一种影响母猪繁殖性能的分子标记、检测方法及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种影响母猪繁殖性能的分子标记、检测方法及其应用。

背景技术

伴随着“新冠”与“非瘟”双疫情的发生，猪活体运输面临极大的风险，在猪场从外部引种困难的条件下，提高自身猪场母猪繁殖性能成为当前迫切需要解决的关键问题。松辽黑猪是以杜洛克猪、长白猪、民猪为亲本培育而成的中国北方第一个瘦肉型母系新品种，自育成以来为猪育种提供了优质种源，缓解了高端市场缺少优质黑母猪的问题。虽然松辽黑猪综合了各亲本的优点，但与其母本民猪比较，繁殖性能仍有选育提高的空间。众所周知，繁殖性状属于低遗传力性状，采用常规育种手段其遗传进展十分缓慢，如果与标记辅助选择相结合，便可以提高动物繁殖性状的改良速率。

猪的甲基转移酶23(methyltransferase-like 23，METTL23)基因位于 12号染色体上，含有5个外显子，编码190个氨基酸。哺乳动物体内有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ共3种类型的精氨酸甲基转移酶(arginine methyltransferases,PRMTs)， METTL23属于Ⅰ型PRMTs，能够催化组蛋白H3R47的不对称二甲基化，参与调控RNA代谢、细胞增殖以及信号转导等生物学过程，在动物的生长、发育等过程起着非常重要的作用。

发明内容

本发明的目的在于克服母猪育种过程常规育种手段遗传进展十分缓慢的缺陷，提供一种种猪繁殖性状相关的METTL23基因分子标记选择方法，用于母猪分子育种，可以提高种猪总产仔数、产活仔数、断奶仔猪数，加快种猪新品种培育进程。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种影响种猪繁殖性能的分子标记，所述分子标记位于种猪METTL23 基因外显子4第62个位点，且具有A/G多态性，GG型个体具有提高总产仔数、产活仔数、断奶仔猪数的性能。

本发明所述的分子标记在种猪育种中的应用。

一种用于检测本发明所述的分子标记引物对，上游引物F4如序列SEQ ID NO:1(CTGGAAATCTGTCAGCGTA)所示，下游引物R4如序列SEQ IDNO：2(TTTGTTGAGGTCGTGGGTA)所示。

本发明所述的引物对在种猪育种中的应用。

一种检测本发明所述的分子标记的方法，包含PCR扩增种猪基因组中含有权利要求1所述的分子标记的一段序列，对扩增产物进行测序，判读 METTL23基因外显子4第62位点A/G的多态性。

一种早期筛选种猪品系的方法，包括检测种猪METTL23基因62位点的多态性，选择GG型个体留种。

本发明早期筛选种猪品系的方法，包括以下步骤：

1)提取种猪基因组DNA；

2)利用检测权利要求1所述的分子标记的引物对PCR扩增METTL23 基因序列，得到898bp扩增产物；所述的引物对,其上游引物F4如序列SEQ ID NO:1所示，下游引物R4如序列SEQ ID NO：2所示；

3)对扩增METTL23基因序列进行测序；

4)选择GG型个体留种。

其中，PCR反应体系20μL：DNA 1μL，上、下引物各0.5μL，2 ×Taq MasterMix 10μL，ddH2O 8μL。PCR反应程序：95℃预变性3min； 95℃变性30s，退火(退火温度56℃)30s，72℃延伸(延伸时间27s)，共34个循环；72℃延伸5min；4℃保存。

其中，测序采用Sanger法测序。

有益效果

种猪的繁殖性能是评价种猪的重要指标，具有极高的经济价值，传统的表型选择准确性低，其表型选择需要在种猪繁育后才能统计出来，周期很长，无法在早期进行选择，遗传进展缓慢。本发明采用PCR-Sanger法检测METTL23基因外显子4第62位点A/G多态性，将基因型与种猪繁育性能进行关联分析，发现METTL23基因外显子4第62位点GG型种猪总产仔数、产活仔数、断奶仔猪数均有提高。该多肽位点可以用于种猪的辅助选择，提高选择的优良性，同时可以在种猪出生时就通过检测基因型进行选择，加快育种进程，降低生产成本。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1METTL23基因外显子4PCR产物电泳检测结果图；

M，DL2000 DNA Marker；1～6，METTL23-4引物PCR扩增产物

图2松辽黑猪METTL23基因外显子4序列比对结果图；

图3松辽黑猪METTL23基因外显子4不同基因型测序图；

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

实施例1

种猪METTL23基因外显子4第62位点A/G分子标记选择方法。

材料与方法：

1.1样品采集

松辽黑猪由公主岭国家农业科技园区飞马斯牧业有限公司提供，随机选取178头2～4产健康松辽黑猪母猪。用耳钳夹采集耳组织，放入含75％乙醇的1.5mL离心管中，标记好耳号和日期带回实验室，将耳组织样放― 20℃冰箱保存备用。同时收集所选母猪相关繁殖数据(总产仔数、产活仔数、断奶仔猪数、初生重、3周龄重、断奶重、乳头数)。

