一种3D打印仿生角膜缘移植物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及眼科医疗器材技术领域，尤其涉及一种3D打印仿生角膜缘移植物及其制备方法和用途。

背景技术

角膜缘是位于角膜和巩膜交界处，由角膜缘上皮干细胞(Limbal epithelialstem cell,LESC)和其所属的角膜缘微环境共同组成。角膜缘微环境包括角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管网等，结构复杂，是LESC干性维持、能够不断进行分裂和增殖的基础。角膜缘干细胞缺乏(Limbal stem cell deficiency,LSCD)是因LESC的数量或功能异常导致的角膜上皮的稳态失衡。据统计，全球的LSCD患者超千万，多种遗传性疾病、外伤和眼表慢性疾病均能够导致LSCD的发生。LSCD患者可表现为视力下降、流泪、眼痛，严重者因持续的角膜上皮不愈合最终导致角膜穿孔，严重影响患者的生活质量。此外，约三分之一的角膜移植失败与患者合并有LSCD有关。

发明内容

本发明的实施例提供了一种3D打印仿生角膜缘移植物及其制备方法和用途，用于解决现有技术中存在的问题。

为了实现上述目的，本发明采取了如下技术方案。

一种3D打印仿生角膜缘移植物，包括相互叠置的角膜缘上皮层和角膜缘微环境层；3D打印仿生角膜缘移植物通过分别基于LESC细胞，以及角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞配置的生物墨水，再经过3D打印制备获得。

优选地，3D打印仿生角膜缘移植物通过如下过程制备：

将培养的LESC细胞的悬液加入到3D打印基材溶液中，获得第一生物墨水；将培养的角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞的悬液加入到3D打印基材溶液中，获得第二生物墨水；

分别在第一生物墨水和第二生物墨水中加入光引发剂和光吸收剂；

将执行了上述第二个步骤之后第一生物墨水加入到墨盒中，通过3D打印设备进行3D打印作业，获得角膜缘上皮层原材；若墨盒中的第一生物墨水未用尽，则排出剩余的第一生物墨水；

将执行了上述第二个步骤之后第二生物墨水加入到执行了上述第三个步骤之后的墨盒中，通过3D打印设备进行3D打印作业，获得角膜缘微环境层原材，并获得3D打印仿生角膜缘移植物原材；

将3D打印仿生角膜缘移植物原材转移到配置的细胞培养基中进行培养，获得3D打印仿生角膜缘移植物。

优选地，3D打印仿生角膜缘移植物的整体为外径14mm，内径10mm的环形体结构，角膜缘上皮层的厚度为50-100μm，角膜缘微环境层的厚度为100-200μm。

第二方面，本发明提供一种3D打印仿生角膜缘移植物的制备方法，通过分别基于LESC细胞，以及角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞配置的生物墨水，再经过3D打印制备获得。

优选地，具体通过如下过程制备：

S1将培养的LESC细胞的悬液加入到3D打印基材溶液中，获得第一生物墨水；将培养的角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞的悬液加入到3D打印基材溶液中，获得第二生物墨水；

S2分别在第一生物墨水和第二生物墨水中加入光引发剂和光吸收剂；

S3将执行了步骤S2之后的第一生物墨水加入到墨盒中，通过3D打印设备进行3D打印作业，获得角膜缘上皮层原材；若墨盒中的第一生物墨水未用尽，则排出剩余的第一生物墨水；

S4将执行了步骤S2之后的第二生物墨水加入到执行了步骤S3之后的墨盒中，通过3D打印设备进行3D打印作业，获得角膜缘微环境层原材，并获得3D打印仿生角膜缘移植物原材；

S5将3D打印仿生角膜缘移植物原材转移到配置的细胞培养基中进行培养，获得3D打印仿生角膜缘移植物。

优选地，3D打印基材溶液为甲基丙烯酸功能化明胶溶液，光引发剂为苯基-(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-磷酸锂盐，光吸收剂为柠檬黄。

