g光固化明胶GelMA、0.05g-0.15g光引发剂Lap溶解于5mLPBS中。

作为优选，所述的光固化明胶GelMA合成过程如下：将1-1.5g明胶溶解于预热60-65℃的100-120mL PBS溶液中，pH为7.3-7.5，搅拌至明胶完全溶解，用移液器缓慢滴加0.8-1.2甲基丙烯酸酐到明胶溶液中，整个过程置于45-50℃磁力搅拌器上搅拌反应，反应至明胶的氨基取代度≥90％，添加去离子水150-200mL进行稀释终止反应；将混合水溶液转移到12～14kDa截断透析膜透析袋中，透析袋置于烧杯中，烧杯中添加去离子水，透析7天后，转移GelMA液体至一次性塑料培养皿中，置于冷冻干燥机中-28～-30℃冷冻干燥48小时，得到白色海绵状固体，即为GelMA，将其收集到离心管中置于-20℃低温保存冰箱中长期保存。

作为优选，所述间充质干细胞3D球分散在水相溶剂中的体积比例为1：1-1.5；所述油相溶剂与水相溶剂的流速比为1.5-2.5：1。

作为优选，所述间充质干细胞3D球冻存后复苏过程如下：将细胞冻存管从液氮储存罐子中去除，用镊子将盛有间充质干细胞3D球的尼龙网片夹出，迅速放入2-5mL复苏液I中，0-4℃孵育10-15min，孵育期间用移液枪吸取复苏液轻轻吹落黏在尼龙网片上的间充质干细胞3D球，收集间充质干细胞3D球，去除尼龙网片；随后加入复苏液II，0-4℃孵育5-10min；随后再加入复苏液III，室温孵育5-10min；孵育结束后将复苏液去除，间充质干细胞3D球转移至细胞培养中皿中，加入7-10mL提前30-37℃预热的间充质干细胞培养基，置于细胞培养箱中复温培养15-30min，结束复苏。

作为优选，所述冻存液配方如下：

冻存液I为添加了8-10％DMSO+8-10％乙二醇的DMEM培养基；

冻存液II为添加了15-20％DMSO+15-20％乙二醇的DMEM培养基，0-4℃预冷；

作为优选，所述复苏液配方如下：

复苏液I为添加了8-10％DMSO+8-10％乙二醇+5-7％蔗糖的DMEM培养基，0-4℃预冷；

复苏液II为在复苏液I中加入等体积10-14％蔗糖的DMEM，0-4℃预冷；

复苏液III为在复苏液II中加入等体积10-14％蔗糖的DMEM。

作为优选，所述间充质干细胞为人脐带来源间充质干细胞。

作为优选，所述步骤(3)中的尼龙网片使用孔径40-150um尼龙网剪裁而成，大小为1-2cm边长的等边三角形。使用尼龙网承载间充质干细胞3D球，可将多余的冻存液过滤掉。将尼龙网三个角折叠后可包裹住所有间充质干细胞3D球，方便后期复苏拿取。

本发明的特点如下：本发明采用微流控技术用材料包裹细胞3D球，用DMSO、乙二醇配制冻存液，用DMSO、乙二醇和蔗糖配制复苏液，以达到更好的冻存效果，复苏后存活率可达到95％。本发明利用微流控降低了操作过程中对细胞球造成的物理损害，利用冻存液减少冰结晶对细胞的损伤，确保冻存后人脐带来源间充质细胞依然有较高的存活率和功能性。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明中的间充质干细胞3D球玻璃化冻存液对细胞内冰结晶的减少有显著效果，复苏后，细胞存活率可以达到95％及以上，增殖能力能达到未冻存时的90％，且细胞毒性较小；

