与CPNMB和CD3特异性结合的双特异性抗体及其用途

技术领域

本发明涉及与GPNMB和CD3特异性结合的新的双特异性抗体及其用途。

背景技术

在多种死亡原因中，频繁发生由癌症导致的死亡，其占第二大比例。已连续尝试了用于治疗癌症的多种方法，并且其典型实例包括施用抗癌剂、辐射或手术操作。在其中癌症处于早期阶段的情况下，其治疗可通过单独使用这些方法或将其组合进行；然而，在其中癌症处于晚期阶段的情况下，或者在其中癌症已通过血液扩散至其他组织或已复发的情况下，这样的方法具有差的治疗效果。

因此，对基于免疫细胞的治疗技术的研究正在引起关注。具体地，正在开发这样的技术：其中对取自患者外周血的免疫细胞进行体外大量增殖，并随后将所得免疫细胞再施用于患者，使得存在于免疫细胞中的癌细胞特异性毒性T细胞去除癌细胞。此外，随着重组技术的发展，也已开发用于需要T细胞介导的杀伤的治疗领域(例如用于癌症)的双特异性抗体，并且已鉴定了其作用(Buhler，P.，等，Cancer Immunology，Immunotherapy 57.1，2008：43-52)。尽管如此，仍需要开发具有更好的抗癌作用和最小的不良作用的双特异性抗体。

发明内容

技术问题

本发明人开发了能够使表达CD3的免疫细胞定位到表达GPNMB的癌细胞，使得有效地诱导表达GPNMB之癌细胞的死亡的双特异性抗体，并且鉴定了其优异的抗癌作用，从而完成了本发明。

因此，本发明的一个目的是提供与CD3和GPNMB特异性结合的双特异性抗体。

本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含双特异性抗体或其片段作为活性成分。

问题的解决方案

为了实现上述目的，本发明提供了包含与GPNMB特异性结合的第一结构域和与CD3特异性结合的第二结构域的双特异性抗体。

另外，本发明提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含双特异性抗体或其片段。

发明的有益效果

由于对GPNMB和CD3具有高亲和力和特异性，根据本发明的双特异性抗体能够诱导表达GPNMB的癌细胞的死亡或抑制其增殖。因此，所述双特异性抗体可作为针对表达GPNMB的癌症的有效治疗剂使用。

附图说明

图1示出了显示获得抗GPNMB/抗CD3双特异性抗体的结果。在此，横轴意指mL(缓冲液流量)并且纵轴意指mAu(280nm处的OD)。

图2示出了通过对抗GPNMB/抗CD3双特异性抗体进行HPLC分析获得的结果。

图3示出了显示抗GPNMB/抗CD3双特异性抗体与癌细胞系的结合模式的FACS结果。

图4示出了在存在抗GPNMB/抗CD3双特异性抗体的情况下观察到的针对癌细胞系(SK-MEL-2、U87MG和T98G)的PBMC介导的杀伤效力。

图5示出了在存在抗GPNMB/抗CD3双特异性抗体的情况下观察到的癌细胞系(SK-MEL-2、U87MG和T98G)中的T淋巴细胞活化。

具体实施方式

在本发明的一个方面中，提供了包含与GPNMB特异性结合的第一结构域和与CD3特异性结合的第二结构域的双特异性抗体。

本文中使用的术语“GPNMB”是糖蛋白非转移性黑素瘤蛋白B(Glycoprotein Non-Metastatic Melanoma Protein B)的缩写，并且是指在患有多种癌症(例如乳腺癌和黑素瘤)的患者中过表达的糖蛋白。尽管迄今为止尚未明确阐明GPNMB的功能，但GPNMB的过表达发生在癌细胞中。另外，GPNMB是指存在于动物(优选人和猴)中的GPNMB。即术语“人GPNMB”是指人来源的GPNMB，并且术语“小鼠GPNMB”是指小鼠来源的GPNMB。例如，人GPNMB可具有SEQ ID NO：37的氨基酸序列。

