Cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统
文献发布时间：2023-06-19 12:05:39
技术领域
本发明属于基因编辑技术领域，具体涉及一种可以在高等丝状真菌香菇中过表达Cas9蛋白的Cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统。
背景技术
CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short PalindromicRepeats)系统是继ZNF和TALENS技术之后的第三代基因编辑技术，被广泛应用于原核生物以及真核生物细胞水平和个体水平基因编辑细胞系。
CRISPR/Cas9相比其他基因编辑技术，如新指核酸酶(ZFNs)或转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)，操作更简单，同时更容易针对同一细胞中的多个基因位点进行编辑，该系统可成为替代目前基因组工程方法的一种更安全，毒性更低的新方法。
到目前为止CRISPR/Cas已经运用到了各种细胞以及大肠杆菌、酿酒酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、线虫、果蝇、蚕、斑马鱼、非洲爪蟾、小鼠、大鼠、猪、羊等，从最低等的微生物到哺乳动物的基因敲除修饰或突变。另一方面，其强大的基因组编辑能力已经用于生物治疗，如HIV、HBV等RNA病毒引起的疾病治疗研究、单基因或多基因遗传病治疗研究、癌症治疗研究等方面。但在高等丝状担子菌中，由于自身极低的同源重组率，或缺乏相关的质粒体系，难以利用传统的方法开展遗传转化操作的研究，CRISPR/Cas9系统的应用一直发展缓慢。
GPiE-egfp是南京农业大学赵明文教授实验室最早运用的，已在高等丝状真菌灵芝中实现了高等绿色荧光蛋白eGFP的表达。原始载体GPiE-egfp是一个双元表达载体，可利用农杆菌介导的方法，携带目的基因转化至灵芝中，且本身具有潮霉素hyg抗性筛选标签，具体可参见Shi et al.于2012年发表的文章(Shi L,Fang X,Li M,Mu D,Ren A,Tan Q,Zhao M.(2012).Development of a simple and efficient transformation system forthe basidiomycetous medicinal fungus Ganoderma lucidum.World J MicrobiolBiotechnol.28:283–291.doi:10.1007/s11274-011-0818-z.。
发明内容
本发明提供了一种优化的可以在高等丝状真菌香菇中过表达Cas9蛋白的双元表达载体，解决了在香菇中无法表达Cas9蛋白的技术问题。
本发明的目的之一在于提供一种Cas9蛋白双元表达载体，以双元表达载体GPiE-egfp为基础，用优化的Cas9蛋白编码基因替换双元表达载体GPiE-egfp的eGFP编码基因。所述Cas9蛋白双元表达载体还具有能够在大肠杆菌和农杆菌中复制扩增的元件、能够携带外源基因的LB T-DNA和RB T-DNA、和/或灵芝中组成型表达基因gpd的启动子Glgpdp。
所述优化的Cas9蛋白编码基因，如SEQ ID No.1所示包括：
所述Cas9蛋白编码基因的N端包含Glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列，共76个碱基，如SEQ ID No.2所示；经密码子优化，适合在丝状真菌香菇中表达；
所述Cas9蛋白编码基因N端增加如SEQ ID No.3所示的3×FLAG标签序列，以利于后续检测蛋白质表达；
所述Cas9蛋白编码基因N端和C端各增加一个如SEQ ID No.4和SEQ ID No.5所示的核定位信号编码序列NLS，增加cas9基因的核定位能力；
所述Cas9蛋白编目基因C端包含一个35S终止子，如SEQ ID No.6。
改造后获得的GPiE-cas9双元表达载体的碱基序列如SEQ ID No.11所示，图谱如图4所示。
本发明的目的之二在于提供一种构建所述Cas9蛋白双元表达载体的方法，包括如下步骤：
步骤S1，用限制性内切酶BamH I和Pst I酶切原始载体GPiE-egfp质粒，以去除原始载体GPiE-egfp中的eGFP蛋白编码基因序列；
步骤S2，用T4 DNA连接酶连接步骤S1中去除eGFP蛋白编码基因序列的载体大片段与具有粘性末端的人工合成优化的Cas9蛋白编码基因；
其中，所述优化的Cas9蛋白编码基因序列N端包含Glgpd的第一个内含子和第一个外显子的前3个氨基酸编码序列共76个碱基序列、3×FLAG标签序列、同时N端和C端各增加一个核定位信号编码序列NLS、C端包含一个35S终止子。
本发明的目的之三在于提供一种所述的Cas9蛋白双元表达载体的应用，所述应用为所述Cas9蛋白双元表达载体在丝状真菌香菇中过表达Cas9蛋白。
本发明的目的之四在于提供一种含有Cas9蛋白双元表达载体的转化系统，其是将权利要求1～7任一项所述的Cas9蛋白双元表达载体通过农杆菌介导法导入宿主香菇中，并筛选阳性转化子获得。
本发明积极进步效果在于：本发明载体构建简单，优化的Cas9蛋白编码基因包含的元件序列均为人工合成，合成后的片段序列可直接替换原始载体GPiE-eGFP中的eGFP编码基因片段。本发明经密码子优化Cas9蛋白双元表达载体适合在丝状真菌香菇中过表达Cas9蛋白。
