官能化酶驱动的纳米马达

本申请要求于2018年12月5日提交的欧洲专利申请EP18382896的权益。

技术领域

本发明属于纳米技术领域。具体地，本发明涉及外部官能化的酶驱动的纳米马达。本发明的纳米马达对于治疗和生物传感特别有用。

背景技术

催化微泳器是一种人工系统，由于将化学能转化为机械力，最终转化为主动运动，因此能够实现自推进。

尽管化学驱动的微型和纳米马达在许多领域，如环境修复、货物运输和递送、组织和细胞渗透以及活性药物在体内向胃部的递送中都显示出有前景的适用性，但其在生物医学中的实施经常受到燃料固有的毒性或在生物体内的有限可用性的限制。

近来，酶催化的使用已成为替代常用的有毒燃料的有吸引力的替代方法，因为其具有独特的特征，包含生物相容性、多功能性和燃料生物利用度。在这方面，尿素酶、过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶的使用已显示出在酶底物的生理相关浓度下增加了纳米大小的颗粒的扩散。

另外，当使用尿素酶为中空二氧化硅Janus颗粒提供动力时——即，具有两个半球的颗粒，其中仅一个与酶偶联，可以实现定向推进。可以通过添加酶抑制盐来开启和关闭其运动，并且可以通过施加磁场按需修改轨迹，从而实现高度可控性(Xing MA等人,“尿素驱动的生物相容性中空微胶囊的运动控制(Motion Control of Urea-PoweredBiocompatible Hollow Microcapsules)”,《ACS纳米(ACS Nano.)》,2016,第10(3)卷,第3597-605页)。

还已经描述了使用酶推进的纳米马达来提高体外阿霉素到癌细胞的递送效率(Ana C.等人,“酶驱动的纳米机器人增强抗癌药物递送(Enzyme-Powered NanobotsEnhance Anticancer Drug Delivery)”,《先进功能材料(Advanced FunctionalMaterials)》,2017,第28(25)卷)。

然而，球形Janus颗粒的生产涉及昂贵且费时的技术，这可能会损害其可扩展性并因此损害其适用性。

最近，并且尽管事实上传统上一直声称催化剂的不对称结构和分布对于产生主动运动是必不可少的，但结果表明，非Janus球形马达的自推进是由定位在整个颗粒表面的酶催化驱动的(Patino T.等人,“酶数量和分布对非Janus尿素酶驱动的微型马达的自推进的影响(Influence of Enzyme Quantity and Distribution on the Self-Propulsion ofNon-Janus Urease-Powered Micromotors)”,《美国化学学会期刊(J.Am.Chem.Soc.)》,2018,第140(25)卷,第7896-7903页)。然而，此类型的纳米马达的移动显示出对酶覆盖率极为敏感。实际上，已经发现每个纳米马达大量的酶分子对于实现期望的移动是必需的。由于其对外部官能化的限制性，这严重阻碍了这些纳米马达的使用和适用性。

因此，尽管到目前为止已经做出了努力，但是仍然需要易于生产并适应各种应用同时维持高移动能力的酶驱动的纳米马达。

发明内容

本发明人已经开发了在多种生物医学、化学和环境应用中有用的新颖的酶推进的官能化纳米马达。

令人惊讶地，发明人发现，通过将分子外部附着到酶驱动的非Janus纳米马达，所述纳米马达可以维持或者甚至增加颗粒的速度和移动模式(参见图2D和图7B)。

这是非常出乎意料的，因为先前已经证明了其中推进酶附着在颗粒的整个表面之上的纳米马达的移动高度依赖于酶覆盖率。因此，当酶数量降到给定阈值以下时，表明完全消除了颗粒的移动(

如以下实例所示，发明人发现不同类型的大分子的外部附着，如抗体或DNA结构，不仅不影响纳米马达的移动，而且还增加了所述纳米马达的细胞穿透能力、稳定性并避免了所述纳米马达聚集。图4表明尽管没有任何细胞穿透肽，但用抗体官能化的纳米马达具有更高的穿透肿瘤细胞的能力。

另外，发明人惊奇地发现，本文提供的官能化酶驱动的纳米马达表现出如此强的活性，使得即使所述纳米马达没有装载任何细胞毒性药物，其也能够增加癌细胞的死亡(参见图4D)。这构成了很大的优势，因为其允许开发特异性更高且继发效应更低的抗癌治疗药物。

本发明的纳米马达的重要优点在于其多功能性-所述纳米马达可以用不同的酶工程化以使其仅在存在底物的位置中才具有活性。这进一步提供了允许开发具有高特异性和低继发效应的治疗的优点。

鉴于上述情况，本发明的纳米马达提供了用于如疾病治疗和生物传感等多种领域的非常有价值的工具。

因此，在第一方面中，本发明提供了一种酶驱动的纳米马达，其包括具有表面的颗粒；酶；以及异源分子；其特征在于，所述酶和所述异源分子不连续地附着在所述颗粒的整个表面之上。本发明还提供了一种酶驱动的纳米马达，其包括具有表面的颗粒；酶；以及异源分子；其中所述酶和所述异源分子不连续地附着在所述颗粒的整个表面之上。

在第二方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量的根据第一方面所述的纳米马达，以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。

在第三方面中，本发明提供了根据第一方面所述的纳米马达或根据第二方面所述的药物组合物，其用于治疗、诊断或预后。

在第四方面中，本发明提供了一种成套试剂盒，其包括根据第一方面所述的纳米马达，或根据第二方面所述的药物组合物，以及任选地其使用说明书。本发明还提供了一种成套试剂盒，其包括根据第一方面所述的纳米马达，或根据第二方面所述的药物组合物，以及其使用说明书。本发明的试剂盒可以进一步包括适于稀释本发明的纳米马达的缓冲液，或重悬本发明的干燥或冻干的纳米马达的缓冲液。

在第五方面中，本发明提供了一种检测分离的样品中的分析物的体外方法，所述体外方法包括使根据第一方面所述的纳米马达与样品接触。

在第六方面中，本发明提供了根据第一方面所述的纳米马达在体外方法中的用途，所述纳米马达用于检测分离的样品中的分析物。

附图说明

与实例1有关的图1示出了尿素酶/PEG纳米马达(MSNP-Ur/PEG)和抗体修饰的尿素酶纳米马达(MSNP-Ur/PEG-Ab)的制备和表征。A)方案展示了逐步制造过程以获得纳米马达。

与实例1有关的图2示出了MSNP-Ur/PEG和MSNP-Ur/PEG-Ab的运动分析。A)MSNP-Ur/PEG纳米马达和B)MSNP-Ur/PEG-Ab纳米马达在0mM、50mM和100mM尿素下的代表性跟踪轨迹以及C)两种类型的纳米马达在0mM、50mM和100mM下的代表性均方位移(MSD)。D)通过MSD分析在不同尿素浓度下获得的有效扩散系数(N＝20，误差线表示SE，p<0.001)。

与实例1有关的图3示出了在存在不同尿素浓度的情况下，具有以及不具有抗体的纳米马达对球体的活力的影响。在不同尿素浓度(N＝3，误差线表示SE)下，在用MSNP-Ur/PEG(最初为蓝色)和MSNP-Ur/PEG-Ab(最初为红色)温育4小时后，对球体的活力进行定量。

与实例1有关的图4示出了抗体修饰的纳米马达靶向和渗透到膀胱癌球体中的能力。在温育4小时后，在存在尿素(40mM)和不存在尿素的情况下，对抗体修饰的纳米马达内化到膀胱癌球体进行定量，并在48小时静置时间段之后测量后，在存在尿素(40mM)和不存在尿素的情况下，对与MSNP-Ur/PEG和MSNP-Ur/PEG-Ab温育4小时的球体的增殖进行定量。

与实例2有关的图5示出了DNA微型马达的制造方法和表征。A)微型马达制造的示意性图示，其中通过添加APTES和TEOS二氧化硅前体使二氧化硅层生长在商用聚苯乙烯模板上生长。然后通过DMF去除聚苯乙烯芯，并通过使用戊二醛(GA)接头将微胶囊用尿素酶和DNA支架进行官能化。B)pH响应性DNA纳米开关与共价连接在微型马达上的互补DNA支架杂交。通过尿素转化为氨和二氧化碳来实现通过尿素酶介导的自推进。C)单分子DNA纳米开关的pH依赖性三链体到双链体转变导致FRET效率发生变化。D)SiO

