一种矮马精液冷冻保存的方法

技术领域

本发明属于动物精液冷冻保存技术领域，具体是一种矮马精液冷冻保存的方法。

背景技术

矮马因其小巧玲珑、天资聪颖、性情温顺而深受人们的喜爱，具有很好的观赏、娱乐和实验价值。

由于矮马数量稀少，通过矮马自然繁殖的效率低下，而冷冻精液人工授精技术是家畜育种的重要方式，不仅可消除地理障碍，扩大种公马配种范围，还可解决精液保存时间的束缚，为提高矮马种群数量提供很好的解决方案。

在矮马精液冷冻保存过程中，抗冻剂是稀释液中不可或缺的物质之一，不但可防止精子遭受冷冲击，还可减少冷冻损伤；其中，甘油是常用的抗冻剂之一，因甘油渗透细胞膜的速度慢会造成精子蛋白质变形，对精子具有一定的毒性；因此现有技术中，采用酰胺类抗冻剂替代甘油减少对精子的渗透损伤，但是矮马精液中存在的活性氧化物会导致精子提前获能而使得精子活力降低，从而降低解冻后精子的受精能力。

发明内容

本发明的目的是提供一种矮马精液冷冻保存的方法，能减少精子冷冻损伤，并提高精子的抗氧化能力，提高精子的活力。

为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：

一种矮马精液冷冻保存的方法，包括以下步骤：步骤一、按质量比选取原材料并预处理，原材料包括糖类5.000g-6.012g、谷氨酰胺0.030g-0.042g、甘油4.2ml-5.6ml、精氨酸0.012g-0.032g、青霉素10～20万IU、庆大霉素10～20万IU、新鲜卵黄液4-10ml和新鲜马奶50-100ml；

先将新鲜马奶过滤杂质后，再将新鲜马奶进行加热，并室温冷却，经离心后取含酪蛋白的中层奶备用，将中层奶冷却至3-5度进行保存；

再将卵黄液离心后，取上层卵黄备用；

步骤二、制备冷冻保存稀释液，将精氨酸、部分的中层奶、部分的上层卵黄放入无菌培养皿中混匀，得到备用液；

再将剩余的中层奶、剩余的上层卵黄、糖类、谷氨酰胺、青霉素和庆大霉素放入无菌培养皿中，并加入纯净水溶解，定容至100ml，再将甘油加入并混匀搅拌，得到稀释液；

步骤三、新鲜矮马精液预处理，采集新鲜矮马精液后，使用预热后的采集杯对新鲜矮马精液进行收集，同时过滤并去除新鲜矮马精液的胶状物质，再经离心后去除上层精清，得到精液；

再按1:1的比例将备用液与精液混合后，将采集杯的精液转移至无菌容器中，并放入水浴保温15-20度，持续时间为5-10分钟；

步骤四、冷冻精液的分装保存，将无菌容器中的精液分装至试管中，并将稀释液沿管壁加入试管中，使精液与稀释液进行混匀，并将试管水浴保温1-5度，持续时间为40-50分钟，再将试管放置在液氨中进行保存。

采用上述方案后实现了以下有益效果：由于在精液低温保存过程中，精子质膜组成的特殊性，使得精子对低温的耐受能力差，易发生冷休克，精子处于氧化应激状态，会产生大量的活性氧，对精子造成损伤，导致其脂质过氧化、DNA损伤、精子膜透性失效、蛋白质磷酸化等，进而影响精子功能，导致精子的损伤。

通过新鲜马奶为基础的稀释液解决精子保存效果不稳定和稀释液批次间差异性的问题，添加糖类为精子提供能量，添加新鲜卵黄液、谷氨酰胺和甘油减少精子的冷冻损伤，添加精氨酸能减轻细胞氧化应激的程度，从而提高精子的活力。

并加入精氨酸能减轻细胞氧化应激的程度，达到抗氧化的目的，对新鲜矮马精液的预处理过程进行保护，由于精氨酸既是谷氨酸、脯氨酸、聚胺(如腐胺、精胺)等的中间体，又是一氧化氮、胍基丁酸的前体物质，其中，一氧化氮能与过量的活性氧化物(精子代谢自我产生)反应而减轻细胞氧化应激的程度，达到抗氧化的目的；