本发明中的微流控技术可以有效地减少细胞外结冰和冻存过程中产生的物理损伤，能够使细胞冻存中受到地损伤更少，让细胞冻存保护更上一个梯度。

附图说明

图1冻存液细胞毒性检测(存活率检测)；

图2微流控溶剂细胞毒性检测(存活率检测)；

图3微流控溶剂细胞毒性检测(增殖率检测)；

图4玻璃化冻存和复苏后细胞存活率检测；

图5玻璃化冻存和复苏后细胞增殖率检测；

图6微流控/未微流控3D球冻存后外形对比；

图7微流控/未微流控3D球冻存后存活率对比；

图8微流控/未微流控3D球冻存后增殖率对比；

图9为不同比例的DMSO和乙二醇对细胞毒性的影响；

图10为不同比例的DMSO和乙二醇对细胞存活率的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。

甲基丙烯酸酐化明胶的制备过程如下：将1-1.5g明胶溶解于预热60-65℃的100-120mL PBS溶液中，pH为7.3-7.5，搅拌至明胶完全溶解，用移液器缓慢滴加0.8-1.2甲基丙烯酸酐到明胶溶液中，整个过程置于45-50℃磁力搅拌器上搅拌反应，反应至明胶的氨基取代度≥90％，添加去离子水150-200mL进行稀释终止反应；将混合水溶液转移到12～14kDa截断透析膜透析袋中，透析袋置于烧杯中，烧杯中添加去离子水，透析7天后，转移GelMA液体至一次性塑料培养皿中，置于冷冻干燥机中-28～-30℃冷冻干燥48小时，得到白色海绵状固体，即为GelMA，将其收集到离心管中置于-20℃低温保存冰箱中长期保存。

实施例1间充质干细胞3D球玻璃化冻存与复苏

1.1间充质干细胞3D培养

本发明间充质干细胞球的制备方法属于现有方法，比如可参考CN202010166926.3间充质干细胞球及其制备方法和应用以及成球培养基在制备间充质干细胞球中的应用。

1.2微流控操作包胶

1.2.1配置微流控两相溶液

(1)配置100mL油相溶剂：取3.75mL的span80(司盘80)于离心管中，加入矿物油定溶至100mL；

(2)配置5mL水相溶剂：取0.15g-1gGelMA(甲基丙烯酸酐化明胶)、0.05g-0.15g蓝光引发剂Lap(苯基(2，4，6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂)溶解于5mLPBS(磷酸缓冲盐溶液)中；

1.2.2微流控操作包胶

将间充质干细胞3D球分散在水相溶剂中二者体积比1：1，混合均匀。调整油相溶剂与水相溶剂的流速比2：1，使其形成油包水的微液滴，确保每个微液滴中包裹一个间充质干细胞3D球，收集于低吸附培养皿中。将培养皿中收集微液滴放在蓝光下进行照射固化1min，形成包裹了固态水相溶剂的间充质细胞3D球。使用37℃的生理盐水对间充质细胞3D球进行冲洗，洗净油相溶剂，最后收集在PBS中备用。

1.3间充质干细胞3D球玻璃化冻存与复苏

1.3.1配置冻存液和复苏液

(1)冻存液I为添加了10％DMSO+10％乙二醇的DMEM培养基；

(2)冻存液II为添加了15％DMSO+15％乙二醇的DMEM培养基，4℃预冷；

(3)复苏液I为添加了10％DMSO+10％乙二醇+5％蔗糖的DMEM培养基，4℃预冷；

(4)复苏液II为在复苏液I中加入等体积10％蔗糖的DMEM，4℃预冷；

(5)复苏液III为在复苏液II中加入等体积10％蔗糖的DMEM；

1.3.2间充质干细胞3D球玻璃化冻存

将操作1.2.2中收集的间充质细胞3D球放入冻存液I中，室温孵育10min；随后将冻存液I去除，加入冻存液II，4℃孵育10分钟；孵育结束后，快速将间充质干细胞3D球转移至尼龙网片上，再将尼龙网放于无菌纸上吸干多余的冻存液。用无菌镊子夹住盛有间充质干细胞3D球的尼龙网片，快速放入液氮中，30s后放入提前预冷的2mL细胞冻存管中，拧上管盖，放入细胞液氮储存罐中。

1.3.3间充质干细胞3D球玻璃化复苏

将细胞冻存管从液氮储存罐子中去除，用镊子将盛有间充质干细胞3D球的尼龙网片夹出，迅速放入5mL复苏冻存液I中，4℃10min，孵育期间用1mL移液枪吸取复苏液轻轻吹落黏在尼龙网片上的间充质干细胞3D球，收集3D球，去除尼龙网片；随后加入复苏液II，4℃孵育5min；随后再加入复苏液III，室温孵育5min。孵育结束后将复苏液去除，间充质干细胞3D球转移至细胞培养中皿中，加入10mL提前37℃预热的间充质干细胞培养基，置于37℃细胞培养箱中复温培养15min。结束复苏，可进行后续实验。