附图说明
图1为原始载体GPiE-egfp的结构图谱。
图2为原始载体GPiE-egfp经BamH I和Pst I酶切电泳结果图。
图3为人工合成优化的Cas9蛋白基因编码序列片段电泳结果图。
图4为本发明的Cas9蛋白双元表达载体即重组载体GPiE-cas9的结构图谱。
图5为大肠杆菌GPiE-cas9阳性转化子验证cas9优化基因部分片段的DNA扩增电泳结果图。
图6为重组载体GPiE-cas9经BamH I和Pst I酶切电泳结果图。
图7为香菇单核体阳性转化子验证cas9优化基因部分片段的DNA扩增电泳结果图。
图8为香菇单核体阳性转化子cas9优化基因的mRNA转录水平RT-qPCR检测结果图。
图9为香菇单核体阳性转化子中优化的Cas9蛋白表达水平的Western-blot检测图。
具体实施方式
实施例
一、原始载体改造
1.去除原始载体GPiE-egfp中的eGFP蛋白编码基因序列
GPiE-egfp(图1)用BamH I和Pst I酶切，回收载体片段(约10594bp左右)，如SEQID No.7所示。
具体步骤如下：
(1)用限制性内切酶BamH I和Pst I酶切GPiE-egfp质粒，酶切体系如表1所示，37℃反应2-3h。
表1
(2)酶切后的GPiE-eGFP质粒进行琼脂糖凝胶分离，结果如图2所示，用Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收载体大片段，溶解在30μL的ddH
2.优化的Cas9蛋白表达基因片段的纯化回收
优化的Cas9蛋白表达基因片段序列如SEQ ID No.1所示，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成，提供包含目的片段的pUC57-cas9质粒。用BamH I和Pst I酶切pUC57-cas9质粒，回收目的基因片段(约4570bp左右)。
(1)用限制性内切酶BamH I和Pst I酶切pUC57-cas9质粒，酶切体系如表2所示，37℃反应2-3h。
表2
(2)酶切后的pUC57-cas9质粒进行琼脂糖凝胶分离，用Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收cas9目的基因片段即优化的Cas9蛋白编码基因，片段经琼脂糖凝胶电泳检测后(图3)，溶解在30μL的ddH
二、Cas9蛋白双元表达载体的构建及检测
1.原始载体与目的基因的连接
经过酶切回收的载体GPiE(SEQ ID No.7)和优化的Cas9蛋白编码基因(SEQ IDNo.1)均具有由限制性内切酶BamH I和Pst I双酶切之后形成的黏性末端，可用Takara公司的T4 DNA Ligase进行连接，连接体系如表3所示，16℃反应3h。
表3
2.转化，阳性克隆子检测，送检测序并质粒小提。
(1)转化
1)取100μL的DH5α感受态细胞(上海唯地生物技术有限公司)从-80℃超低温冰箱内拿出，迅速插入冰中，5min后待菌块融化；
2)加入上文中提到的酶切回收的载体GPiE和优化的Cas9蛋白编码基因的20μL连接产物，混匀后在冰浴中静置30min。
3)将感受态细胞置于42℃水浴中热激45s，迅速放回冰中并静置2min。
4)向离心管中加入700μL不含抗生素的无菌LB培养基，混匀后37℃，200rpm复苏60min。
5)5000rpm离心1min收菌，留取100μL左右上清轻轻吹打重悬菌块并涂布到含Kan抗性的抗生素LB固体培养基上。
6)将平板倒置放于37℃培养箱过夜培养。如果进行蓝白斑筛选操作，将平板放37℃培养至少15h。
(2)阳性克隆子检测
挑取连接产物转化培养平板上生长的单菌落，进行单个克隆子的Kan抗性液体培养基的培养，37℃，200rpm振荡培养过夜。然后以克隆子菌液为模版进行菌液PCR，引物为Tcas9F/R，引物序列如表4中的SEQ ID No.8/9所示，菌液PCR体系如表5所示。Tcas9F/R扩增片段为cas9基因中大小为432bp的基因序列，如SEQ ID No.10所示。PCR反应温度和时间设置为：95℃预变性5min；95℃变性30s—56℃退火45s—72℃延伸30s，该步骤重复循环30次；72℃产物充分延伸10min；4℃保存PCR产物。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图5所示，确定能够扩增出位于432bp左右条带的克隆子为阳性克隆子。
表4
表5
(3)送检测序并质粒小提
挑取上一步中提到的能够扩增出检测条带的克隆子，送测序公司进行测序，序列结果与目的基因序列SEQ ID No.10进行比对，测序正确的为阳性克隆子。阳性克隆子菌液扩大培养后，用Axygen公司的质粒DNA小量试剂盒抽提质粒，溶解在70μL的ddH
质粒应为需要构建的GPiE-cas9双元表达载体，结构图谱如图4所示，完整序列如SEQ ID No.11所示，用BamH I和Pst I酶切所抽提质粒，结果如图6所示，酶切后的GPiE载体片段(10528bp)和cas9基因片段(4570bp)均有对等长度的片段。
三、农杆菌介导的GPiE-cas9双元表达载体在香菇单核体中的转化
