一种检测游离核酸微卫星不稳定性的方法及装置

技术领域

本发明涉及微卫星位点检测技术领域，具体涉及一种检测游离核酸微卫星不稳定性的方法及装置。

背景技术

结直肠癌（Colorectal Cancer, CRC）是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国各类恶性肿瘤发病率中高居第三位，占恶性肿瘤死亡率的第五位。它的发生是多基因、多方面因素参与的复杂过程，其中错配修复功能缺陷引起的微卫星不稳定性（microsatelliteinstability MSI）是发生的一个重要机制。大部分的遗传性非息肉病性结直肠癌（Hereditary Nonpolyposis Coloretal Cancer, HNPCC，又称lynch综合征）和15%散发性结直肠癌是由微卫星不稳定性引起的。

微卫星不稳定（MSI）是指DNA错配修复（MMR）出现异常时，微卫星出现的复制错误得不到纠正并不断累计，使得微卫星序列长度或碱基组成发生改变的现象。MSI根据程度可以被分成3类：微卫星高度不稳定（MSI-H）、微卫星低度不稳定（MSI-L）、微卫星稳定（MSS）。

目前越来越多的证据显示，无论家族史和发病年龄，对于CRC患者进行lynch筛查有助于发现更多的lynch综合征患者，而MSI/MMR检测是筛查的重要手段；而且对于Ⅱ期CRC患者预后、高危Ⅱ期辅助治疗的选择，以及Ⅳ期免疫治疗均有明确的指导作用。美国NCCN指南及美国胃肠病协会均建议对所有CRC患者无论年龄及分期，都应该进行MSI/MMR检测。

目前MSI的检测方法主要有三种，包括免疫组化（IHC）、聚合酶链式反应（PCR）和二代测序（NGS）。免疫组化（IHC）是目前最常用的检测方式，通过使用相应抗体检测四种常见错配修复基因（MLH1、MSH2、MSH6和PMS2）在细胞核内表达的情况，明确是否存在错配修复缺陷。存在1种或以上蛋白表达阴性即为dMMR，相当于MSI-H；否则为错配修复蛋白完整（pMMR），相当于MSI-L/MSS。但免疫组化检测本身存在主观性，且受检测抗体质量、检测过程（固定、染色）等因素影响，导致各中心的检测准确率高低不一。PCR方法是MSI检测的金标准，该方法使用荧光标记引物和毛细管电泳确定Promega panel中5个位点NR-21、NR-24、BAT-25、BAT-26和MONO-27的片段长度多态性。肿瘤样本和对照样本对比，5个微卫星位点均未出现PCR扩增片段大小改变，微卫星稳定性（MSS）；5个MSI检测位点中1个MSI位点出现PCR扩增片段大小的改变，微卫星低度不稳定性（MSI-L）；5个MSI检测位点中2个或者2个以上的MSI位点均出现PCR扩增片段大小的改变，微卫星高度不稳定性（MSI-H）。

近来，基于二代测序的组织MSI检测方法已经证明与PCR-MSI有极高的一致率，可以在判断MSI状态的同时刻画基因组图谱，提供癌症诊断更丰富的信息。然而，目前的MSI检测几乎都局限于组织，对于无法取到组织的部分晚期肿瘤患者，建立血浆MSI（bMSI）检测方法极具临床价值。因此，本领域急需基于血浆的MSI检测方法，尤其是用于癌症，优选结直肠癌、胃癌或子宫内膜癌的无创诊断，预后评估，治疗方案的选择或遗传筛查中肿瘤血检MSI的方法。

发明内容

为了克服上述技术缺陷的不足，本发明提供了一种检测游离核酸微卫星不稳定性的方法及装置，解决了无法获取组织的情况下难以检测微卫星不稳定的问题。

一种检测游离核酸微卫星不稳定性装置，关键在于：包括用于对血浆样本的游离核酸微卫星不稳定状态进行信息分析的MSI位点判别模型，所述MSI位点判别模型包括MSI训练集数据准备单元，用于筛选样本中频率低于10%的位点作为模型构建的位点；位点模型的构建单元，用于筛选样本中判别微卫星不稳定性状态的高灵敏度位点；样本MSI状态分析单元，用于根据MSI score来判别样本的MSI状态。

优选的，所述MSI训练集数据准备单元的工作过程为：准备具有PCR-MSI标签配对的全外显子测序样本；扫描指定版本的人类参考基因组，获取基因组序列上全部微卫星位点的位置及左右侧翼序列，根据这些位点序列统计全外显子测序样本中微卫星位点，过滤在测序样本中频率低于10%的位点作为模型构建的位点。

优选的，所述MSI位点模型构建单元的工作过程为：以微卫星位点重复单位的长度划分100个k-mer，统计S1样本中每个重复单元在1-100个k-mer上的reads支持数作为特征值，采用机器学习方法进行训练，得到113个用于判别微卫星不稳定性状态的高灵敏度位点。