与实例2有关的图6示出，基于三链体的pH响应性DNA纳米开关能够检测溶液中的pH变化并与微型马达结构缀合。A)三链体DNA纳米开关通过形成pH不敏感的沃森-克里克相互作用(Watson-Crick interactions)(虚线)和pH敏感的胡格斯丁(Hoogsteen)相互作用(点)来形成分子内双发夹结构。含有CGC和TAT三联体的三链体纳米开关通过增加溶液的pH值而展开成双链体构象。比率计FRET发射(左)示出了DNA纳米开关的三链体到双链体转变随溶液中pH变化。B)DNA纳米开关官能化微粒的FRET效应的CSLM分析，从右到左示出了Cy3通道、FRET通道和FRET/Cy3比值，在校准栏中指示。比例尺＝2μm。白色箭头指示官能化微粒(对于Cy3通道，最初为红色，对于FRET通道为绿色，对于Cy3/FRET合并为黄色)。通过DNA官能化微型马达针对pH敏感(C)和非pH特异(D)的定量pH测量，示出为平均FRET/Cy3发射值，示出为平均值±平均值的标准误差。

与实例2有关的图7。A)DNA开关微型马达的MSD。结果示出为平均值±平均值的标准误差。B)根据MSD计算的速度。结果示出为平均值±平均值的标准误差。

具体实施方式

除非另有说明，否则本申请中本文使用的所有术语应以本领域已知的普通含义来理解。在本申请中使用的某些术语的其它更具体的定义如下文所述，并且旨在贯穿整个说明书和权利要求书中统一地应用，除非另外明确陈述的定义提供了更宽泛的定义。

如本文中所使用的，不定冠词“一个和一种(a/an)”与“至少一个”或“一个或多个”同义。除非另有说明，否则本文中使用的定冠词，例如“所述”也包含名词的复数形式。

术语“酶推进的纳米马达”或“酶驱动的纳米马达”是指在微米或纳米级的分子装置，其能够通过定位在装置的表面上的酶的作用将化学能转化为移动。换句话说，纳米马达是用酶外部官能化的纳米颗粒或微粒。不受理论的束缚，酶通过催化反应中涉及的产物的不对称释放而产生移动，从而产生取决于渗透梯度、电荷或其它特性的界面力。术语“纳米马达”和“微型马达”在本申请中可互换使用。

如本文所使用的，“异源分子”是指与一种或多种酶不同的任何分子，所述一种或多种酶负责纳米马达的推进，并且不连续地附着在颗粒的整个表面之上。实施例由此使基本上可以与颗粒连接的任何类型的分子通过其与颗粒的直接或间接连接而被固定在表面上。

下文提供的异源分子的列表仅应被视为可以用于本发明的纳米马达的分子的说明性且非限制性的列表。然而，实施例不限于此，并且涵盖可以与实施例的纳米马达直接或间接连接的任何异源分子。

所关注的异源分子可以选自标志物，如荧光标志物，即荧光团，例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、异硫氰酸四甲基罗丹明(TRITC)和其它异硫氰酸酯；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)荧光素和其它琥珀酰亚胺酯；荧光素-5-马来酰亚胺和其它马来酰亚胺活化的荧光团；花菁荧光团；荧光素荧光团；罗丹明荧光团；ATTO染料；DyLight Fluor染料；Alexa Fluor染料；和硼-二吡咯亚甲基(BODIPY)染料。另外的实例包含同位素标记或标志物、化学发光标志物、不透射线标志物等。在这种情况下，可以将纳米马达用作测试分子以能够使用标志物在表面上检测纳米马达。

异源分子的另外的实例包含细胞粘附和细胞附着分子，如细胞粘附分子(CAM)，包含免疫球蛋白(Ig)超家族、整联蛋白、钙粘蛋白和选择蛋白。

异源分子的另外的实例是细胞外基质(ECM)分子，包含例如蛋白聚糖(PG)、糖胺聚糖(GAG)、硫酸乙酰肝素(HS)、硫酸软骨素、硫酸角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白等。

所关注的分子的相关类型是基底层分子，其包含基底层的分子，所述基底层是上皮细胞分泌的一层ECM。此类基底层分子的非限制性实例包含层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、巢蛋白和基底膜聚糖。

所关注的异源分子的又另一个实例是抗炎分子，如皮质类固醇；糖皮质激素；非甾体类抗炎药(NSAID)，如乙酰水杨酸、异-丁基-丙酸-酚酸和萘普生钠(INN)；脂氧素；白介素-1受体拮抗剂(IL-1RA)；等等。

抗生素也可以用作所关注的异源分子，以抑制细菌生长或杀伤细菌。抗生素的非限制性实例包含青霉素；头孢菌素；多粘菌素；利福霉素；闰年霉素；喹诺酮类；磺酰胺；大环内酯类；林可酰胺类；四环素；杀菌性氨基糖苷类；环状脂肽，如达托霉素；甘氨酰环素，如替加环素；噁唑烷酮，如利奈唑胺；和闰年霉素，如非达霉素。

以类似方式，靶向其它类型微生物的分子，如抗真菌分子，例如，多烯抗真菌剂，如两性霉素B、杀念菌素、菲律宾菌素、哈霉素、游霉素、制霉菌素和龟裂霉素；唑类抗真菌剂，如咪唑类，例如，联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑和噻康唑；三唑，例如，阿尔巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑和伏立康唑；和噻唑类，例如，阿巴芬净；烯丙胺类，如阿莫罗芬、布替萘芬、萘替芬和特比萘芬；棘白菌素类，如阿尼芬净、卡泊芬净和米卡芬净；苯甲酸；环吡酮胺；氟胞嘧啶；灰黄霉素；托萘酯和十一碳烯酸。还有抗病毒分子，例如，病毒相关蛋白(VAP)抗独特型抗体；金刚烷胺；金刚乙胺；普拉康纳利；阿昔洛韦；齐多夫定(AZT)；拉米夫定；整合酶；福米韦森；利福平；扎那米韦和奥司他韦，以及抗寄生虫分子，如甲苯咪唑；双羟萘酸噻嘧啶；噻苯咪唑；乙胺嗪；伊维菌素；氯硝柳胺；吡喹酮；阿苯达唑；吡喹酮；利福平；两性霉素B；美拉胂醇；依氟鸟氨酸；甲硝哒唑；替硝唑和米替福新可以用作所关注的异源分子。

异源分子的另外的实例包含生长因子，如肾上腺髓质素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌运动因子、骨形态发生蛋白(BMP)、脑源性神经营养因子(BDNF)、表皮生长因子(EGF)、促红细胞生成素(EPO)、成纤维细胞生长因子(FGF)、神经胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、生长分化因子-9(GDF9)、肝细胞生长因子(HGF)、肝癌衍生生长因子(HDGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、肌生长抑制素(GDF-8)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、促血小板生成素(TPO)、转化生长因子α(TGF-α)、转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、血管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(PIGF)等。具有与表面结合肽连接的生长因子的纳米马达可以用于提供具有例如刺激细胞生长、增殖和/或细胞分化能力的表面。

所关注的异源分子的另外的实例包含细胞生长抑制剂和化学治疗剂。当包含在纳米马达中时，这种类型的异源分子将提供局部细胞生长抑制作用。此类所关注的异源分子的非限制性实例包含法呢基转移酶抑制剂；烷基化剂，如氮芥，例如，二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺和白消安；亚硝基脲，例如，N-亚硝基-N-甲基脲(MNU)、卡莫斯汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、司莫司汀(MeCCNU)、福莫司汀和链尿素佐菌素；四嗪，例如，达卡巴嗪、米托唑胺和替莫唑胺和氮丙啶类，例如，噻替派、丝裂霉素、亚丝醌(AZQ)；和顺铂，例如，顺铂、卡铂和奥沙利铂；抗代谢物，如抗叶酸，例如，甲氨蝶呤和培美曲塞；氟嘧啶，例如，氟尿嘧啶和卡培他滨；脱氧核苷类类似物，如阿糖胞苷、吉西他滨、地西他滨、维达扎、氟达拉滨、奈拉拉滨、克拉屈滨、氯法拉滨和喷司他汀；和硫嘌呤，例如，硫鸟嘌呤和巯嘌呤；抗微管剂，如长春花生物碱，例如，长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛和长春氟宁；和紫杉烷，例如，紫杉醇和多西他赛；和鬼臼毒素；拓扑异构酶抑制剂，如伊立替康、拓扑替康、喜树碱、依托泊苷、阿霉素、米托蒽醌、替尼泊苷、新生霉素、美巴龙和阿柔比星；细胞毒性抗生素，如蒽环类，例如，阿霉素、道诺霉素、表柔比星、伊达比星、吡柔比星、阿柔比星、米托蒽醌、放线菌素、博来霉素、普卡霉素和丝裂霉素。

所关注的其它异源分子组包含多核苷酸，如DNA或RNA分子。异源分子也可以是纳米传感器或分子门。

“不连续地附着在整个表面之上”是指不限于颗粒的单个面或半球体的离散分布，即，其是指非极性分布。然而，这并不意味着分子以均匀的方式覆盖了颗粒的整个表面。本发明的颗粒可以呈现外部附着的分子，从而在颗粒的整个表面之上形成离散的斑块，或者相同的，呈现出其中没有附着分子的间隙。