所用方法借鉴上海市农业科学院食用菌所刘建雨等人的已授权专利《一种以米粒作为培养基质的金针菇转化方法》(ZL 2017 1 0198507.6)和尚晓冬等人的已授权专利《一种以米粒作为培养基质的香菇转化方法》(ZL 20170198506.1)。参考两项专利中介绍的方法，将GPiE-cas9双元表达载体转化至香菇单核体中。转化后，需要进一步筛选成功转化的转化阳性克隆子。
1.GPiE-cas9转化香菇阳性克隆子在基因水平检测cas9基因的复制
1)挑取微量香菇单核体菌丝(0.1-1μg)置于100μL TE buffer。
2)95℃加热10min后，马上置于冰上冷却，用移液器反复吹打，混匀。
3)取1μL上清液作为模板进行PCR，引物同为Tcas9F/R，PCR程序为95℃预变性5min；95℃变性30s—56℃退火45s—72℃延伸30s，该步骤重复循环30次；72℃产物充分延伸10min；4℃保存PCR产物。
4)1％琼脂糖凝胶电泳检测产物条带，结果如图8，确定能够扩增出位于432bp(SEQID No.10)左右条带的克隆子为香菇单核体GPiE-cas9阳性克隆子。
2.香菇单核体GPiE-cas9阳性克隆子在转录水平检测cas9基因的转录
使用TaKaRa公司的MiniBEST Plant RNA Extraction Kit(Code No.9769)试剂盒抽取香菇单核体GPiE-cas9阳性克隆子中cas9基因转录的mRNA水平，然后用TaKaRa公司的PrimeScript
检测香菇单核体GPiE-cas9阳性克隆子中cas9基因转录的mRNA水平的RT-qPCR以在香菇单核体中组成型表达的基因gpd为内参基因，引物为QgpdF/R，如SEQ ID No.12/13所示，见表6，目的片段大小为167bp左右；原始载体GPiE-egfp上本身具有的抗生素筛选标签潮霉素抗性基因hyg为阳性对照(已证明能够在香菇单核体细胞中表达)，引物为QhygF/R，如SEQ ID No.14/15所示，见表6，片段大小为198bp左右；检测cas9基因转录水平的引物重新设计为目的片段为222bp左右的RT-qPCR检测引物Qcas9F/R，如SEQ ID No.16/17，见表6。
表6
利用Roche Applied Science的FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂进行荧光定量PCR，反应体系见表7，反应程序设置为：1)Hold Stage：50℃2min，95℃10min；2)PCR Stage：95℃15s，55℃30s，72℃30s(收集荧光)，循环40次；3)Melt CurveStage：95℃15s，60℃1min，95℃15s(收集荧光)。
表7
RT-qPCR结果经分析后，表明cas9基因在mRNA水平有明显转录，结果如图8所示。
3.香菇单核体GPiE-cas9阳性克隆子在蛋白质水平检测Cas9蛋白的表达
利用上海贝博生物科技有限公司的丝状真菌蛋白提取试剂盒(货号：BB-31367-1)抽提香菇单核体GPiE-cas9阳性克隆子的总蛋白，用Western blot检测Cas9蛋白的表达，步骤如下：
(1)进行SDS-PAGE电泳，点预染Marker(赛默飞，货号：26619)、抽取的香菇单核体GPiE-cas9阳性克隆子的总蛋白和阴性对照，阴性对照为不带3×FLAG标签的Cas9蛋白(TaKaRa，货号：632641)。
(2)选用聚偏氟乙烯膜(PVDF膜)进行转膜，将蛋白胶上的蛋白质分子转移至PVDF膜上。转膜结束后，用封闭液封闭PVDF膜，4℃过夜。
(3)将PVDF膜进行一抗交联，一抗为抗FLAG标签小鼠单克隆抗体(全式金生物，货号：HT201-01)，室温孵育1-2h。
(4)将PVDF膜进行二抗交联，二抗为辣根过氧化物酶标记IgG(全式金生物，货号：HS201-01)，室温孵育1h。
(5)DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(博士德生物，货号：AR1024)对PVDF膜进行显色实验。
Western blot检测香菇单核体GPiE-cas9阳性克隆子中Cas9蛋白的检测结果如图9所示。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> Cas9蛋白双元表达载体及其构建方法、应用和转化系统
<130> P210039
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 4570
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccatgc ccgtgagtcc tgcatcccca tcgtgcaccg tattcacctc atcgtttggc 60
ccccttctca caggtcaagg tcatggacta caaggaccac gacggcgact acaaggacca 120
cgacatcgac tacaaggacg acgacgacaa gatggccccc aagaagaagc gcaaggtcgg 180
catccacggc gtgcccgccg cggacaagaa gtactccatc ggcctggaca tcggcacgaa 240
cagcgtgggc tgggccgtga tcaccgacga gtacaaggtg ccgtccaaga agttcaaggt 300