再通过谷氨酰胺和甘油的协同作用，能减低精子的渗透损伤，能更快地穿透精子膜，对精子的毒性也较小，同时在细胞外与卵黄液对精子进行保护，以减少精子细胞的水分流失和结晶形成。

同时，由于外源添加的精氨酸不能转化为谷氨酰胺,外源添加的谷氨酰胺可以转化为精氨酸并部分替代精氨酸发挥作用，因此在精液冷冻保存中，通过谷氨酰胺转化为精氨酸，以提高稀释液中的精氨酸浓度以抑制精子冷冻过程中的过早获能，改善精子活力和DNA完整性，以提高精子的抗氧化能力，从而减少精子冷冻损伤，进而提高冷冻保存精子的活力。

进一步，所述糖类为果糖、葡萄糖、海藻糖、棉子糖和乳糖中的一种或多种。

有益效果：不同种类的糖类使用不仅能为精子提供能量，同时能保护精子的精子细胞的形态结构，减少精子的损伤。

例如，棉子糖具有清除活性氧的作用，在冷冻保存稀释液中添加棉子糖可有效降低精子细胞遭受的氧化损伤。海藻糖具有稳定细胞膜和蛋白质结构的作用；单独添加棉子糖组冻融后精子的质膜完整性和线粒体膜电位明显高于其他组，但是精子活力较低；乳糖+葡萄糖+海藻糖组的精子质膜完整性明显高于其他各组。

进一步，新鲜马奶的加热温度为92-95度，加热时间为10分钟。

有益效果：因新鲜马奶中含有对精子有害的乳羟素，新鲜马奶经加热后，乳球蛋白释放出的硫氢基能抑制乳羟素的毒性作用，减少对精子的损伤。

进一步，采精杯的预热温度为36-38度，并室温冷却2-5分钟。

有益效果：通过预热采精杯使采精杯与矮马体内温度接近，减少刚取出的精子与外界的温度差，从而减少直接温度变化对精子的冷刺激。

进一步，在步骤四中，试管中精液与稀释液的比例为1:3。

有益效果：精液与稀释液的比例为1:3能保障精子与稀释液充分接触，使精子能受到稀释液的充分保护。

进一步，在无菌容器或试管水浴降温过程中，还会间隔3分钟对无菌容器或试管进行轻轻摇晃。

有益效果：轻轻摇晃能避免精子因重量沉淀至底部而不受备用液或稀释液的保护，从而造成精子死亡。

进一步，原材料的质量比为果糖2.000g、葡萄糖0.950g、海藻糖0.045g、棉子糖0.062g、乳糖2.050g、谷氨酰胺0.038g、甘油4.2ml、精氨酸0.015g、青霉素10万IU、庆大霉素10万IU、新鲜卵黄液5ml和新鲜马奶100ml。

有益效果：该质量比的原材料能为精子保存过程中的精子代谢提供能量，同时能减少的精子的冷冻损伤，提高精子的抗氧化能力，从而提高精子的活力。

进一步，所述试管为1ml试管。

有益效果：1ml试管为常见的尺寸试管，在精液冷冻保存过程中便于进行转移和安放。

附图说明

图1为本发明实施例矮马精液冷冻保存的方法的流程示意图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式进一步详细说明：

实施例1

实施例基本如附图1所示：一种矮马精液冷冻保存的方法，包括以下步骤：步骤一、按质量比选取原材料并预处理，原材料的质量比为果糖2.000g、葡萄糖0.950g、海藻糖0.045g、棉子糖0.062g、乳糖2.050g、谷氨酰胺0.038g、甘油4.2ml、精氨酸0.015g、青霉素10万IU、庆大霉素10万IU、新鲜卵黄液5ml和新鲜马奶100ml。

先将新鲜马奶过滤杂质后，再将新鲜马奶进行加热，新鲜马奶的加热温度为92-95度，加热时间为10分钟；并室温冷却，经离心后取含酪蛋白的中层奶备用，将中层奶冷却至3-5度进行保存；再将卵黄液离心后，取上层卵黄备用。