优选地，甲基丙烯酸功能化明胶溶液的浓度为5w/v％—20w/v％，LESC细胞的打印密度为2×10

步骤S4中的3D打印参数包括：蓝光打印光源的波长为405nm，光功率为10mW/cm

第三方面，本发明提供一种3D打印仿生角膜缘移植物的用途，包括：

对患者置入开睑器使得患者的角膜、角膜缘和巩膜的区域暴露；

沿角膜缘全周360°打开结膜囊并将打开的结膜囊后退；

标记需要去除的病变角膜缘和病变角膜的范围；

去除病变角膜缘；去除的深度为150-300μm；

去除病变角膜的上皮；

将上述的3D打印仿生角膜缘移植物调整至角膜缘上皮层在上方，角膜缘微环境层在下方的姿态，置入已去除病变角膜的上皮的区域；

使用羊膜覆盖置入了3D打印仿生角膜缘移植物的区域。

由上述本发明的实施例提供的技术方案可以看出，本发明提供的一种3D打印仿生角膜缘移植物及其制备方法和用途，其仿生角膜缘移植物包括相互叠置的角膜缘上皮层和角膜缘微环境层，并通过分别基于LESC细胞，以及角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞配置的生物墨水，再经过3D打印制备获得。本发明提供的3D打印仿生角膜缘移植物及其制备方法和用途通过将3D生物打印技术重建角膜缘的立体结构，并将其用于角膜缘移植，进而达到治疗角膜缘干细胞缺乏，促进角膜上皮愈合，减少角膜组织的瘢痕形成，提高视力的目的。具体具有如下优点：

将LESC、角膜缘微环境细胞进行体外扩增，使一次移植只需要少量的角膜缘组织进行培养，即可提供大量的LESC和微环境细胞；

可对培养的LESC和角膜缘微环境细胞进行保存，若一次移植治疗效果有限，可继续进行体外扩增，进行多次移植；

该移植物在给患者提供LESC的同时，还重建了角膜缘微环境细胞。角膜缘微环境细胞能够与LESC通过细胞接触直接沟通，还能够通过旁分泌方式释放促进上皮修复的生长因子，调节炎症反应、抑制瘢痕形成的抗炎因子等，进而维持LESC的干细胞特性、促进角膜上皮的修复、保持角膜的透明性。

本发明附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，这些将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明提供的一种3D打印仿生角膜缘移植物的整体示意图；

图2为本发明提供的一种3D打印仿生角膜缘移植物的成分示意图。

图中：

1.角膜缘上皮层11.角膜缘上皮干细胞2.角膜缘微环境层21.角膜缘基质干细胞22.黑色素细胞23.微血管内皮细胞。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施方式，所述实施方式的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施方式是示例性的，仅用于解释本发明，而不能解释为对本发明的限制。

本技术领域技术人员可以理解，除非特意声明，这里使用的单数形式“一”、“一个”、“所述”和“该”也可包括复数形式。应该进一步理解的是，本发明的说明书中使用的措辞“包括”是指存在所述特征、整数、步骤、操作、元件和/或组件，但是并不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。应该理解，当我们称元件被“连接”或“耦接”到另一元件时，它可以直接连接或耦接到其他元件，或者也可以存在中间元件。此外，这里使用的“连接”或“耦接”可以包括无线连接或耦接。这里使用的措辞“和/或”包括一个或更多个相关联的列出项的任一单元和全部组合。

本技术领域技术人员可以理解，除非另外定义，这里使用的所有术语(包括技术术语和科学术语)具有与本发明所属领域中的普通技术人员的一般理解相同的意义。还应该理解的是，诸如通用字典中定义的那些术语应该被理解为具有与现有技术的上下文中的意义一致的意义，并且除非像这里一样定义，不会用理想化或过于正式的含义来解释。

为便于对本发明实施例的理解，下面将结合附图以几个具体实施例为例做进一步的解释说明，且各个实施例并不构成对本发明实施例的限定。

本发明提供一种仿生角膜缘移植物，用于解决申请人在临床实践中发现的如下技术问题：

目前LSCD的主要治疗方式为传统自体/异体角膜缘移植和体外培养的LESC移植，但仍存在以下局限性：1)传统角膜缘移植手术需要从患者的对侧眼或捐献眼获得范围较大的角膜缘结构，可能造成对侧眼的医源性角膜缘干细胞缺乏，或因捐献者的数量有限而受到限制；2)体外培养的LESC移植只单纯移植了LESC，尚未重建LESC干性维持所需的角膜缘微环境，导致移植后LESC的分裂增殖能力下降，术后远期效果不佳。如何将少量的种子细胞经过体外扩增后，搭建LESC与其微环境细胞的3D立体结构，实现仿生角膜缘移植，是急需解决的问题。