本文中使用的术语“分化簇3(cluster of differentiation 3，CD3)”是指在T细胞上表达的同二聚体蛋白或异二聚体蛋白，其与T细胞受体复合体相关并且是T细胞活化的必需要素。功能性CD3通过四条不同链(ε、ζ、δ和γ)中的两条或更多条的二聚缔合形成，并且CD3二聚体构型包含γ/ε、δ/ε和ζ/ζ。例如，人CD3蛋白(ε/δ)可具有SEQ ID NO：38的氨基酸序列，并且人CD3蛋白(ε)可具有SEQ ID NO：39的氨基酸序列。已知针对CD3的抗体与T细胞上存在的CD3结合并诱导T细胞活化。另外，CD3是指存在于动物(优选人和猴)中的CD3。即术语“人CD3”是指人来源的CD3，并且“猴CD3”是指猴来源的CD3。

本文中使用的术语“抗体”是指与特定抗原具有免疫反应性的免疫球蛋白分子，即充当特异性识别抗原的受体的蛋白质分子。抗体可作为涵盖完整抗体和抗体片段的概念使用。

本文中使用的术语“双特异性抗体”是指能够与两种不同抗原同时结合的抗体。特别是在其中适当地选择与双特异性抗体结合的抗原类型的情况下，免疫细胞例如T细胞可仅对特异性靶细胞例如癌细胞显示出毒性，并且可对其他正常细胞不显示出毒性。因此，双特异性抗体可显示出最大化的治疗作用和最小化的不良作用，并且因此可有效地用于需要T细胞介导的杀伤的治疗。根据本发明可将与CD3和GPNMB特异性结合的双特异性抗体称为“抗GPNMB/抗CD3双特异性抗体”。

在本发明的抗GPNMB/抗CD3双特异性抗体的一个实施方案中，提供了包含与GPNMB特异性结合的第一结构域和与CD3特异性结合的第二结构域的抗体，所述第一结构域形成抗体的一个可变区，所述第二结构域形成另一个可变区。在此，与GPNMB特异性结合的第一结构域可与人和猴GPNMB具有交叉反应性。另外，与CD3特异性结合的第二结构域可与人和猴CD3具有交叉反应性。

在第一结构域和第二结构域中，一些氨基酸可被替换、插入和/或缺失，只要维持与本发明的目的

例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸由于它们具有碱性侧链而具有相似的特性，并且天冬氨酸和谷氨酸由于它们具有酸性侧链而具有相似的特性。另外，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸和色氨酸由于它们具有不带电荷的极性侧链而具有相似的特性；丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和甲硫氨酸由于它们具有非极性侧链而具有相似的特性；以及酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸由于它们具有芳族侧链而具有相似的特性。

在本发明的一个实施方案中，第一结构域可包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含由选自SEQ ID NO：1、7、8、9、10和11的任一氨基酸序列表示的H-CDR1；由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表示的H-CDR2；和由SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的H-CDR3；所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示的L-CDR1；由SEQ ID NO：5或12的氨基酸序列表示的L-CDR2；和由SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的L-CDR3。

在本发明的一个实施方案中，第一结构域可包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO：1、7、8、9、10和11的任一氨基酸序列表示的H-CDR1；由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表示的H-CDR2；和由SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的H-CDR3；所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示的L-CDR1；由SEQ ID NO：5的氨基酸序列表示的L-CDR2；和由SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的L-CDR3。

在本发明的另一个实施方案中，第一结构域可包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含由SEQ ID NO：1的氨基酸序列表示的H-CDR1；由SEQ ID NO：2的氨基酸序列表示的H-CDR2；和由SEQ ID NO：3的氨基酸序列表示的H-CDR3；所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：4的氨基酸序列表示的L-CDR1；由SEQ ID NO：12的氨基酸序列表示的L-CDR2；和由SEQ ID NO：6的氨基酸序列表示的L-CDR3。