优选的，所述样本MSI状态分析单元的工作过程为：统计样本检测出的全部微卫星位点数目和被模型判定为微卫星不稳定位点的数目并计算比例，该比例作为样本的MSIscore；对具有PCR-MSI样本进行MSI判别，分别采用不同的MSIscore阈值来区分微卫星不稳定样本和MSS样本，计算不同阈值下的AUC，根据最大AUC对应的阈值将样本MSI状态区分为MSI-H，MSI-L和MSS。

优选的，所述高灵敏度位点信息如下表1：

表1

一种检测游离核酸微卫星不稳定性的方法，关键在于包括以下步骤：

步骤一、提取血浆样本的cfDNA，对cfDNA进行末端修复并在3'端添加A碱基、接头连接、PCR扩增；

步骤二、带有生物素的特异性探针对cfDNA样本进行探针捕获，构建目标区域靶向捕获测序文库；

步骤三、对测序文库进行上机测序，获得测序数据；

步骤四、利用全外显子测序样本构建MSI训练集数据得到模型构建的MSI位点，之后采用机器学习构建MSI位点判别模型，根据MSI位点判别模型统计样本靶向测序数据的MSIscore值，进行微卫星不稳定性判断。

优选的，所述步骤二中所述探针为具有特异性的小片段DNA序列的特异性探针。

优选的，所述步骤三具体为采用二代测序仪为Illumina测序仪进行测序，所述的测序方式为双端测序；测序数据为双端测序数据。

优选的，所述步骤四中MSI位点判别模型对样本的微卫星位点进行判别，获得微卫星不稳定位点数目与微卫星位点数目的百分比，即为MSIscore值，根据MSIscore值将样本的MSI状态区分为MSI-H、MSI-L和MSS。

优选的，所述MSI-H判定标准为MSIscore大于20%；MSI-L判定标准为MSIscore大于等于10%且小于等于20%，MSS判定标准为MSIscore小于10%。

有益效果：本发明所提供的一种检测游离核酸微卫星不稳定性的方法及装置，相比传统的PCR检测游离核酸微卫星不稳定性方法，具有高通量、高灵敏度、高效率及操作简便等优势；相比其他基于二代测序技术的微卫星不稳定检测，还具有以下优点：

（1）本发明的检测方法和装置能检测患者cfDNA中微卫星序列情况，样品来自患者外周血，取样简单方便，能全面的检测患者整体肿瘤的微卫星不稳定性，能做到实时监控。

（2）本发明的检测方法和装置不需要对照样本，节省了对照样本的实验、测序及分析的步骤，从而降低了成本及分析的复杂度。

（3）本发明的检测方法和装置不仅能检测微卫星序列的插入和缺失突变，还能检测微卫星序列的单核苷酸突变，检测更全面和准确。

（4）本发明的检测方法和装置通过特异性探针的捕获和高深度测序提高了对位点的捕获效率，使检测灵敏度高和特异性强。

（5）运行时间短，消耗资源少，单样本运行速度比双样本快约10倍。

附图说明

图1为本发明检测结果与PCR检测结果一致性比较图。

具体实施方式

为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。

实施例 一种检测游离核酸微卫星不稳定性的方法

（1）血浆cfDNA样本的提取与测序：采用血浆提取试剂盒提取血浆样本中的cfDNA，血浆样本来自于肿瘤患者的外周血，具体的操作参见QIAGEN公司的QIAamp CirculatingNuleacid Kit试剂盒说明书，使用Qubit4.0和dsDNA HS Assay Kit对提取的cfDNA进行定量。

（2）文库构建：末端修复并在3'末端加A尾；取10-50ng cfDNA至PCR管中，用Low TE补至50 μL，按照下表2加入试剂。

表2

涡旋混匀，微离心，设置以下表3设置程序在PCR仪上进行反应。

表3

（3）接头连接：按照下表4在上述反应结束后的体系内加入相应试剂。

表4

涡旋混匀，微离心，设置以下表5设置程序在PCR仪上进行反应（热盖关闭）。

表5

（4）连接后纯化：Beckman Agencourt AMPure XP磁珠2~8℃保存，室温平衡至少30min，使用1x体积，80 μL/每样本。现用现配的80%乙醇，此步骤纯化需要400μL/每样本；在每个样本中加80 μL（1 x体积）AMPure XP 磁珠，用移液器吹打或者振荡充分混匀。室温静置5分钟；放置磁力架静置2分钟。待磁珠全部吸附至侧壁，使用移液器吸取移弃上清，注意勿扰动磁珠；在磁力架上沿磁珠相反方向的管壁缓慢加入200 μL 80%乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30s-1min，使用移液器吸取移弃上清；重复上步骤一次，用10 μL的移液器将残留的乙醇尽量吸弃干净，注意勿碰到磁珠；室温干燥磁珠5分钟或放置于干式加热器37℃随时观看干燥状态。此步骤时间根据磁珠状态减少或者增加，达到磁珠状态为表面不反光，不能过度干燥为宜；每个样本用21 μL low TE 缓冲液重悬磁珠，如果进行磁珠分选，则加入51 μL lowTE 缓冲液重悬磁珠，将样本管远离磁力架；用移液器吹打或者振荡充分混匀，室温孵育 1分钟；放置磁力架上，室温孵育2分钟；待磁珠完全吸附至侧壁，将20 μL上清液移到一个新的PCR管中等待扩增。