gctgggcaac accgaccgcc acagcatcaa gaagaacctg atcggcgccc tgctgttcga 360
ctcgggcgag accgccgagg cgacgcgcct gaagcgcacc gcgcgtcgcc gctacacgcg 420
ccgcaagaac cgcatctgct acctccagga gattttcagc aacgagatgg ccaaggtgga 480
cgactcgttc ttccaccgcc tggaggagtc cttcctggtg gaggaagaca agaagcacga 540
gcgccacccc atcttcggca acatcgtgga cgaggtggcc taccacgaga agtacccgac 600
gatctaccac ctgcgcaaga agctggtgga cagcaccgac aaggcggacc tgcgcctgat 660
ctacctggcc ctggcgcaca tgatcaagtt ccgcggccac ttcctgatcg agggcgacct 720
gaaccccgac aactcggacg tggacaagct gttcatccag ctggtgcaga cctacaacca 780
gctgttcgag gagaacccga tcaacgcctc gggcgtggac gccaaggcga tcctgtccgc 840
gcgcctgtcc aagagccgcc gcctggagaa cctgatcgcc cagctgcccg gcgagaagaa 900
gaacggcctg ttcggcaacc tgatcgcgct gagcctgggc ctgacgccga acttcaagtc 960
gaacttcgac ctggccgagg acgcgaagct ccagctgagc aaggacacct acgacgacga 1020
cctggacaac ctgctggccc agatcggcga ccagtacgcg gacctgttcc tggccgcgaa 1080
gaacctgtcg gacgccatcc tgctgtccga catcctgcgc gtgaacaccg agatcacgaa 1140
ggcccccctg tcggcgtcca tgatcaagcg ctacgacgag caccaccagg acctgaccct 1200
gctgaaggcg ctggtgcgcc agcagctgcc ggagaagtac aaggagattt tcttcgacca 1260
gtccaagaac ggctacgccg gctacatcga cggcggcgcg agccaagagg agttctacaa 1320
gttcatcaag cccatcctgg agaagatgga cggcacggag gagctgctgg tgaagctgaa 1380
ccgcgaggac ctgctgcgca agcagcgcac cttcgacaac ggcagcatcc cccaccagat 1440
ccacctgggc gagctgcacg ccatcctgcg tcgccaagag gacttctacc cgttcctgaa 1500
ggacaaccgc gagaagatcg agaagatcct gacgttccgc atcccctact acgtgggccc 1560
gctggcccgc ggcaactccc gcttcgcgtg gatgacccgc aagagcgagg agaccatcac 1620
gccctggaac ttcgaggaag tggtggacaa gggcgccagc gcgcagtcgt tcatcgagcg 1680
catgaccaac ttcgacaaga acctgcccaa cgagaaggtg ctgccgaagc actccctgct 1740
gtacgagtac ttcaccgtgt acaacgagct gacgaaggtg aagtatgtga ccgagggcat 1800
gcgcaagccc gccttcctga gcggcgagca gaagaaggcg atcgtggacc tgctgttcaa 1860
gaccaaccgc aaggtgacgg tgaagcagct gaaagaggac tacttcaaga agatcgagtg 1920
cttcgacagc gtggagatca gcggcgtgga ggaccgcttc aacgccagcc tgggcaccta 1980
ccacgacctg ctgaagatca tcaaggacaa ggacttcctg gacaacgagg agaacgagga 2040
catcctggag gacatcgtgc tgaccctgac gctgttcgag gaccgcgaga tgatcgagga 2100
gcgcctgaag acgtacgccc acctgttcga cgacaaggtc atgaagcagc tgaagcgtcg 2160
ccgctacacc ggctggggcc gcctgagccg caagctgatc aacggcatcc gcgacaagca 2220
gtcgggcaag accatcctgg acttcctgaa gtccgacggc ttcgcgaacc gcaacttcat 2280