如本文所用，“靶向分子”是指对特定细胞、组织或器官具有特异性的分子。靶向分子的优选实例包含但不限于抗体、生长因子和多糖。

如本文所使用的，“纳米传感器”是指任何纳米或微米级感测装置。本发明的纳米传感器能够检测并响应其所处环境的变化。具体地，本发明的纳米传感器可以是纳米开关，其是能够在两种不同形式之间切换的纳米传感器。DNA纳米开关含有具有构象的单链DNA分子，所述构象响应于例如pH变化等环境变化而变化。DNA分子可以与允许检测构象变化的荧光分子偶联。

如本文所使用的，“标记分子”是指可以与纳米马达化学结合并发出可检测的信号以使纳米马达能够被检测到的分子。标记分子的特别优选的实例包含但不限于化学发光分子、荧光分子和同位素。

如本文所使用的，“分子门”或“纳米阀”是指纳米或微米级的分子系统，其响应于如光、温度、磁场和pH等所选触发而在第一闭合形式与第二打开形式之间切换。闭合形式的设计阻断释放分子门附着的颗粒中含有的货物。在施加触发之后，门将变成打开形式，从而可以释放货物。

“抗癌抗体”是指具有阻止或消除癌细胞的能力的抗体。

如上所述，本发明在第一方面中提供了用异源分子外部官能化的酶驱动的纳米马达。

在第一方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，颗粒是纳米颗粒或微粒。本文所使用的术语“纳米颗粒”是指在纳米级上具有至少两个维度，具体地在纳米级上具有所有三个维度的颗粒。为了类比，本文所使用的术语“微粒”是指在微米级上具有至少两个维度，具体地在微米级上具有所有三个维度的颗粒。在特定的实施例中，颗粒为1nm到100μm。具体地，30nm到2μm。更具体地，100nm到1μm。甚至更具体地，400nm到600nm。

关于本文描述的纳米颗粒或微粒的形状，包含球体、多面体和棒状。具体地，当纳米颗粒或微粒是具有基本上圆形横截面的如纳米线或纳米管、微线或微管等基本上棒状时，“纳米颗粒”或“微粒”是指在纳米级或微米级上具有至少两个维度的颗粒，这两个维度是纳米颗粒或微粒的横截面。

在第一方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，颗粒是球形的。

如本文所使用的，术语“大小”是指特征物理尺寸。例如，在纳米颗粒/微粒基本上为球形的情况下，纳米颗粒/微粒的大小对应于纳米颗粒/微粒的直径。当将一组纳米颗粒/微粒称为特定大小时，可设想到所述一组纳米颗粒/微粒可以具有围绕指定大小的大小分布。因此，如本文所使用的，一组纳米颗粒/微粒的大小可以指大小分布的模式，如大小分布的峰大小。另外，当不是完全球形时，直径是包含物体的球体的当量直径。此直径通常被称为“流体动力学直径”，其可以使用与Atlas细胞增压系统耦接的Wyatt Mobius或Malvern进行测量。透射电子显微镜(TEM)或扫描电子显微镜(SEM)图像也确实提供了关于直径的信息。

技术人员可用多种颗粒材料，并且其将理解，所选择的材料将取决于纳米马达的预期应用，例如，用于治疗用途的纳米马达应由生物相容性颗粒制成。

因此，在第一方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，颗粒由选自由以下组成的组的材料制成：金属、金属氧化物、聚合物、脂质、蛋白质、细胞膜、细胞体、碳质材料和其混合物。在特定实施例中，金属是铝(Al)、铂(Pt)、钯(Pd)或镁(Mg)。在特定实施例中，金属氧化物选自二氧化硅(SiO

术语“金属有机框架”或“MOF”是指包括与有机配体配位的金属离子或簇的化合物。中心金属元素可以是选自由以下组成的组的至少一个：锌(Zn)、钴(Co)、镉(Cd)、镍(Ni)、锰(Mn)、铬(Cr)、铜(Cu)、镧(La)、铁(Fe)、铂(Pt)、钯(Pd)、银(Ag)、金(Au)、铑(Rh)、铱(Ir)、钌(Ru)、铅(Pb)、锡(Sn)、铝(Al)、钛(Ti)、钼(Mo)、钨(W)、钒(V)、铌(Nb)、钽(Ta)、钪(Sc)、钇(Y)、镓(Ga)、锗(Ge)、铟(In)、铋(Bi)、硒(Se)和锑(Sb)。有机配体可以包含可连接到至少两个金属离子的官能团。

“细胞膜”是指在细胞周围形成连续屏障的脂质双层。本发明的颗粒可以由原核或真核细胞膜形成。

如本文所使用的，“细胞体”是指含有被细胞质和质膜包围的遗传材料的细胞部分。

术语“聚合物囊泡”是指由两亲性合成嵌段共聚物制成的人工囊泡。

术语“蛋白体”是指由自组装蛋白质或蛋白-聚合物缀合物构成的颗粒。

在特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，颗粒由介孔二氧化硅制成。如本文所使用的，“介孔二氧化硅”是指具有规则布置的中等大小的孔的多孔二氧化硅，具体地，所述孔为2nm到50nm，并且更具体地，为4nm到约40nm。

在第一方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，酶选自由以下组成的组：氧化还原酶、水解酶和裂解酶。在更特定的实施例中，酶选自由以下组成的组：葡萄糖氧化酶、尿素酶、过氧化氢酶、谷氨酸氧化酶、黄嘌呤氧化酶、过氧化物酶、胆红素氧化酶、脂肪酶、蛋白酶和其组合。在更特定的实施例中，酶是尿素酶。术语尿素酶(EC 3.5.1.5)是指使尿素催化水解为二氧化碳和氨的一组酶。在本发明的特定实施例中，尿素酶来自洋刀豆(Canavalia ensiformis)(CAS编号9002-13-5)。在更特定的实施例中，其是来自洋刀豆(CAS编号9002-13-5)的IX型尿素酶。酶的序列可以在各种数据库中找到，如Uniprot(P07374 UREA_CANEN，1994年01月02日更新)。

在第一方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，异源分子选自由以下组成的组：靶向分子、标记分子、纳米传感器和分子门。

在第一方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，异源分子是抗体。在更特定的实施例中，抗体是抗癌抗体。在更特定的实施例中，抗癌抗体结合膜受体。在更特定的实施例中，膜受体是选自由FGFR1、FGFR2、FGFR3和FGFR4组成的组的FGFR(成纤维细胞生长因子受体)。在更特定的实施例中，FGFR是FGFR3。

在第一方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，异源分子是纳米传感器。本领域技术人员可用许多纳米传感器(Campuzano S.等人,“使用电化学推进的纳米马达进行运动驱动的感测和生物感测(Motion-driven sensingand biosensing using electrochemically propelled nanomotors)”,《分析家(Analyst.)》2011,第36(22)卷,第4621-30页)。在特定实施例中，纳米传感器是DNA纳米开关。DNA纳米开关是包括与荧光团-淬灭剂对偶联的单链DNA分子的分子络合物。在特定实施例中，DNA纳米开关的DNA分子的序列与SEQ ID NO:1具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。

在特定实施例中，纳米传感器是纳米颗粒。在更特定的实施例中，纳米传感器是金属纳米颗粒。更具体地，金属纳米颗粒是金(Au)纳米颗粒。本领域技术人员将理解，形成纳米传感器的纳米颗粒必须小于形成纳米马达的纳米颗粒或微粒。

在本发明中，术语“同一性”是指当序列最佳比对时在两个序列中相同的残基的百分比。如果在最佳比对中，第一序列中的位置被与在第二序列中的对应位置相同的氨基酸残基占据，则序列相对于所述位置表现出同一性。两个序列之间的同一性水平(或“序列同一性百分比”)被测量为序列共有的相同位置的数量相对于序列大小的比率(即，序列同一性百分比＝(相同位置的数量)/位置总数)×100)。

用于快速获得最佳比对和计算两个或更多个序列之间的同一性的多种数学算法是已知的，并且被并入到多个可用的软件程序中。此类程序的实例包含用于氨基酸序列分析的MATCH-BOX、MULTAIN、GCG、FASTA和ROBUST程序以及其它程序。优选的软件分析程序包含ALIGN、CLUSTAL W和BLAST程序(例如，BLAST 2.1、BL2SEQ及其更高版本)。

对于氨基酸序列分析，在确定同一性时使用权重矩阵，如BLOSUM矩阵(例如，BLOSUM45、BLOSUM50、BLOSUM62和BLOSUM80矩阵)、Gonnet矩阵或PAM矩阵(例如，PAM30、PAM70、PAM120、PAM160、PAM250和PAM350矩阵)。