复苏培养使用间充质干细胞常用培养基，在本发明的实施例中，间充质干细胞培养基为添加了12％胎牛血清，1％青霉素链霉素的DMEM培养基。

实施例2冻存液和微流控溶剂对间充质干细胞3D球的细胞毒性检测

用Clacein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒检测本发明中的冻存液对间充质干细胞的细胞毒性。由图1可知，冻存液孵育后的细胞存活率可达到98％以上，细胞毒性较小。用带小室的12孔板将间充质干细胞和微流控材料共培养，用Clacein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒和增殖基因Ki-67表达量检测微流控溶剂对间充质干细胞的细胞毒性。由图2-3可知，与微流控溶剂共培养的间充质干细胞活性和增殖能力未受到影响，无细胞毒性。由图1-图3可知，本发明中使用到的冻存液和微流控溶剂对间充质干细胞几乎没有细胞毒性。

实施例3间充质干细胞3D球玻璃化冻存与复苏后活性与增殖能力检测

用Clacein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒检测玻璃化冻存和复苏后的间充质干细胞3D球的细胞活性。由图4可知，玻璃化冻存和复苏后的细胞存活率可达到95％以上。用增殖基因Ki-67的表达量体现间充质干细胞3D球的增殖能力。由图5可知，玻璃化冻存和复苏后的细胞增殖能力可达到90％以上。由图4-5可知，本发明冻存的间充质干细胞3D球在复苏之后具备良好的细胞活性和细胞增殖能力，与新鲜的间充质干细胞3D球接近，由此可知，本发明对于间充质干细胞3D具有良好的冻存效果。

实施例4微流控/未微流控的间充质干细胞3D球玻璃化冻存与复苏后活性与增殖能力检测对比

在光镜下分别观察玻璃化冻存与复苏后的微流控/未微流控的间充质干细胞3D球。由图6可知，未微流控3D球在玻璃化冻存与复苏后的外表细胞破碎，冻存过程中受到的损伤严重，3D球松散，死亡细胞较多；微流控3D球在玻璃化冻存与复苏后的外表完整，表面光滑，3D球紧实，冻存过程中受到的损伤较轻，死亡细胞较少。用Clacein/PI细胞活性与细胞毒性检测试剂盒检测玻璃化冻存和复苏后的间充质干细胞3D球的细胞活性。由图7可知，微流控3D球玻璃化冻存和复苏后的细胞存活率比未微流控3D球的更高。用增殖基因Ki-67的表达量体现间充质干细胞3D球的增殖能力。由图8可知，微流控3D球玻璃化冻存和复苏后的细胞增殖率比未微流控3D球的更高。由此可知，本发明对于间充质干细胞3D具有良好的保护作用，微流控可以有效地减少冻存中的冰结晶和操作产生的物理损伤。

实施例5冻存液细胞毒性检测

检测冻存液中不同比例的DMSO和乙二醇对细胞毒性和存活率的影响，由图9和图10可知，间充质干细胞3D球能承受的冻存液配比为DMSO+乙二醇(EG)，且最高总浓度为40％(20％DMSO+20％EG)，更高浓度和其配比的冻存液对细胞有较强的细胞毒性。40％及更低浓度的冻存液孵育后的细胞存活率可达到96％以上，细胞毒性较小。

实施例6配置微流控两相实验条件的筛选

使用不同接枝率的GelMA进行不同浓度水相溶液的配置。设置90％，60％，30％三组不同氨基取代度的GelMA材料，及滴加不同量的甲基丙烯酸酐到等量的明胶溶液中进行合成，检测氨基取代度。用DMEM培养基稀释GelMA材料为配比10g/ml、5g/ml、1g/ml的浓度，如表1，流速相同。油相都使用矿物油，流速也相同。观察不同搭配下材料的固化情况，结果显示氨基取代度为90％，配比浓度10g/ml的GelMA可以正常固化，并且可以通过微流控技术形成球体。

表1氨基取代度和GelMA浓度对细胞3D球固化的影响

上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。