另外，第一结构域的重链可变区(VH)可由SEQ ID NO：26、27、28、29、30或31的氨基酸序列表示。另外，第一结构域的轻链可变区(VL)可由SEQ ID NO：32或33的氨基酸序列表示。

另外，第一结构域可包含其中重链可变区和轻链可变区通过接头彼此连接的scFv形式。在此，任何氨基酸接头均可作为接头使用，只要氨基酸接头可将轻链可变区和重链可变区彼此连接即可。例如，这样的scFv可具有由SEQ ID NO：19、20、21、22、23、24或25的任一氨基酸序列表示的序列。

在本发明的一个实施方案中，第二结构域可包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含由SEQ ID NO：13的氨基酸序列表示的H-CDR1；由SEQ ID NO：14的氨基酸序列表示的H-CDR2；和由SEQ ID NO：15的氨基酸序列表示的H-CDR3；所述轻链可变区包含由SEQ ID NO：16的氨基酸序列表示的L-CDR1；由SEQ ID NO：17的氨基酸序列表示的L-CDR2；和由SEQ ID NO：18的氨基酸序列表示的L-CDR3。

另外，第二结构域的重链可变区(VH)可由SEQ ID NO：44、45或46的氨基酸序列表示。另外，第二结构域的轻链可变区(VL)可由SEQ ID NO：42或43的氨基酸序列表示。

另外，第二结构域可包含其中重链可变区和轻链可变区通过接头彼此连接的scFv形式。在此，任何氨基酸接头均可作为接头使用，只要氨基酸接头可将轻链可变区和重链可变区彼此连接即可。作为一个实例，这样的scFv可具有由SEQ ID NO：49或SEQ ID NO：51的氨基酸序列表示的序列。另外，编码该氨基酸序列的核酸可分别具有SEQ ID NO：50和SEQID NO：52的核苷酸序列。

在本发明的一个实施方案中，第一结构域和第二结构域中的每一个还可包含Fc区，并且该Fc区可来源于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区(CH)。

本文中使用的术语“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C端区域，其包含恒定区的一部分。Fc区通常可包含抗体重链恒定区的CH2和CH3，并且Fc区可包含野生型Fc区和变体Fc区。

在本发明的一个实施方案中，第一结构域和第二结构域中的一个Fc区可具有结(knob)结构，并且另一个可具有孔(hole)结构。例如，在其中第一结构域的Fc区具有结结构的情况下，第二结构域的Fc区具有孔结构；并且在其中第一结构域的Fc区具有孔结构的情况下，第二结构域的Fc区可具有结结构。

本文中使用的术语“结进孔结构(knob-into-hole structure)”是指通过以下获得的结构：在两条不同Ig重链的各自的CH3区中诱导突变，使得在一个Ig重链CH3区中诱导结结构并且在另一个Ig重链CH3区中诱导孔结构，并允许所述两个区形成异二聚体。

通常来说，在形成结结构的氨基酸残基中，具有大侧链的疏水性氨基酸残基被具有小侧链的疏水性氨基酸残基替换；并且在形成孔结构的氨基酸残基中，具有小侧链的疏水性氨基酸残基被具有大侧链的疏水性氨基酸残基替换。然而，本发明不限于此。

特别地，可对第一结构域的Fc区中的CH3区的一些氨基酸(Q347R、S354C、D399V和F405T)进行替换；并且可对第二结构域的Fc区中的CH3区的一些氨基酸(Y349C、K360E和K409W)进行替换。因此，第一结构域和第二结构域可通过二硫键或结进孔结构(其中优选结进孔结构)彼此连接以形成双特异性抗体。然而，本发明不限于此。在此，氨基酸残基根据EU编号进行编号。

在一个实施方案中，具有孔结构的Fc区可具有SEQ ID NO：47的氨基酸序列，并且具有结结构的Fc区可具有SEQ ID NO：48的氨基酸序列。因此，第一结构域可包含具有SEQID NO：47或SEQ ID NO：48的氨基酸序列的Fc区，在该情况下，第二结构域可包含具有SEQID NO：48或SEQ ID NO：47的氨基酸序列的Fc区。