BLAST程序通过将所选序列相对于数据库(例如，GenSeq)中的多个序列进行比对，或者通过在两个所选序列之间用BL2SEQ进行比对，来提供对至少两个氨基酸序列的分析。优选地，通过如DUST或SEG程序等低复杂度过滤程序来修改BLAST程序，所述低复杂度过滤程序优选地被集成到BLAST程序操作中。如果使用空位存在罚分(或空位评分)，则空位存在罚分优选地设置介于约-5与-15之间。类似的空位参数可以适当地与其它程序一起使用。BLAST程序和作为其基础的原理进一步描述于例如Altschul等人,“基本局部比对搜索工具(Basic local alignment search tool)”,1990,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》,第215卷,第403-410页中。

对于多序列分析，可以使用CLUSTAL W程序。期望使用“动态”(对“快速”)设置运行CLUSTAL W程序。根据序列之间的同一性水平，使用一组可变的BLOSUM矩阵评估氨基酸序列。CLUSTAL W程序和基本操作原理进一步描述于例如Higgins等人,“CLUSTAL V：用于多序列比对的改进软件(CLUSTAL V:improved software for multiple sequencealignment)”,1992,CABIOS,8(2),第189-191页中。

在第一方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，纳米马达进一步包括货物。在特定实施例中，货物选自由药物组成的列表，其中药物选自由以下组成的组：小分子、核酸、治疗性酶、肽、蛋白质或激素。对于“货物”，应理解为在纳米马达内运输的要递送到期望的靶标处的任何分子。取决于颗粒的表面材料和孔隙度，货物可以位于颗粒内部或吸附到其表面。

在特定实施例中，药物是细胞毒性药物。更具体地，其是抗癌药。

在第一方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，酶和异源分子直接或通过接头附着到颗粒表面。在更具体的实施例中，接头选自由以下组成的组：酸酐、醇、酸、胺、环氧树脂、异氰酸酯、硅烷、卤代基团和可聚合基团，优选地3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)。在甚至更特定的实施例中，接头是戊二醛。

在此方面，接头的一部分与颗粒的表面结合，并且接头的另一部分与酶或异源分子结合，由此在酶或异源分子与表面之间形成共价键。接头与所述表面与所述酶或异源分子之间的键受到接头与酶或异源分子之间发生的化学反应的影响，由此确保表面与所述酶或异源分子之间的共价键。在一个实施例中，在对颗粒的所述表面进行化学预处理之后，将酶和/或异源分子附着到颗粒的表面。

如上所述，在第二方面中，本发明提供了一种药物组合物，其包括治疗有效量的第一方面的纳米马达，以及药学上可接受的赋形剂和/或载体。

本文所使用的表达“治疗有效量”是指纳米马达在施用时足以预防所解决的疾病或病症的症状中的一种或多种症状的发展或在某种程度上对其进行减轻的量。当然，根据本发明施用的试剂的具体剂量将由围绕病例的具体情况确定，包含施用的纳米马达、施用途径、所治疗的具体病状以及类似的考虑因素。

表达“药物组合物”涵盖旨在用于人以及用于非人动物(即，兽医用组合物)的两种组合物。

术语“药学上可接受的载体或赋形剂”是指药学上可接受的材料、组合物或媒剂。在与药物组合物的其它成分相容的意义上，每种组分必须是药学上可接受的。它还必须适用于以合理的受益/风险比与人和非人动物的组织或器官相接触，而不产生过度的毒性、刺激、过敏反应、免疫原性或其它问题或并发症。

合适的药学上可接受的赋形剂的实例是溶剂、分散介质、稀释剂或其它液体媒剂、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。除非任何常规的赋形剂介质与某种物质或其衍生物不相容，如通过产生任何不期望的生物学作用或以其它有害的方式与药物组合物的任何其它一种或多种组分进行相互作用，否则设想其将在本发明的范围内使用。

本发明的药物组合物中的纳米马达、药学上可接受的赋形剂和/或任何另外的成分的相对量将根据所治疗的受试者的同一性、大小和/或病状，以及进一步地根据组合物所施用的途径而变化。

在药物组合物的制造中使用的药学上可接受的赋形剂包含但不限于惰性稀释剂、分散和/或造粒剂、表面活性剂和/或乳化剂、崩解剂、结合剂、防腐剂、缓冲剂、润滑剂和/或油。根据调配者的判断，组合物中可以存在赋形剂，如着色剂、包衣剂、甜味剂和调味剂。

含有本发明的纳米马达的药物组合物可以以任何剂型存在，例如，固体或液体，并且可以通过任何合适的途径施用，例如，口服、肠胃外、直肠、局部、鼻内或舌下途径，因为所述药物组合物将包含调配物的期望的剂型所必需的药学上可接受的赋形剂，例如，局部调配物(软膏、乳膏、脂凝胶、水凝胶等)、滴眼剂、气雾剂、可注射溶液、渗透泵等。

示例性稀释剂包含但不限于碳酸钙、碳酸钠、磷酸钙、磷酸二钙、硫酸钙、磷酸氢钙、磷酸钠、乳糖、蔗糖、纤维素、微晶纤维素、高岭土、甘露醇、山梨醇、肌醇、氯化钠、干淀粉、玉米淀粉、糖粉和其组合。

示例性制粒剂和/或分散剂包含但不限于马铃薯淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、羟基乙酸淀粉钠、粘土、海藻酸、瓜尔胶、柑橘渣、琼脂、膨润土、纤维素和木材产物、天然海绵、阳离子交换树脂、碳酸钙、硅酸盐、碳酸钠、交联聚乙烯吡咯烷酮(交聚维酮)、羧甲基淀粉钠(羧甲淀粉钠)、羧甲基纤维素、交联羧甲基纤维素钠(交联羧甲纤维素)、甲基纤维素、预胶凝淀粉(淀粉1500)、微晶淀粉、水不溶性淀粉、羧甲基纤维素钙、硅酸镁铝(维格姆(Veegum))、月桂基硫酸钠、季铵化合物和其组合。

示例性结合剂包含但不限于淀粉(例如，玉米淀粉和淀粉糊)；明胶；糖(例如，蔗糖、葡萄糖、右旋糖、糊精、糖蜜、乳糖、乳糖醇、甘露糖醇)；天然和合成树胶(例如，阿拉伯胶、海藻酸钠、爱尔兰苔藓提取物、潘瓦尔胶、加蒂胶、伊萨波尔豆壳的粘液、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、微晶纤维素、醋酸纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、硅酸铝镁(维格姆)和落叶松阿拉伯半乳聚糖)；海藻酸盐；聚氧化乙烯；聚乙二醇；无机钙盐；硅酸；聚甲基丙烯酸酯；蜡；水；醇；以及其组合。

示例性防腐剂可以包含抗氧化剂、螯合剂、抗微生物防腐剂、抗真菌防腐剂、醇防腐剂、酸性防腐剂和其它防腐剂。示例性抗氧化剂包含但不限于α生育酚、抗坏血酸、抗坏血酸棕榈酸酯、抗坏血酸硬脂酸酯、抗坏血酸油酸酯、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、单硫代甘油、焦亚硫酸钾、丙酸、没食子酸丙酯、抗坏血酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠以及亚硫酸钠。示例性螯合剂包含乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸一水合物、依地酸二钠、依地酸二钾、依地酸、富马酸、苹果酸、磷酸、依地酸钠、酒石酸和依地酸三钠。

示例性缓冲剂包含但不限于柠檬酸盐缓冲溶液、乙酸盐缓冲溶液、磷酸盐缓冲溶液、氯化铵、碳酸钙、氯化钙、柠檬酸钙、葡乳醛酸钙、葡庚糖酸钙、葡萄糖酸钙、D-葡萄糖酸、甘油磷酸钙、乳酸钙、丙酸、戊酮酸钙、戊酸、磷酸氢钙、磷酸、磷酸三钙、磷酸氢氧化钙、乙酸钾、氯化钾、葡萄糖酸钾、钾混合物、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸钾混合物、乙酸钠、碳酸氢钠、氯化钠、柠檬酸钠、乳酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸钠混合物、氨丁三醇、氢氧化镁、氢氧化铝、海藻酸、无热原水、等渗盐水、林格氏溶液、乙醇和其组合。

示例性润滑剂包含但不限于硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸、二氧化硅、滑石、麦芽、山嵛酸甘油酯、氢化植物油、聚乙二醇、苯甲酸钠、乙酸钠、氯化钠、亮氨酸、月桂基硫酸镁、月桂基硫酸钠和其组合。

如前所述，本发明在第三方面还提供了本发明的纳米马达或药物组合物，其用于治疗、诊断或预后。

尿素酶推进的纳米马达不仅能够在液体介质(如尿液)中移动，而且能够在粘性介质(如透明质酸)中移动。此外，其还活跃于粘液分泌物中。因此，本发明的纳米马达可以用于液体和粘性组织两者中，如在眼睛的房水中。