3D生物打印作为一种新兴的增材制造技术，可以通过生物墨水(负载功能细胞、生长因子等活性成分)的逐层打印在体外构建具有复杂结构的组织工程替代物。水凝胶生物材料与细胞外基质各方面性能相似，具有与天然软组织相匹配的机械性能和优秀的生物相容性，可以支持内部负载细胞的黏附增殖、发挥功能性作用。因此，3D生物打印水凝胶支架在角膜再生领域受到广泛关注，研究者已经开发了负载不同功能细胞的上皮-基质双层仿生水凝胶支架，用于角膜中央区域的前板层移植手术。然而，目前尚未开发一种可用于角膜缘干细胞缺乏症治疗的3D打印仿生角膜缘移植物。

鉴于目前进行角膜缘移植所需材料的来源匮乏，以及目前角膜缘移植的手术方式未重建角膜缘微环境，导致远期疗效有限，本发明拟用3D打印技术构建仿生角膜缘结构、以获得能够长期维持角膜缘上皮干细胞干性目的的新型角膜缘移植物。

参见图1，本发明提供的一种3D打印仿生角膜缘移植物，包括相互叠置的角膜缘上皮层和角膜缘微环境层。本仿生角膜缘移植物通过分别基于LESC细胞，以及角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞配置的两型生物墨水，再经过3D打印制备获得。具体通过如下过程制备：

将培养的LESC细胞的悬液加入到3D打印基材溶液中，获得第一生物墨水；将培养的角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞的悬液加入到3D打印基材溶液中，获得第二生物墨水；

分别在第一生物墨水和第二生物墨水中加入光引发剂和光吸收剂；

将执行了上述第二个步骤之后第一生物墨水加入到墨盒中，通过3D打印设备进行3D打印作业，获得角膜缘上皮层原材；若墨盒中的第一生物墨水未用尽，则排出剩余的第一生物墨水；

将执行了上述第二个步骤之后第二生物墨水加入到执行了上述第三个步骤之后的墨盒中，通过3D打印设备进行3D打印作业，获得角膜缘微环境层原材，并获得3D打印仿生角膜缘移植物原材；

将3D打印仿生角膜缘移植物原材转移到配置的细胞培养基中进行培养，获得3D打印仿生角膜缘移植物。

图1示例性地显示了本发明提供的3D打印仿生角膜缘移植物的整体结构，其由角膜缘上皮层1和角膜缘微环境层2相互叠置而成，其整体构成一个柱型环状体结构。图2为本3D打印仿生角膜缘移植物的各部分组成示意，上部角膜缘上皮层1的圆形图案为角膜缘上皮干细胞(LESC)11，下部角膜缘微环境层2中，三角形图案代指角膜缘基质干细胞21，矩形图案代指黑色素细胞22，星形图案代指微血管内皮细胞23.

本发明提供了一种由负载LESC的角膜缘上皮层和负载角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞的角膜缘微环境层组成的3D打印仿生角膜缘微结构，两个组成部分通过负载活性细胞的生物墨水经数字光固化处理(DLP)逐层打印而构成一个整体。相比传统的单一LESC移植，多种角膜缘微环境细胞组成的3D打印结构为上皮层LESC提供了仿生天然微环境，有利于长期维持LESC干性、改善角膜缘干细胞缺乏、促进角膜上皮愈合。

第二方面，本发明提供一种上述的3D打印仿生角膜缘移植物的制备方法，将培养好的LESC细胞悬液加入到溶解于PBS中的优选浓度的GelMA溶液中，得到角膜缘上皮层3D打印生物墨水；将培养好的角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞悬液按一定比例加入到优选浓度的GelMA溶液中，得到角膜缘微环境3D打印生物墨水。利用上述两种生物墨水通过优选参数的DLP打印技术依次建构角膜缘上皮层和角膜缘微环境层，作为一个整体共同构成3D打印角膜缘移植物。

细胞来源为从捐献眼或患者对侧健眼获得角膜缘组织，通过消化法将角膜缘的上皮层与基质层分开，并进一步消化、分离、培养得到LESC、角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞。

在本发明提供的优选实施例中，制备过程具体如下：

S1将培养的LESC细胞的悬液加入到PBS中的优选浓度的3D打印基材溶液中，获得第一生物墨水；将培养的角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞的悬液加入到PBS中的优选浓度的3D打印基材溶液中，获得第二生物墨水；