另外，在第一结构域和第二结构域中的各自的Fc区中可存在LALA突变(L243A、L245A)。在其中在Fc区中存在LALA突变的情况下，抗体未表现出抗体依赖性细胞毒性效力(antibody-dependent cell cytotoxicity，ADCC)。因此，抗体可仅对其中包含GPNMB表达细胞的癌细胞表现出选择性毒性，而对其他正常细胞不表现出毒性。在此，氨基酸残基根据EU编号进行编号。

在本发明的一个实施方案中，第一结构域可由SEQ ID NO：34或35的氨基酸序列表示，并且第二结构域可由SEQ ID NO：36、40或41的氨基酸序列表示。

另外，在本发明的一个方面中，提供了编码第一结构域的氨基酸序列的多核苷酸和编码第二结构域的氨基酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，编码第一结构域的氨基酸序列的多核苷酸可以是SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：54的核酸序列。

多核苷酸可容易地由本领域技术人员从双特异性抗体的氨基酸序列导出。

另外，在本发明的另一个方面中，提供了分别包含编码第一结构域的多核苷酸和编码第二结构域的多核苷酸的表达载体。

本文中使用的术语“表达载体”是指能够在宿主细胞中表达靶蛋白的重组载体，并且意指包含与其可操作地连接的必需调节元件以使得表达插入基因的基因构建体。编码第一结构域和第二结构域的氨基酸序列的相应多核苷酸可以以插入到单独载体中或插入到单一载体中的形式使用。

本文中使用的术语“可操作地连接”意指核酸表达调节序列和编码所期望蛋白质的核酸序列功能性地连接以执行期望的功能。与重组载体的可操作连接可使用本领域中公知的遗传重组技术实现，并且位点特异性DNA切割和连接可使用本领域通常已知的酶等容易地实现。

多种表达宿主/载体组合可用于表达双特异性抗体。适合于真核宿主的表达载体包括但不限于来源于SV40、牛乳头瘤病毒、腺病毒、腺相关病毒、巨细胞病毒和逆转录病毒的表达控制序列等。可用于细菌宿主的表达载体包括从大肠杆菌

另外，在本发明的一个方面中，提供了用表达载体转化的宿主细胞。可将分别包含编码第一结构域的多核苷酸和编码第二结构域的多核苷酸的表达载体分别插入到宿主细胞中以形成转化体。用于载体的合适的宿主细胞可包括原核细胞，例如大肠杆菌、枯草杆菌

另外，宿主细胞也可来源于植物或哺乳动物。优选地，可使用的宿主细胞包括但不限于猴肾细胞(COS7细胞)、NSO细胞(小鼠来源的骨髓瘤细胞)、SP2/0细胞(小鼠来源的骨髓瘤细胞)、其他骨髓瘤细胞系、中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary，CHO)细胞、MDCK、HuT78细胞、HEK293细胞等，其中优选CHO细胞。

同时，在本发明的另一个方面中，提供了用于产生抗GPNMB/抗CD3双特异性抗体的方法，其包括以下步骤：培养宿主细胞；以及纯化抗GPNMB/抗CD3抗体。

特别地，用于产生双特异性抗体的方法可包括以下步骤：将编码第一结构域的多核苷酸和编码第二结构域的多核苷酸插入到载体中以构建重组载体；将所述重组载体转化到宿主细胞中并进行培养；以及从培养的转化体中分离和纯化双特异性抗体。

可通过在营养培养基中培养其中表达重组载体的转化体来产生大量的双特异性抗体，并且培养基和培养条件可根据宿主细胞的类型从本领域已知的那些中适当地选择。在培养中，可适当调节条件，例如温度、培养基的pH和培养时间等，以适合细胞生长和蛋白质的大量产生。