1.2主要试剂及仪

基因组DNA提取试剂盒购自Axygeno公司；2×Taq MasterMix购自北京康为世纪生物科技有限公司；无水乙醇及双蒸水均购自长春鼎国生物技术责任有限公司。耳钳夹购自法国安乐福集团公司；超微量分光光度计 Quawell(Q5000)购自北京鼎盛生物技术有限责任公司；普通PCR仪(T100) 购自上海伯乐生命医学产品有限公司；电泳仪DYY-6C和凝胶成像分析仪 WD-9413A均购自北京市六一仪器厂。

1.3方法

1.3.1基因组DNA提取 根据基因组DNA提取试剂盒说明书提取松辽黑猪耳组织基因组DNA，并用超微量分光光度计检测DNA的浓度及纯度，挑选合格样品于―20℃保存备用。

1.3.2引物设计及合成 根据猪METTL23基因DNA序列 (GenBank登录号：NC_010454.4)，用Primer Premier 5.0软件对METTL23 基因的5个外显子进行引物设计，引物序列见表1。引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。

表1：引物序列表

1.3.3PCR扩增及测序

从178份样本中随机选择50份样品分为5组，每组10份样本进行混池，对METTL23基因5个外显子进行PCR扩增。PCR反应体系20μL：DNA 1μL，上、下引物各0.5μL，2×TaqMasterMix 10μL，ddH2O 8μ L。PCR反应程序：95℃预变性3min；95℃变性30s，退火(退火温度见表1)30s，72℃延伸(延伸时间见表1)，共34个循环；72℃延伸5min； 4℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后送至苏州金唯智生物科技有限公司进行测序。

1.3.4松辽黑猪METTL23基因多态性检测

使用DNAMAN对测序结果进行核苷酸序列比对，对于突变位点处使用Chromas软件分析波峰图。根据测序结果，对序列比对有突变位点的外显子进行PCR扩增，扩增体系及程序同1.5，并对PCR产物进行测序。

基因型频率和基因频率松辽黑猪METTL23基因4外显子4的 A62G位点的基因型频率、基因频率计算结果及卡方适合性检验结果如表2 所示。A62G位点的GG基因型个体最多，为优势基因型，G为优势等位基因。卡方适合性检验结果表明，松辽黑猪METTL23基因外显子4的A62G 位点处于Hardy-Weinberg平衡状态(P＞0.05)。

表2松辽黑猪METTL23基因外显子4的基因型频率和基因频率

1.3.5METTL23基因多态性与繁殖性能的关联性分析

统计178份样本对应的繁殖性能，包括总产仔数、产活仔数、断奶仔猪数、初生重、3周龄重、断奶重和乳头数，比较不同基因型个体繁殖性能的差异。统计结果如表3所示：

表3松辽黑猪METTL23基因外显子不同基因型与繁殖性状的相关性

由上表可知，METTL23基因外显子4的A62G位点，GG基因型个体总产仔数、产活仔数和断奶仔猪数均显著或极显著高于AA基因型个体(P ＜0.05；P＜0.01)，总产仔数还显著高于AG基因型个体(P＜0.05)；AG基因型个体断奶仔猪数显著高于AA基因型个体(P＜0.05)。其余性状在不同基因型之间无显著差异(P＞0.05)。

1.4统计学分析

利用Excel软件计算基因型频率、基因频率、遗传纯合度(Ho)、遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)。卡方适合性检验分析基因型是否处于Hardy-Weinberg平衡状态。利用SPSS 19.0软件分析 METTL23基因不同基因型与松辽黑猪繁殖性状的关联性，结果以平均值±标准差表示，以P＜0.05为差异显著性判断标准。

本发明在松辽黑猪群体中检测了METTL23基因外显子的多态性，其中在外显子4检测到A62G突变，该位点GG基因型频率最高，为优势基因型，等位基因G为优势等位基因。该突变位点在松辽黑猪群体中处于 Hardy-Weinberg平衡状态，PIC为0.2877，属于中度多态位点(0.25＜PIC＜ 0.5)，说明该遗传标记能够提供一定量的遗传信息。GG基因型个体的总产仔数、产活仔数、断奶仔猪数均最高,且显著或极显著高于AA基因型个体。各基因型仔猪初生重，3周龄重、断奶重均无显著差异。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。