在第三方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，第一方面的纳米马达或第二方面的药物组合物用于治疗癌症。

此实施例也可以调配成第一方面的纳米马达或第二方面的药物组合物的用途，其用于制造用于治疗和/或预防癌症的药物。此方面也可以调配成一种用于治疗和/或预防癌症的方法，方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的第一方面的纳米马达或第二方面的药物组合物。

可以用本发明的纳米马达或药物组合物治疗的癌症的说明性非限制性实例包含尽管不限于乳头状瘤、腺瘤、脂肪瘤、骨瘤、肌瘤、血管瘤、痣、成熟畸胎瘤、癌、肉瘤、未成熟畸胎瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、白血病、霍奇金氏淋巴瘤、基底细胞癌、脊柱瘤、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、前列腺癌、结肠癌、胰腺癌、肾癌、食道癌、肝癌、头颈癌等。在第三方面的特定实施例中，癌症是膀胱癌。

根据本文提供的数据，本领域技术人员将理解，本发明的纳米马达和药物组合物还可以用于治疗其它疾病，如代谢性疾病、神经性疾病和炎性疾病。

如上所述，在第五方面中，本发明提供了一种检测分离的样品中的分析物的体外方法，所述体外方法包括使根据第一方面所述的纳米马达与样品接触。本领域技术人员将理解，本发明的纳米马达可以通过用所述分析物的传感器进行官能化而适于检测不同的分析物。

在第五方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，样品是生物分离的样品。更具体地，生物分离的样品是血液、血浆或血清。

如上所述，在第六方面中，本发明提供了根据第一方面所述的纳米马达在体外方法中的用途，所述纳米马达用于检测分离的样品中的分析物。

在第五或第六方面的特定实施例中，任选地与上文或下文提供的实施例中的任何实施例组合，样品是液体样品。如前所述，发明人的纳米马达能够在具有各种粘度的液体中移动。例如，其可以在尿液中移动，所述尿液的运动粘度为：在20℃下为1.0700cSt(通过Inman等人,“温度和尿液成分对尿液粘度的影响及其与膀胱高热治疗的相关性(Theimpact of temperature and urinary constituents on urine viscosity and itsrelevance to bladder hyperthermia treatment)”,《国际高热杂志(Int JHyperthermia)》,2013,第29(3)卷,第206-10页进行测量)以及在滑膜液中存在的浓度下的透明质酸中移动(1mg/ml，针对1到10Hz的剪切速率范围，为10-2Pa

本发明的纳米马达对于检测多种分析物(如污染物或生物标志物)特别有用。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包括”和词语的变体并不旨在排除其它技术特征、添加剂、组分或步骤。此外，词语“包括”涵盖“由……组成”的情况。通过阅读说明书，本发明的另外的目的、优点和特征对于本领域技术人员来说将变得显而易见，或者可以通过本发明的实践来学习。通过说明的方式提供以下实例和附图，并且它们并非旨在限制本发明。与附图相关的附图标记和位于权利要求中的括号中的附图标记仅用于试图提高权利要求的理解性，并且不应被解释为限制权利要求的范围。此外，本发明涵盖本文所述的具体和优选实施例的所有可能组合。

实例

1.用尿素酶驱动的纳米马达靶向3D膀胱癌球体

1.1.方法

乙醇(EtOH，99％)、甲醇(MeOH，99％)、盐酸(37％于水中)、氢氧化铵(25％于水中)、正硅酸四乙酯(TEOS，99％)、三乙醇胺(TEOA，99％)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，99％)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES，99％)、戊二醛(GA，25％于水中)、尿素酶(来自洋刀豆，IX型，粉末，50 000-100 000单位/克的固体)、尿素酶活性测定试剂盒(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))、尿素(99.9％)、甘油(99％)、硼氢化钠粉末(NaBH

使用JEOL JEM-2100显微镜捕获透射电子显微镜(TEM)图像。使用FEI NOVANanoSEM230在10kV下捕获扫描电子显微镜(SEM)图像。使用与Atlas细胞增压系统耦接的Wyatt

介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNP)的合成：使用溶胶-凝胶法制备MSNP。简而言之，将含有CTAB(570mg)、TEOA(35g)和水(20mL)的溶液在硅油浴中加热到95℃。将此混合物搅拌30分钟，并且然后逐滴添加TEOS(1.5mL)。将混合物在95℃下进一步搅拌2小时。通过离心收集产生的颗粒，并用乙醇洗涤(3次，1350g，10分钟)。然后，将颗粒悬浮于MeOH:HCl混合物(30mL，10:0.6)中，并且在80℃下回流24小时，以从MSNP的孔中去除CTAB。最后，通过离心收集颗粒，并在乙醇中洗涤(3次，1350g，10分钟)，每次离心之间超声处理20分钟。收集等分试样(0.5mL)，离心并风干以测定MSNP悬浮液的浓度。

MSNP(MSNP-NH

用抗FGFR3抗体(MSNP-Ur/PEG-Ab)对聚乙二醇化尿素酶纳米马达进行官能化：将纳米马达悬浮于PBS(2mg/mL)中，并添加抗FGFR3抗体(每毫克纳米马达30μg抗体)。然后将混合物在室温下在旋转振荡器中温育过夜。最后，通过离心(1340g，10分钟)收集抗体修饰的纳米马达，并用PBS洗涤三次，并在超声处理3分钟时嵌入洗涤。流体动力学半径和表面电荷分析：与ATLAS增压器耦接的Wyatt Mobius DLS用于表征MSNP、MSNP-NH

MSNP上尿素酶和抗体量的定量：根据制造商的说明，使用来自赛默飞世尔科技公司的BCA蛋白质测定试剂盒测量存在于MSNP-Ur/PEG上的尿素酶的浓度。此试剂盒使蛋白质的数量与通过肽键减少的铜相关。针对MSNP-Ur/PEG-Ab重复相同的程序，以定量与纳米马达结合的抗体的量。

尿素酶活性测定：使用商业试剂盒评估了尿素酶与MSNP结合时的酶促活性，所述试剂盒测定了通过Berthelot方法产生的氨的浓度(Patton,C.J.等人,“用于测定氨的Berthelot反应的分光光度和动力学研究(Spectrophotometric and KineticsInvestigation of the Berthelot Reaction for the Determination of Ammonia)”,《分析化学(Anal.Chem.)》,1977,第49卷,第464-469页)。纳米马达的浓度为0.5mg/mL，并根据制造商的说明进行了实验。

将用Cy3:尿素酶(22mg)标记的尿素酶溶解于1mL碳酸氢钠缓冲液(100mM)中。接着，将7μL Cy 3于DMSO中的溶液(5mM)添加到尿素酶溶液中，并将混合物在室温下温育4小时，并在黑暗中振荡。然后将标记的尿素酶溶液透析(3.5kD孔膜)24小时，以消除未反应的Cy3分子。

对由MSNP-Ur/PEG产生的氨进行定量：使用滴定法对由纳米马达产生的氨进行定量。为此，将纳米马达以不同的尿素浓度(12.5、25、50、100、200和300mM)进行温育，并在不同的时间点(5分钟、15分钟、60分钟、120分钟、240分钟和24小时)对样品进行分析。在每个时间点，将纳米马达的悬浮液离心，并使用对硝基苯酚作为指示剂，使用HCl(10mM)滴定上清液。

纳米马达的光学视频记录和MSD分析：使用配备有63

MSD(Δt)＝〈(x_i(t+Δt)-x_i(t))^2〉对于2D分析，i＝2。

此后，通过将MSD数据拟合为等式2来获得扩散系数(D

FGFR3跨膜蛋白在3D RT4细胞培养物中的免疫染色：将上述3D培养物用PBS 1x洗涤3次。然后，用移液管尖端轻轻刮擦孔的表面，并将培养物悬浮于试管中的McCoy培养基中。将试管短暂旋转并去除上清液。接下来，将细胞悬浮于甲醛(3.7％)中，放置于8孔培养皿中，并在室温下温育15分钟。随后，将培养物用PBS 1x洗涤，添加PBS-BSA溶液(5％)，并将培养皿在室温下温育40分钟。然后，将抗FGFR3以1:50的比例添加到培养物中，并将培养皿在37℃下，5％CO

细胞毒性测定：使用阿尔玛蓝测定(Alamar blue assay)对RT4 3D培养物的活力进行了定量，并按照制造商的说明使用活/死活力试剂盒进行了可视化。为此，如上所述培养RT4细胞，并将其在以下每种处理的情况下的第7天进行温育-氨(1mM、1.5mM、3mM、5mM、10mM和20mM，持续24小时)、尿素(25mM、30mM、40mM和50mM，持续24小时)、MSNP-Ur/PEG(12.5μg/mL，在尿素浓度范围为25mM、30mM、40mM和50mM的情况下，分别持续1小时、2小时和4小时)。之后，将培养物用培养基洗涤，静置24小时，并根据制造商的说明对活力进行了研究。