另外，在本发明的一个方面中，提供了用于预防或治疗癌症的药物组合物，其包含双特异性抗体或其片段。

所述双特异性抗体可与表达CD3的T细胞和表达GPNMB的癌细胞特异性结合。在此，癌症可以为选自以下的一种或更多种：结直肠癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、甲状腺癌、头颈癌、胃癌、膀胱癌、非霍奇金淋巴瘤、皮肤癌、黑素瘤、白血病、神经母细胞瘤和胶质母细胞瘤。然而，癌症不限于此并且可包括其中表达GPNMB的任何癌症。在此，双特异性抗体可通过与CD3特异性结合诱导T细胞，从而诱导表达GPNMB的癌细胞的死亡或抑制其增殖。

所述药物组合物还可包含可药用载体。作为可药用载体，黏合剂、助流剂、崩解剂、赋形剂、增溶剂、分散剂、稳定剂、助悬剂、色素、香料等可用于经口施用；缓冲剂、防腐剂、疼痛缓解剂、增溶剂、等张剂、稳定剂等可混合使用用于注射；并且基质

所述药物组合物的制剂可通过与上述可药用载体混合以多种方式制备。例如，对于经口施用，可将所述药物组合物配制成片剂、锭剂、胶囊剂、酏剂、混悬剂、糖浆剂、薄片剂(wafer)等的形式。对于注射，可将所述药物组合物配制成单位剂量安瓿或多剂型的形式。

所述药物组合物可以以治疗癌细胞或其转移或抑制癌症生长的药物有效量施用。有效量可取决于多种因素例如癌症类型、患者的年龄、体重、症状的性质和严重程度、目前治疗的类型、治疗次数、剂型和施用途径而变化，并且可由相应领域的专家容易地确定。

所述药物组合物可与上述药理学或生理学组分一起或顺序施用，并且也可与另外的常规治疗剂组合施用，在该情况下，药物组合物可与常规治疗剂顺序或同时施用。这样的施用可以是单次施用或多次施用。考虑到所有上述因素，施用这样的量是非常重要的：在不具有不良作用的情况下，其是最小量并允许获得最大作用，并且这样的量可由本领域技术人员容易地确定。

在本发明中，提供了用于预防或治疗癌症的方法，其包括向对象施用药物组合物的步骤。

本文中使用的术语“对象”是指患有可通过施用药物组合物来减轻、抑制或治疗的病症或疾病或者处于可通过施用药物组合物来减轻、抑制或治疗的病症或疾病之风险之中的哺乳动物，优选人。

本文中使用的术语“施用”意指以任何合适的方式将预定物质引入到对象中，并且所述药物组合物可通过任何途径施用，只要该途径使得药物组合物到达靶组织即可。这样的施用方法可包括但不限于腹膜内施用、静脉内施用、肌内施用、皮下施用、皮内施用、经口施用、表面施用、鼻内施用、肺部施用或直肠施用。在此，在经口施用的情况下，从蛋白质被消化的观点来看，可期望以这样的方式配制经口使用的组合物：活性剂被包衣或该组合物被保护以免在胃中消化。另外，所述药物组合物可通过使得活性成分可迁移至其靶细胞的任何装置施用。

另外，在本发明中，提供了所述药物组合物用于制备预防或治疗癌症的药物的用途。

发明实施方式

在下文中，将通过以下实施例的方式更详细地描述本发明。然而，以下实施例仅用于举例说明目的，并且本发明的范围不限于此。

实施例1.抗GPNMB/抗CD3双特异性抗体的产生

实施例1.1.抗GPNMB抗体的选择

为了选择GPNMB特异性抗体，使用基因重组技术来将待表达的DNA序列插入到寄生在大肠杆菌(E.coli)中的噬菌体的基因组中。然后，使用噬菌体展示技术，使插入的基因以与一种噬菌体外壳蛋白融合的形式在噬菌体表面上表达。