例如，精子冷冻保存的理论为，当精液温度下降到4℃或更低时，精子代谢活动水平降低，营养物质消耗减少，有利于延长精子的生命周期，达到长期保存的效果。

由于在精液低温保存过程中，精子质膜组成的特殊性，使得精子对低温的耐受能力差，易发生冷休克，精子处于氧化应激状态，会产生大量的活性氧，对精子造成损伤，导致其脂质过氧化、DNA损伤、精子膜透性失效、蛋白质磷酸化等，进而影响精子功能，导致精子的损伤，因此需要对精子的各个方面进行保护。

由于精子的精清蛋白可以诱导胆固醇和磷脂从精子质膜中流失，容易导致精子提前获能,而且胆固醇磷脂比例的降低使得质膜在低温时更容易发生液-固相的转变，进而更易遭受损伤；新鲜马奶的酪蛋白能特异性地结合精清蛋白，降低精清蛋白对精子的有害作用，从而解决精子保存效果不稳定和稀释液批次间差异性的问题。

步骤二、制备冷冻保存稀释液，将精氨酸、部分的中层奶、部分的上层卵黄放入无菌培养皿中混匀，得到备用液；再将剩余的中层奶、剩余的上层卵黄、糖类、谷氨酰胺、青霉素和庆大霉素放入无菌培养皿中，并加入纯净水溶解，定容至100ml，再将甘油加入并混匀搅拌，得到稀释液。

步骤三、新鲜矮马精液预处理，采集新鲜矮马精液后，使用预热后的采集杯对新鲜矮马精液进行收集，采精杯的预热温度为36-38度，并室温冷却2-5分钟；同时过滤并去除新鲜矮马精液的胶状物质，再经离心后去除上层精清，得到精液；再按1:1的比例将备用液与精液混合后，将采集杯的精液转移至无菌容器中，并放入水浴保温15-20度，持续时间为5-10分钟，按3分钟的间隔时间对无菌容器进行轻轻摇晃。

例如，在新鲜矮马精液预处理过程中，加入精氨酸能减轻细胞氧化应激的程度，达到抗氧化的目的，对新鲜矮马精液的预处理过程进行保护，由于精氨酸既是谷氨酸、脯氨酸、聚胺(如腐胺、精胺)等的中间体，又是一氧化氮、胍基丁酸的前体物质，其中，一氧化氮能与过量的活性氧化物(精子代谢自我产生)反应而减轻细胞氧化应激的程度，达到抗氧化的目的。

例如，糖尿病大鼠存在肝、心肌、膈肌的线粒体内自由基生成增多情况，补充精氨酸可通过提高肝、心肌、隔肌细胞线粒体中自由基清除酶的活性来加速自由基的清除，从而提高机体抗氧化能力，保护机体功能免受氧化损伤。由于精氨酸是一氧化氮合酶的底物，体内精氨酸质量浓度的增加能使其产物一氧化氮的生成量增加，同时增加一氧化氮双重作用中的生理作用，因而对机体产生保护，使机体免受氧化损伤的侵害，因此一氧化氮能与过量的活性氧化物(精子代谢自我产生)反应而减轻细胞氧化应激的程度，达到抗氧化的目的。

步骤四、冷冻精液的分装保存，将无菌容器中的精液分装至1ml的试管中，并将稀释液沿管壁加入试管中，使精液与稀释液进行混匀，使试管中精液与稀释液的比例为1:3；并将试管水浴保温1-5度，持续时间为40-50分钟，按3分钟的间隔时间对无试管进行轻轻摇晃；再将试管放置在液氨中进行保存。

例如，通过谷氨酰胺和甘油的协同作用，能减低精子的渗透损伤，能更快地穿透精子膜，对精子的毒性也较小，同时在细胞外与卵黄液对精子进行保护，以减少精子细胞的水分流失和结晶形成。

同时，由于外源添加的精氨酸不能转化为谷氨酰胺,外源添加的谷氨酰胺可以转化为精氨酸并部分替代精氨酸发挥作用，因此在精液冷冻保存中，通过谷氨酰胺转化为精氨酸，以提高稀释液中的精氨酸浓度以抑制精子冷冻过程中的过早获能，改善精子活力和DNA完整性，以提高精子的抗氧化能力，从而减少精子冷冻损伤，进而提高冷冻保存精子的活力。

以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构和/或特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。