S2分别在第一生物墨水和第二生物墨水中加入光引发剂和光吸收剂；

S3将执行了步骤S2之后的第一生物墨水加入到墨盒中，通过3D打印设备进行3D打印作业，获得角膜缘上皮层原材；此时，若墨盒中的第一生物墨水未用尽，则排出剩余的第一生物墨水；

S4将执行了步骤S2之后的第二生物墨水加入到执行了步骤S3之后的墨盒中，通过3D打印设备进行3D打印作业，获得角膜缘微环境层原材，并获得3D打印仿生角膜缘移植物原材；

S5将3D打印仿生角膜缘移植物原材转移到配置的细胞培养基中进行培养，获得3D打印仿生角膜缘移植物。

进一步的，3D打印基材溶液为兼具优秀的生物相容性和合适机械性能的甲基丙烯酸功能化明胶(GelMA)，3D打印优选具有高打印分辨率和良好生物相容性的数字光固化处理(DLP)打印技术构建多层次的3D打印角膜缘移植物。

光引发剂优选剂苯基-(2,4,6-三甲基苯甲酰基)-磷酸锂盐(LAP)，光吸收剂优选柠檬黄，添加量可以根据实际情况适当调整。

在步骤S1中，优选的GelMA溶液浓度为5w/v％—20w/v％；优选的各种细胞的打印密度分别为，LESC：2×10

在步骤S2中，生物墨水中光引发剂LAP和光吸收剂柠檬黄的浓度分别为0.25wt％和0.05wt％。

步骤S4中，优选的DLP打印参数为如下，打印光源：蓝光(波长405nm,光功率10mW/cm

第三方面，本发明提供一种上述的3D打印仿生角膜缘移植物的用途，包括如下过程：

嘱患者平躺于手术台上，给予表面麻醉剂，对患者置入开睑器使得患者的角膜、角膜缘和巩膜的区域暴露；

沿角膜缘全周360°打开结膜囊，并将打开的结膜囊的边缘后退，以保持其开启的状态；

用14mm和10mm环钻标记需要去除的病变角膜缘和病变角膜的范围；

剥离病变角膜缘；剥离深度为200-300um；

去除病变角膜的上皮；

将上述的3D打印仿生角膜缘移植物调整至角膜缘上皮层在上方，角膜缘微环境层在下方的姿态，置入已去除病变角膜的上皮的环形区域；

使用20mm×20mm大小的羊膜覆盖置入了3D打印仿生角膜缘移植物的区域。

后期还可根据治疗效果决定是否需要进行再次移植。

综上所述，本发明提供的一种3D打印仿生角膜缘移植物及其制备方法和用途，其仿生角膜缘移植物包括相互叠置的角膜缘上皮层和角膜缘微环境层，并通过分别基于LESC细胞，以及角膜缘基质干细胞、黑色素细胞和微血管内皮细胞配置的生物墨水，再经过3D打印制备获得。本发明提供的3D打印仿生角膜缘移植物及其制备方法和用途通过将3D生物打印技术重建角膜缘的立体结构，并将其用于角膜缘移植，进而达到治疗角膜缘干细胞缺乏，促进角膜上皮愈合，减少角膜组织的瘢痕形成，提高视力的目的。具体具有如下优点：

将LESC、角膜缘微环境细胞进行体外扩增，使一次移植只需要少量的角膜缘组织进行培养，即可提供大量的LESC和微环境细胞；

可对培养的LESC和角膜缘微环境细胞进行保存，若一次移植治疗效果有限，可继续进行体外扩增，进行多次移植；

该移植物在给患者提供LESC的同时，还重建了角膜缘微环境细胞。角膜缘微环境细胞能够与LESC通过细胞接触直接沟通，还能够通过旁分泌方式释放促进上皮修复的生长因子，调节炎症反应、抑制瘢痕形成的抗炎因子等，进而维持LESC的干细胞特性、促进角膜上皮的修复、保持角膜的透明性。

本领域普通技术人员可以理解：附图只是一个实施例的示意图，附图中的模块或流程并不一定是实施本发明所必须的。

本说明书中的各个实施例均采用递进的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于装置或系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述得比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。以上所描述的装置及系统实施例仅仅是示意性的，其中所述作为分离部件说明的单元可以是或者也可以不是物理上分开的，作为单元显示的部件可以是或者也可以不是物理单元，即可以位于一个地方，或者也可以分布到多个网络单元上。可以根据实际的需要选择其中的部分或者全部模块来实现本实施例方案的目的。本领域普通技术人员在不付出创造性劳动的情况下，即可以理解并实施。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。