从合成噬菌体展示scFv文库的最终扩增群中收集单个菌落。随后，将菌落在37℃和220rpm下在1.5mL SB/羧苄青霉素中培养直至OD600值达到约0.8至1.0，并随后在1mMIPTG、30℃和200rpm的条件下培养12小时或更长时间。将该反应产物以5,500rpm离心5分钟，并随后仅将各自的上清液添加至包被有GPNMB抗原的ELISA板。随后，使板在室温下反应2小时，并用PBST(1×PBS，0.05％吐温20)洗涤4次。然后，向其添加HRP/抗-hFab-HRP缀合物在1％BSA/1×PBS中的1∶5000稀释物，并使反应在室温下进行1小时。随后，将板再次用PBST(1×PBS，0.05％吐温20)洗涤4次。然后向其添加TMB溶液，并使反应进行5至10分钟；并向其添加TMB终止溶液。

随后，使用TECAN Sunrise在450nm的测量波长处读取OD值，并获得具有高OD值的克隆作为单独的克隆。作为结果，选择了与人GPNMB特异性结合的23种克隆，并鉴定了其氨基酸序列。所选的克隆用于检查它们与表达GPNMB的癌细胞系的结合能力。作为结果，鉴定出了与细胞系结合的仅一种克隆。基于此，通过亲和力成熟另外获得了具有增强的蛋白质和细胞结合能力的六种克隆。

作为结果，总共获得了与GPNMB蛋白和表达GPNMB的癌细胞系结合的7种克隆，并将所选的克隆分别命名为克隆GPNMB1(SEQ ID NO：55)、克隆GPNMB2(SEQ ID NO：56)、克隆GPNMB3(SEQ ID NO：57)、克隆GPNMB4(SEQ ID NO：58)、克隆GPNMB5(SEQ ID NO：59)、克隆GPNMB6(SEQ ID NO：60)和克隆GPNMB7(SEQ ID NO：61)。

克隆的可变区序列分别以SEQ ID NO：26至33示出，并且每个可变区中的CDR氨基酸序列(其根据Kabat编号鉴定)在下表1中示出。

[表1]

另外，形成在抗GPNMB抗体中表现出最高亲和力的克隆GPNMB6(SEQ ID NO：18)，以具有结进孔结构。

实施例1.2.抗CD3抗体的选择

为了选择对人和猴CD3具有特异性的抗体，将小鼠SP34抗体人源化，并选择以多种亲和力与CD3结合的抗体。在其中，获得了由SEQ ID NO：36的氨基酸序列组成的克隆A15和由SEQ ID NO：41的氨基酸序列组成的克隆E15。另外，产生并使用具有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的抗体(Hu38E4.v1，由Genentech制造)。另外，对于双特异性抗体，形成抗CD3抗体(Hu38、A15或E15)，以具有结进孔结构。

实施例1.3.用于抗体表达的载体的引入

在转染之前24小时，将密度为2.0×10

使用Opti-MEM I培养基，将540μl转染试剂与其混合至总共为1,500μl，并在室温下进行培养5分钟。将分别包含载体和转染试剂的Opti-MEM I培养基轻轻混合，并允许在室温下反应20分钟。然后，将所得物放置在包含Expi293F细胞的烧瓶中。在37℃和8％CO

实施例1.4.抗GPNMB/抗CD3双特异性抗体的产生

将培养物以4,000rpm离心30分钟，通过0.22μm过滤器过滤，并随后去除细胞碎片以获得上清液。将1ml Mabselect Xtra树脂添加至柱，并使用体积相当于10倍树脂体积的蛋白质A结合缓冲液实现平衡。

随后，使用重力将上清液加载至柱上。在加载完成之后，将柱用体积相当于10倍树脂体积的蛋白质A结合缓冲液洗涤。随后，向柱添加IgG洗脱缓冲液并进行洗脱。通过添加25μl 1.5M Tris-Cl/1ml洗脱液来中和洗脱液，并随后在OD 280nm处测量浓度。将已测量浓度的洗脱液通过透析用PBS进行缓冲液交换。