此外，还在48小时的时间点评估了活力。

RT4 3D培养物和纳米马达的成像：在第7天，将3D细胞培养物在每种处理的情况下(MSNP-Ur/PEG或MSNP-Ur/PEG-Ab，12.5μg/mL)温育4小时。在每个时间点，将培养物洗涤并在37℃下和5％CO2的气氛中静置24小时。然后，将培养物标记为WGA 647(膜)，并使用配备有63×物镜和振镜台的倒置荧光显微镜以及针对罗丹明、FITC、DAPI和Cy5的过滤管进行成像。

1.2.结果和讨论

使用溶胶-凝胶化学法制备了全介孔二氧化硅纳米颗粒(MSNP)，其中十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)用作致孔剂，并且三乙醇胺(TEOA)用作碱催化剂。经制备的MSNP通过扫描电子显微镜(SEM)表征。SEM分析揭示样品具有良好的单分散性(多分散性指数＝0.114)，并且平均直径为481±2nm(N＝150，平均大小±平均值的标准误差(SE))。此外，通过透射电子显微镜评估了MSNP的多孔结构。TEM证实了明显的径向孔隙度。通过快速傅立叶变换进一步证实了此晶体构型，其表明了多孔图案的周期性。通过使用Brunauer-Emmett-Teller分析(BET)方法进行氮吸附/解吸研究了纳米颗粒的表面积。MSNP显示出IV型等温线，典型的是介孔二氧化硅结构，并且BET比表面积为1184.8m

然后通过使用氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)将产生的颗粒用胺基官能化。MSNP的表面上的胺基稍后被戊二醛(GA)活化，所述戊二醛充当颗粒与尿素酶和异双官能聚乙二醇(PEG)分子之间的接头(图1A)。使PEG的末端硫醇基与靶向部分，抗成纤维细胞生长因子3(anti-FGFR3)偶联。

官能化步骤之后是动态光散射(DLS)和电泳迁移率分析，以分别获得流体动力学半径和表面电荷。合成后的MSNP的DLS分析显示出宽峰，从而表明悬浮液中存在聚集体。MSNP的电泳迁移率分析表明表面电荷为-26.81±0.35mV(N＝9，平均值±SE)，通常用于二氧化硅纳米颗粒。表面电荷显著变化为强正值(33.6±1.0mM，N＝9，平均值±SE)，证明了胺的成功官能化，这表征了表面上存在游离胺基。胺官能化MSNP(MSNP-NH

随后的官能化步骤涉及尿素酶和酶两者与异双官能PEG的偶联。通常，PEG用作间隔子或通过在颗粒之间提供空间位阻来防止悬浮液中的聚集的方式。通过DLS分析证实了对MSNP-Ur/PEG的胶体稳定性的此影响，其中观察到了尖锐的单个群峰。此外，通过将PEG外端处的游离巯基与抗体的半胱氨酸残基连接，PEG分子允许抗体与纳米颗粒缀合。由于存在于重链恒定区上的半胱氨酸残基含量高，所以此方法对IgG抗体的结合提供了更高的特异性(图1A)。还通过DLS分析了MSNP-Ur/PEG与抗FGFR3抗体(MSNP-Ur/PEG-Ab)的缀合，并且观察到的单峰表明抗体的存在不影响溶液中颗粒的稳定性。已经使用基于蛋白质的肽键对铜的还原作用来定量蛋白质的试剂盒证实了MSNP的表面上的尿素酶以及抗体的存在，并评估在与纳米马达结合后的尿素酶的酶活性。

遵循以下等式，MSNP-Ur/PEG和MSNP-Ur/PEG-Ab的表面上存在的尿素酶使尿素生物催化转化为氨和二氧化碳：

(NH

通常，在微米/纳米结构(例如，Janus颗粒)上引起几何不对称，以产生不对称力，这是在低雷诺数下产生运动的重要的要求。然而，最近，据报道对于通过生物催化转化、酶的分子不平衡分布推进的马达足以产生要产生净运动所需的不对称性。然而，据报道先前的研究是针对微米级马达的。这项工作中报道的MSNP-Ur/PEG和MSNP-Ur/PEG-Ab纳米马达依靠这种固有的不对称性来实现纳米级马达的自推进。在存在一定范围的尿素浓度(0mM、12.5mM、25mM、50mM、100mM、200mM和300mM)的情况下，评估MSNP-Ur/PEG和MSNP-Ur/PEG-Ab在模拟尿液中的运动曲线。其使用光学跟踪技术获得纳米马达的跟踪轨迹(图2A和B)，然后用于计算均方位移(MSD)。图2C显示了模拟尿液中尿素酶/PEG纳米马达和抗体修饰的纳米马达的典型MSD。观察到，MSD随时间呈线性增长，这是扩散运动的特性，并且通过将MSD拟合为以下等式，获得了每个给定条件下的有效扩散系数：

MSD(Δt)＝4D

其中D

图2D示出了MSNP-Ur/PEG和MSNP-Ur/PEG-Ab两者的经计算的有效扩散系数，证明在50mM尿素浓度下扩散显著增加(p<0.001)。扩散系数随模拟尿液中尿素浓度的增加而进一步增加，达到平台期。随着尿素浓度的增加，扩散的增加可以与尿素酶Michaelis-Menten动力学有关，其遵循以下等式：

其中V

通过使用人膀胱移行细胞乳头状瘤RT4细胞的3D培养物(球体)研究了纳米马达的运动所需的底物(尿素)的体外生物相容性和生物催化的副产物(氨)。通过将RT4细胞接种在涂覆有Matrigel

尿素表现出良好的生物相容性，即使在研究的最高浓度下也不会影响球体活力，而氨则随浓度的增加而显示出增加的细胞毒性趋势。然而，在测试的所有氨浓度下，球体仍保持活力(>70％的活力)。

进一步研究了在一定范围的尿素浓度和不同的温育时间段中，当暴露于纳米马达(MSNP-Ur/PEG)时的球体的活力。将球体与12.5μg/mL裸露的纳米马达或抗体修饰的纳米马达在0mM、25mM、30mM和40mM尿素下一起温育1小时、2小时和4小时。接下来，将培养物用培养基彻底洗涤以去除纳米马达和未催化的尿素，并在分析前静置24小时。使用

为了更好地理解氨对在球体上观察到的细胞毒性作用的贡献，研究了在不同的尿素浓度下，纳米马达在定义的时间段内产生的氨的有效浓度。将12.5μg/mL纳米马达与一定范围的尿素浓度(0mM、12.5mM、25mM、50mM、100mM、200mM和300mM)一起温育，并使用对硝基苯酚作为pH的指示剂。由于纳米马达将尿素转化为氨和二氧化碳会导致pH急剧上升，因此，由于对硝基苯酚的存在，含有纳米马达的溶液会变成黄色，并根据以下等式，可以用HCl滴定以量化存在的氨含量：

NH

发现在此浓度的纳米马达下，达到的最大氨输出为17mM，发现所述氨与膀胱癌球体具有生物相容性(对于20mM氨，其活力>70％)。然而，与纳米马达和尿素一起温育后，观察到的细胞毒性作用比游离氨更强。此结果可能是由于球体附近的纳米马达在局部产生更高浓度的氨而产生的，从而导致更高的细胞毒性。

考虑到纳米马达增强的扩散能力和生物相容性，随后研究了其靶向和渗透到膀胱癌球体中的潜力(图4)。首先，通过免疫细胞化学验证了靶向抗原(FGFR3)在膀胱癌球体的表面上的表达，技术用于通过荧光标记的抗体视觉上检测特异性蛋白质在样品上的位置。膀胱癌球体的免疫细胞化学在细胞膜上显示出绿色荧光，从而证实了存在跨膜蛋白FGFR3，并且蓝色表示用Hoechst标记的细胞核。

然后研究了纳米马达穿透膀胱癌球体的能力，以及靶向部分的存在对内化效率的影响。此外，在存在40mM尿素的情况下通过将球体与裸露的纳米马达或抗体修饰的纳米马达一起温育，评估了主动运动对内化效率的影响。为此，在其官能化到MSNP-NH