（5）文库扩增：按照下表6在上述反应结束后的体系内加入相应试剂。

表6

涡旋混匀，微离心，设置以下表7设定程序在PCR仪上进行反应。

表7

反应结束后，按照磁珠纯化的流程使用1X体积磁珠纯化PCR产物，之后用dsDNA HSAssay Kit测定预文库浓度，利用QIAxcel进行片段大小检测。

（6）文库杂交捕获：取总量500ng预文库于离心管中，按下表8加入封闭试剂。

表8

打开离心管的管盖，放入真空离心浓缩仪蒸干（65℃，约10~60min），然后加入杂交试剂，室温孵育10min，充分震荡混匀后放置在热循环仪上。杂交反应体系如表9所示，杂交反应条件如表10所示。

表9

表10

等步骤1结束后，65℃条件下暂停，1min内在PCR仪上加入4μL捕获探针，使用移液器混匀后，计时4h。

（7）目标区域捕获：使用链霉亲和素磁珠对探针结合的样品进行捕获，步骤如下：将1mg磁珠加入1.5mL离心管，至于磁力架上，弃上清，用200μL1×磁珠清洗试剂清洗两遍后，使用100μL1×磁珠清洗试剂重悬磁珠，转移到0.2mL PCR管内，等65℃反应4h结束后，将其置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，然后将磁珠置于65℃热循环仪上，在1min内将杂交反应液转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR管中，迅速震荡混匀，放回65℃热循环仪，计时45min，每隔8min震荡混匀一次，保持磁珠处于悬浮状态。

（8）洗脱非杂交片段：65℃清洗：先使用预热到65℃的1×清洗液1清洗一遍，再使用预热到65℃的增强清洗液清洗两遍；一次使用1×清洗液、1×清洗液2和1×清洗液3各清洗一遍。最后置于磁力架上，弃上清，加入22.5μL无核酶水重悬磁珠。

（9）捕获后产物扩增：将磁珠捕获到的DNA片段进行PCR扩增，将得到的PCR扩增产物进行磁珠纯化，使用dsDNA HS Assay Kit检测度，利用Agilent 2100进行片段大小检测，扩增体系见表12，扩增条件见表13。

表12

表13

（10）基于二代测序数据的微卫星位点的检测：在高通量测序仪（Illumina）上完成测序，测序实验操作按照生产商提供地操作说明书进行。测序深度15000×。测序平台将得到的光信号转化为BCL格式的测序下机数据；对下机数据进行拆分，根据样本index将单个样本的测序数据拆分出来，转换成fastq格式。将这些数据比对到人类基因组序列(hg19)上；形成bam格式的文件；为获得高质量的碱基序列，对比对后的数据进行质控，使用Samtools过滤功能对BAM文件进行过滤：去掉未必对上参考基因组、次要比对和补充比对的Reads。然后对Indel附近区域进行重比对，校正由于插入缺失引起的比对结果错误。 质控指标结果如下表14所示：

表14

（11）检测样本微卫星位点：采用MSIsensor2对样本的bam数据扫描模型中所有的微卫星位点和侧翼序列信息，统计样本中所有的微卫星位点。针对指定位点，对每个重复单元模拟重复的次数划分100个k-mers, 统计每个k-mers上reads支持数作为测试样本的特征值，采用构建好的位点模型对该样本的微卫星位点进行判别，模型计算获得的判断为该样本上微卫星不稳定位点数目与样本中扫描到的微卫星位点数目的百分比，即为MSI分数（MSIscore）阈值；计算不同阈值下的AUC，取最大AUC对应的阈值作为区分样本MSI状态的cutoff值，根据cutoff值判断样本的MSI状态，分为MSI-H、MSI-L和MSS。

对50名结直肠癌患者的血液样本同时采用本发明和PCR检测系统进行进行微卫星不稳定性对比分析，样本信息、样本质控表格和测试结果如下表15所示。

表15

表15中可以看到，根据PCR-MSI的结果，其中16个患者的样本结果为MSI-H，13个患者的样本结果为MSI-L，21个患者的样本结果为MSS；根据NGS-MSI的结果，50例样本中有19例为MSI-H，有10例为MSI-L，有21例为MSS。表明本装置的NGS检测方法的灵敏性要高于PCR检测方法。

将对本装置检测结果与PCR检测结果一致性进行比较作图（图1），横坐标为MSI状态，纵坐标为本装置检测出的MSIscore。Both表示本装置检测结果与PCR检测结果MSI状态一致，NGS_only表示本装置检测状态与PCR检测状态不一致，只有本装置检测到该状态，本装置检测灵敏度为100%（47/47），特异性为94%（47/50），表明NGS检测方法的灵敏性要高于PCR检测方法。

最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。