接下来，将样品浓缩或稀释至约1.0g/L至2.0g/L，并加载至AKTA Purifier 900上的HiLoad 16/600 Superdex 200pg柱(GE Healthcare，28989335)上。将包含200mM氯化钠的20mM磷酸钠(pH 7.0)用作流动相，并以1.0ml/分钟的流量流动。然后，取在样品加载之后约50至70分钟洗脱的级分。使用4％至12％Bis-Tris PAGE(Invitrogen，0321BOX)对洗脱的级分用考马斯蓝进行染色，并随后从中取包含150kDa尺寸的抗体的级分。随后，将该级分使用30kDa Amicon离心过滤器单元(Merck，UFC803024)浓缩。

图1示出了显示以下的结果：通过对包含抗GPNMB抗体片段(SEQ ID NO：22)和抗CD3抗体片段(SEQ ID NO：1)的双特异性抗体进行共表达和纯化获得了对应于150kDa的蛋白质样品。

实施例1.5.通过HPLC分析对双特异性抗体纯度的确定

对于HPLC分析，将50mM磷酸钠(pH 6.0)作为平衡缓冲液，并将通过向50mM磷酸钠(pH 6.0)添加氯化钠至500mM的浓度并随后用0.45μm瓶顶过滤器(bottle top filter)(Nalgene，597-4520)进行过滤而获得的溶液用作洗脱缓冲液。将阳离子柱(Thermofisher，054993)连接至HPLC系统(Waters，295/2489)，并随后使用平衡缓冲液实现平衡。将待分析的样品在平衡缓冲液中稀释10倍或更高倍数以制备加载样品。以这样的方式分析流动相：使平衡缓冲液以0.5ml/分钟流动10分钟并随后将洗脱缓冲液以线性浓度梯度法在40分钟内从0％至100％流动。在完成分析之后，计算在UV 280nm处测量的色谱图的面积以确定纯度。

对经纯化的蛋白质样品进行HPLC分析，获得如图1中所示的结果。作为结果，确定了在GPNMB/CD3双特异性抗体样品中几乎不存在抗GPNMB抗体片段和抗CD3抗体片段(图2)。

实施例2.双特异性抗体对GPNMB蛋白的亲和力的分析

使用作为生物传感器的Biacore T-200(GE Healthcare，USA)测量经纯化的双特异性抗体对重组人GPNMB的定量结合能力(亲和力)。使用胺-羧基反应将从HEK293细胞纯化的GPNMB固定在CM5芯片(GE Healthcare)上，直至获得200Rmax。接下来，使在HBS-EP缓冲液(10mM HEPES，pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％表面活性剂P20)中连续稀释的GPNMB/CD3双特异性抗体以0.078nM至5nM的浓度与其结合120秒，并以30μL/分钟的流量流动1800秒从而实现解离。与GPNMB结合的抗体的解离是通过使10mM甘氨酸-HCl(pH 1.5)以30μL/分钟的流量流动30秒而诱导的(表2)。使用Biacore T-200评价软件获得亲和力作为动力学速率常数(K

[表2]

[表3]

实施例3.双特异性抗体对表达GPNMB和CD3的细胞的亲和力的分析

实施例3.1.双特异性抗体对表达人GPNMB的癌细胞系的亲和力的分析

使用流式细胞术确定双特异性抗体是否对表达GPNMB的细胞表现出亲和力。特别地，准备5ml管，向包含100μl FACS缓冲液(2％FBS/PBS)的每个管添加浓度为3×10

接下来，用在100μl FACS缓冲液中的0.2μg荧光染料标记的二抗处理每个管，所述二抗能够与一抗特异性结合。然后，避光30分钟并在4℃下进行孵育。随后，向其添加1mlFACS缓冲液，并在4℃以1,500rpm进行离心3分钟；并随后去除上清液以获得样品。然后，向样品添加以FACS缓冲液∶BD Cytofix

如图3中所示，发现GPNMB(SEQ ID NO：18)/A15(SEQ ID NO：20)双特异性抗体与三种类型的癌细胞系结合。用作无关对照的阴性对照抗体不与三种类型的癌细胞系中的任一种结合。