考虑到所使用的抗体在与抗原结合时会阻断细胞的FGF信号传导途径，因此通过分析细胞增殖进一步研究了抗体修饰的纳米马达的潜在治疗效果(插图4)。为此，使用无抗体的纳米马达作为对照物，将膀胱癌球体与MSNP-Ur/PEG-Ab在有以及没有尿素的情况下温育4小时。之后，洗涤球体以去除未催化的尿素和未内化的纳米马达，并在48小时静置时间段之后使用阿尔玛蓝测定测量增殖。观察到，用裸露的纳米马达(无抗体)温育的球体维持了在24小时观察到的活力水平，而用抗体修饰的纳米马达温育的球体的活力降低了，表明细胞增殖被阻止。这些结果指向携带抗FGFR3抗体的纳米马达作为靶向膀胱癌治疗工具的适用性。

1.3.结论

开发了由尿素酶驱动的包括PEG的纳米马达，其中PEG既是防止聚集的位阻，又是在纳米马达表面连接特异性膀胱癌抗体(抗FGFR3)的接头。具有以及不具有抗体的纳米马达在膀胱中存在的一定范围的尿素浓度下，在模拟尿液中呈现出扩散增强，这可以使其用于此器官的生物医学应用。已经证明，与传统的2D培养物相比，使用人膀胱癌细胞衍生的球体(3D培养物)，这些酶促纳米马达的底物依赖性诱导的毒性被认为更好地模拟了肿瘤环境。在类似于膀胱排尿间隔的时间段内监测内化现象，并观察到主动运动使纳米马达的穿透力增强了3倍。此外，活性抗体修饰的纳米马达表现出的内化效率比没有抗体的活性纳米马达的内化效率高4倍，从而反映了自推进的影响，并靶向活性颗粒穿透球体的能力。对球体的细胞增殖研究表明，与裸露的纳米马达(不含抗体)相比，靶向的纳米马达诱导更高的活力丧失，表明抗FGFR3的治疗效果可能来自细胞增殖的抑制和较高的纳米马达内化率两者。这些结果指向这种抗体修饰的纳米马达作为靶向膀胱癌治疗工具的潜力，因为通过主动运动增强了颗粒的靶向能力，从而提高了抗FGFR3抗体的治疗效果。

2.用DNA纳米开关修饰的酶驱动的微型马达用于局部pH监测

2.1.材料和方法

未经修饰且荧光团标记的DNA寡核苷酸通过IBA GmBH(德国哥廷根(Gottingen,Germany))合成和纯化(HPLC纯化)，并且无需进一步纯化即可使用。DNA构建体的序列报告如下。

pH响应性DNA纳米开关

氨基修饰的DNA支架

5'-GACAGACAGACAGACAAGGA-NH

对照开关

对于以上所有序列，粗体的碱基表示双链体部分的环，并且带下划线的碱基表示平行三链体区域的环。pH响应性DNA纳米开关和对照开关两者都具有与氨基修饰的DNA支架完全互补(20个碱基)的部分(此处为斜体)。

将所有DNA低聚物(100μM)储存在1x PBS中。

在Cary Eclipse荧光计(瓦里安公司(Varian))上进行荧光测量，将激发波长设置为λ

比率计FRET计算如下：

其中F

其中Rat.FRET

通过先前报道的共缩聚方法将基于聚苯乙烯(PS)的商用2μm颗粒(西格玛奥德里奇公司，目录号78452)用于二氧化硅壳(参见Ma Xing《ACS纳米》2016)。简而言之，将250μL聚苯乙烯颗粒(储备溶液，10％固体)与0.5mL的99％乙醇(Panreac Applichem，目录号131086-1214)、0.4mL的Milli-Q水和25ul氢氧化铵(西格玛奥德里奇公司，目录号221228)混合。将混合物在室温(RT)下搅拌5分钟。然后，将2.5μL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)(西格玛奥德里奇公司，目录号440140)99％添加溶液中，在搅拌和室温下温育6小时。接下来，添加≥99％的7.5μl正硅酸四乙酯(TEOS)(西格玛奥德里奇公司，目录号86578)，并使所得混合物在磁力搅拌下在RT下反应过夜。通过将其在3500rpm下离心3.5分钟，将所得的由涂覆有二氧化硅壳的聚苯乙烯组成的微粒在乙醇中洗涤三次。然后，通过以下来去除聚苯乙烯芯：在15分钟期间在≥99.8％二甲基甲酰胺(DMF)(阿克洛斯有机物公司(AcrosOrganics)，目录号423640010)中进行4次洗涤来温育颗粒。将所得微胶囊在乙醇中洗涤三次，并在室温下储存直至使用。为了表征微胶囊的大小和形态，进行了扫描电子显微镜(SEM)(FEI NOVA NanoSEM 230)和透射电子显微镜。

将中空二氧化硅微胶囊用尿素酶官能化以使其具有自推进。为此，通过将其在3500rpm下离心3.5分钟用Milli-Q将SiO2微胶囊洗涤三次。之后，在磷酸盐缓冲盐水(PBS，pH＝7.4)(赛默飞世尔科技公司，目录号70011-036)中洗涤三次以上。然后将微胶囊悬浮于2.5％(wt)戊二醛于中的PBS溶液(西格玛奥德里奇公司，目录号G6257)中，并使其在RT下端对端混合3小时。将GA官能化的颗粒在PBS 1x中洗涤3次，并悬浮于含有200μg/ml来自洋刀豆(Jack bean)的尿素酶和1μM DNA支架的PBS溶液(西格玛奥德里奇公司，目录号U4002)中。将所得溶液在端对端混合下保持2小时。然后，在PBS中进行三次洗涤，并将官能化的颗粒保持在4℃下直至使用。

在配备有63×水浸物镜和hammamatsu相机的倒置光学显微镜(Leica DMi8)下，以25帧每秒的速率记录微型马达20秒。对于每种情况，至少记录了15个颗粒。通过基于Phyton的定制代码分析了微型马达的轨迹，这允许通过应用以下等式来计算马达的MSD和速度：

MSD(Δt)＝<(x

通过将MSD拟合为等式1，可以获得速度。

按照制造商的说明，使用尿素酶活性试剂盒(西格玛奥德里奇公司)来测量酶促活性，所述试剂盒基于Barthelot方法，即，通过尿素酶活性测量氨产生的比色测定。首先，将微型马达与100mM尿素一起温育。然后，在不同的时间点按照制造商的说明停止酶促反应。随后，为避免颗粒对测量的干扰，将样品在3500rpm下离心3.5分钟。收集来自每个样品的上清液，并在670nm下测量吸光度，以测定尿素酶活性。

2.2.结果和讨论

根据先前报道的共缩合方法合成表面上的具有胺基的中空二氧化硅微胶囊(Ma,X.等人,“尿素驱动的生物相容性中空微胶囊的运动控制”,《ACS纳米》,2016,第10(3)卷,第3597-3605页)，这是基于使用3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)和正硅酸四乙酯(TEOS)作为二氧化硅前体，将SiO

如实例1所描述的，使用戊二醛(GA)作为接头将尿素酶与微型马达表面共价缀合。在此步骤期间，还缀合了氨基修饰的单链DNA(DNAss，20个碱基)，充当pH响应性DNA纳米开关的锚定部分(图5B)。图5C示出了基于DNA纳米开关的打开/闭合状态的pH感测策略的示意性图示，其分别导致低或高的FRET效率。通过扫描电子显微镜和透射电子显微镜两者(分别为SEM和TEM)研究所得中空微胶囊。图5D示出了SEM显微照片，其中可以观察到微胶囊具有非常单分散的大小(2.04±0.06μm，平均值±平均值的标准误差)和粗糙的表面。如前所报道的，微胶囊在二氧化硅壳的生长期间可能由于颗粒的接近而在其表面上显示出孔，这提供了结构上的不对称性。图5E示出了通过TEM获得的地形图像，其中不同的伪彩色表示高度(以μm为单位)。

在每个步骤之后，通过测量微粒的ζ电位来表征官能化过程(图5F)。首先，由于胺基的存在，微胶囊显示出带正电的表面，然后由于用GA修饰而变为带负电的表面。在添加尿素酶之后，表面电荷略有减少。用尿素酶和DNAss(UR+DNAss)两者进行的官能化也导致相对于GA的ζ电位降低。

最后，将微粒在含有DNA纳米开关(即，1μM)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中温育。将纳米开关与酶/锚定链缀合的马达一起温育15分钟，足以使带有pH响应性纳米开关的二氧化硅颗粒官能化。值得注意的是，开关在序列的5'端处呈现了20个碱基长的侧翼尾巴，所述序列与共价缀合到二氧化硅微胶囊上的DNAss互补。作为缀合的结果，已经测量到表面电荷进一步减少，并且证实了带有开关的马达的有效官能化。还值得注意的是，此处采用的pH响应性DNA纳米开关是形成三链体的单链DNA，其含有通过沃森-克里克和平行胡格斯丁相互作用两者来稳定的分子内DNA发夹。尽管沃森-克里克(W-C)相互作用对pH有效地不敏感，但胡格斯丁相互作用显示出强烈且可编程的pH依赖性(图6A)。通过用FRET对来标记纳米开关，可以监测pH依赖性三链体向双链体的转变，所述转变可以用来测定微型马达附近溶液的pH值。更具体地，花菁3荧光团(Cy3)内部缀合在发夹双链体DNA的环中，并且花菁5荧光团(Cy5)连接在形成三链体的DNA部分的3'端处。