实施例3.2.双特异性抗体对表达人CD3的癌细胞系的亲和力的分析

使用流式细胞术确定了根据实施例1产生的双特异性抗体是否也表现出对表达CD3的细胞的亲和力。特别地，准备5ml管，向包含100μl FACS缓冲液(2％FBS/PBS)的每个管添加浓度为3×10

接下来，用在100μl FACS缓冲液中的0.2μg荧光染料标记的二抗处理每个管，所述二抗能够与一抗特异性结合。然后，避光30分钟并在4℃下进行孵育。随后，向其添加1mlFACS缓冲液并在4℃下以1,500rpm进行离心3分钟；并随后去除上清液以获得样品。然后，向样品添加以FACS缓冲液∶BD Cytofix

如图3中所示，发现GPNMB(SEQ ID NO：35)/A15(SEQ ID NO：36)双特异性抗体与细胞系Jurkat结合。用作无关对照的阴性对照抗体不与三种类型的癌细胞系中的任一种结合。

实施例4.双特异性抗体对肿瘤细胞系的细胞杀伤效力的评价

使用人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)和根据实施例1产生的双特异性抗体，根据如下所述的方法确定双特异性抗体对三种类型的GPNMB+肿瘤细胞(SK-MEL-2、U87MG和T98G)的GPNMB特异性肿瘤细胞杀伤效力。

实施例4.1.靶细胞系的构建

三种类型的GPNMB+肿瘤细胞(SK-MEL-2、U87MG和T98G)用1×胰蛋白酶-EDTA溶液收获，并在4℃下以1,200rpm离心5分钟。随后，去除上清液并在cRPMI(RPMI，A10491-01+10％FBS+55μMβ-ME)中进行重悬。然后，对细胞数目进行定量。以1.0×10

实施例4.2.靶细胞系的制备

特别地，用1×胰蛋白酶-EDTA溶液收获细胞，并在4℃下以1,200rpm离心5分钟。随后，去除上清液并在cRPMI(RPMI，A10491-01+10％FBS+55μMβ-ME)中进行重悬。然后，对细胞数目进行定量。以1×10

实施例4.3.外周血单个核细胞的制备

将冷冻保存的外周血单个核细胞(PBMC)在37℃下在水浴中快速解冻，并随后转移至50ml锥形管。向其逐滴添加复苏培养基(RPMI，11875-093+10％FBS+55μMβ-ME)，并在振荡下进行混合。然后，通过在4℃下以1,200rpm进行离心10分钟去除上清液，并在30ml复苏培养基中进行重悬。然后，对细胞数目进行量化，并将细胞在各自供体的cRPMI中混悬以使浓度调节为1.0×10

实施例4.4.外周血单个核细胞和抗体的平板接种

将每种抗体在cRPMI中稀释，并随后从20nM开始稀释1/5。将抗体施加至在一天之前已接种靶细胞的孔。然后，向其添加100μl/孔的先前制备的PBMC，以便获得靶标∶PBMC＝1∶10(SK-MEL-2)或1∶20(U87MG、T98G)的比。

实施例4.5.使用IncuCyteS3进行实时细胞图像分析

在CO

实施例5.由双特异性抗体导致的T细胞活性的测量

为了分析由根据实施例1产生的双特异性抗体导致的T细胞活化的程度，使用细胞系IL2-luc2P Jurkat(Promega)针对过表达GPNMB的三种癌细胞系(SK MEL2、U87MG和T98G)分析双特异性抗体的T细胞活化能力。

特别地，使用100μl培养基分别将表达GPNMB的SK MEL2、U87MG和T98G细胞以3×10

通过从10nM开始稀释1/3来制备抗体，以便获得以3×剂量的10个点(point)。然后，将10种浓度的25μl经制备的抗体添加至包含FTU IL2-Luc2P Jurkat细胞的预先制备的96孔板，以便实现1×剂量。在37℃和5％CO