通过变化荧光微量比色皿中缓冲溶液(100μL溶液)的pH在固定浓度(即，50nM)的DNA开关下进行的荧光测定清楚地显示出FRET效率随pH而变化。如所预期的，在酸性pH值下，分子内三链体结构是有利的，并且观察到高FRET效率(使Cy3和Cy5紧密接近)。随着溶液pH增加，三链体结构不稳定，并且观察到由于三链体到双链体转变(展开)而导致FRET信号逐渐降低(图6A)。注意，此处采用的荧光团对所研究的pH范围内(介于pH 5.0到pH 9.5)的pH值不敏感，以避免信号中的任何干扰。重要的是要注意，此类基于三链体的开关显示出的打开/闭合动力学足够快，以允许实时监测pH变化(平均时间常数约100毫秒)。

为了测试与微型马达缀合后的开关的官能化，通过配备63×油浸物镜的Leica-SP5共聚焦激光扫描显微镜(CSLM)监测FRET效率(图6B)。为此，将微型马达悬浮于pH 5或pH9的PBS中，并放置于8孔玻璃底皿中，以在CSLM下进行分析。使用564nm二极管激光器记录供体(Cy3)的发射。通过激发Cy3荧光团并检测接纳体(Cy5)发射来获得FRET图像。使用定制的ImageJ插件，可以通过计算FRET/Cy3比来实现FRET效率的量化。

这些结果表明，DNA纳米开关修饰的微型马达能够检测其周围环境的pH变化。为了证明pH检测的特异性并消除pH对荧光强度的任何影响，微型马达通过对照开关进行了修饰，其不响应pH变化。图6C和6D示出了来自用pH响应性DNA纳米开关(图6C)或非pH响应性DNA纳米开关(图6D)修饰的微型马达的FRET/Cy3发射的定量。具体地，作为非pH响应性探针，选择单链DNA，其含有通过WC相互作用稳定的相同分子内DNA发夹和不允许三链体折叠的加扰DNA尾巴。如所预期的，当使用非pH响应性纳米开关时，在评估的所有pH下均显示出高FRET效率时，没有发现显著差异。

在不存在或存在100mM尿素作为燃料的情况下，通过光学记录分析了用尿素酶和DNA纳米开关双官能化的中空微型马达的运动动力学。为此，使用了配备有63×水浸物镜和Hamamatsu相机的Leica DMi8倒置荧光显微镜。在20秒期间以每秒25帧(FPS)的速率每种情况下记录至少15个微粒。使用基于Python的代码，跟踪微型马达的轨迹，并根据以下等式从轨迹中计算出MSD：

MSD(Δt) ＝< (x

其中对于2D分析，i＝2。在添加尿素底物之后，MSD呈抛物线形状，其对应于活性微粒的推进方案。

然而，在不存在燃料的情况下，观察到仅布朗运动，从而产生线性拟合，表明运动是由微型马达的表面上的催化反应引起的。通过应用以下等式计算得出，发现推进颗粒的速度为6.4±0.6微米/秒(均值±均值的标准误差)：

MSD(t)＝4D

其中D

令人惊讶地，此速度与之前报道的不对称Janus酶驱动的微胶囊的速度(Ma X.等人，同上)相当，并且略高于非Janus微粒的速度(

通过结合光学跟踪和使用CSLM的FRET成像两者，评估了微型马达同时记录在其自推进时产生的局部pH变化的能力，其中以3FPS录制了25秒的视频。在不存在燃料的情况下，观察到的平均FRET/Cy3比为1.8±0.09(均值±均值的标准误差)。当将尿素添加到溶液中时，FRET/Cy3比立即降低到1.5±0.05，表明由于微型马达的活性，pH增加。在记录的25秒期间，未观察到FRET/Cy3比的显著差异。在不存在燃料的情况下，微型马达仅显示布朗运动，并且FRET/Cy3比接近2。相比之下，在微型马达暴露于尿素的情况下，FRET/Cy3比在分析时(0秒)已经降低，表明因为在添加尿素底物后立即发生基于尿素酶的酶促反应，因此pH已发生变化，引起颗粒周围的局部pH变化，所述变化是瞬间检测到的。

这些结果证明了活性的DNA修饰的微型马达感测其周围的微环境，同时产生连续的化学反应以进行自推进的能力。

为了深入了解反应开始时微型马达周围的瞬时pH变化，使用APTES作为涂层剂将微型马达固定在玻璃表面上，以提供正表面电荷并稳定与带负电荷的微型马达的静电相互作用。固定微型马达允许在添加燃料之前和之后对同一微型马达进行可视化，并在较长的时间段(2分钟和10分钟)进行分析，然后才将其排除在所关注的区域之外。

图7A和7B示出了从马达的光学跟踪分别获得的平均MSD和速度。可以清楚地观察到MSD和速度连续下降。感兴趣的是，尽管速度随时间降低，但当发现速度接近于0时，pH持续升高持续10分钟。

这些结果表明，速度的降低并不直接归因于酶活性的降低，并且其它因素，如尿素分解时产生离子产物或酶促反应的不理想的高pH可能影响运动动力学。

DNA开关纳米技术的使用允许在马达的微环境中感测pH，并且当使用诱导pH变化的酶(如尿素酶)时，还可以用于监测其自身的活性。因此，将生物传感工具集成到酶驱动的马达中不仅为其作为传感器的应用提供了新见解，而且还为监测其在微型马达中的固有活动提供了新见解，以了解其运动动力学和机理。另外，DNA和酶的高度多功能性使微型马达的特性得以调整，以用于广泛范围的应用。

2.3.结论

本文提供的数据证明了将DNA技术与生物催化微泳器相组合以产生能够在检测其周围环境时同时进行自推进的主动和智能系统的潜力。通过使用pH敏感的DNA纳米开关和通过共聚焦显微镜进行的FRET成像，可以精确且定量地分析在存在燃料的情况下在微型马达活化后的所述微型马达的表面周围的pH变化。在存在燃料的情况下，在30秒、2分钟和10分钟时，同时分析了微型马达的局部pH变化和运动动力学。pH值不断增加，而速度则呈指数下降，这表明除酶活性以外的其它因素都可能影响微型马达的自推进。

这些结果突显了以精确且定量的方式通过微型马达进行同时感测的相关性，不仅可以监测微环境的变化，而且还可以作为活性指示剂。未来的方向将导致检测细胞内或局部组织的pH变化以及其它分析物。进一步地，此协同技术还将为多官能微型马达打开领域，其中pH变化将触发通过感测作用平台释放货物。

引文列表

Ma,X.等人,“尿素驱动的生物相容性中空微胶囊的运动控制”,《ACS纳米》,2016,第10(3)卷,第3597-3605页。

Patton,C.J.等人,“用于测定氨的Berthelot反应的分光光度和动力学研究”,《分析化学》,1977,第49卷,第464-469页。

Campuzano S.等人,“使用电化学推进的纳米马达进行运动驱动的感测和生物感测”,《分析家》2011,第36(22)卷,第4621-30页。

Altschul等人,“基础局部比对搜索工具”,1990,《分子生物学杂志》,第215卷,第403-410页。

Higgins等人,“CLUSTAL V：用于多序列比对的改进软件”,1992,CABIOS,8(2),第189-191页。

Inman等人,“温度和尿液成分对尿液粘度的影响及其与膀胱高热治疗的相关性”,《国际高热杂志》,2013,第29(3)卷,第206-10页。

Xing MA等人,“尿素驱动的生物相容性中空微胶囊的运动控制”,《ACS纳米》,2016,第10(3)卷,第3597-605页。

Ana C.等人,“酶驱动的纳米机器人增强抗癌药物递送”,《先进功能材料》,2017,第28(25)卷。

序列表

<110> 加泰罗尼亚生物工程基础研究所

加泰罗尼亚高级研究所

<120> 官能化酶驱动的纳米马达

<130> P4851PC00

<150> EP18382896

<151> 2018-12-05

<160> 3

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 65

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 纳米开关

<400> 1

tccttgtctg tctgtctgtc ttttttgaag aaggaattta ttccttcttc gtttgcttct 60

tcctt 65

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 支架

<220>

<221> modified_base

<222> (20)..(20)

<223> 酰胺化（AMIDATION）

<400> 2

gacagacaga cagacaagga 20

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工（Artificial）

<220>

<221>

<222>

<223> 对照开关（Control switch）

<400> 3

tccttgtctg tctgtctgtc tgaacgtttt tcgttc 36