gcagctgatc cacgacgact cgctgacctt caaagaggac atccagaagg cccaggtgtc 2340
gggccagggc gactccctgc acgagcacat cgccaacctg gcgggctccc ccgcgatcaa 2400
gaagggcatc ctccagaccg tgaaggtggt ggacgagctg gtgaaggtca tgggccgcca 2460
caagccggag aacatcgtga tcgagatggc ccgcgagaac cagaccacgc agaagggcca 2520
gaagaacagc cgcgagcgca tgaagcgcat cgaggaaggc atcaaggagc tgggctcgca 2580
gatcctgaag gagcaccccg tggagaacac ccagctccag aacgagaagc tgtacctgta 2640
ctacctccag aacggccgcg acatgtatgt ggaccaggag ctggacatca accgcctgtc 2700
cgactacgac gtggaccaca tcgtgcccca gagcttcctg aaggacgact cgatcgacaa 2760
caaggtgctg acccgcagcg acaagaaccg cggcaagagc gacaacgtgc cgtcggagga 2820
agtggtgaag aagatgaaga actactggcg ccagctgctg aacgccaagc tgatcacgca 2880
gcgcaagttc gacaacctga ccaaggccga gcgcggtggc ctgtcggagc tggacaaggc 2940
gggcttcatc aagcgccagc tggtggagac ccgccagatc acgaagcacg tggcgcagat 3000
cctggactcc cgcatgaaca cgaagtacga cgagaacgac aagctgatcc gcgaggtgaa 3060
ggtcatcacc ctgaagtcca agctggtgag cgacttccgc aaggacttcc agttctacaa 3120
ggtgcgcgag atcaacaact accaccacgc ccacgacgcg tacctgaacg ccgtggtggg 3180
caccgcgctg atcaagaagt accccaagct ggagagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa 3240
ggtgtacgac gtgcgcaaga tgatcgccaa gtcggagcag gagatcggca aggccaccgc 3300
gaagtacttc ttctactcca acatcatgaa cttcttcaag accgagatca cgctggccaa 3360
cggcgagatc cgcaagcgcc ccctgatcga gaccaacggc gagacgggcg agatcgtgtg 3420
ggacaagggc cgcgacttcg cgaccgtgcg caaggtgctg agcatgcccc aggtgaacat 3480
cgtgaagaag accgaggtgc agacgggcgg cttctccaag gagagcatcc tgccgaagcg 3540
caactcggac aagctgatcg cccgcaagaa ggactgggac cccaagaagt acggcggctt 3600
cgactccccg accgtggcct acagcgtgct ggtggtggcg aaggtggaga agggcaagtc 3660
caagaagctg aagagcgtga aggagctgct gggcatcacc atcatggagc gcagctcgtt 3720
cgagaagaac cccatcgact tcctggaggc gaagggctac aaagaggtga agaaggacct 3780
gatcatcaag ctgccgaagt actcgctgtt cgagctggag aacggccgca agcgcatgct 3840
ggcctccgcg ggcgagcttc agaagggcaa cgagctggcc ctgcccagca agtatgtgaa 3900
cttcctgtac ctggcgtccc actacgagaa gctgaagggc tcgccggagg acaacgagca 3960
gaagcagctg ttcgtggagc agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag 4020
cgagttctcc aagcgcgtga tcctggccga cgcgaacctg gacaaggtgc tgagcgccta 4080
caacaagcac cgcgacaagc ccatccgcga gcaggcggag aacatcatcc acctgttcac 4140
cctgacgaac ctgggcgccc cggccgcgtt caagtacttc gacaccacga tcgaccgcaa 4200
gcgctacacc agcacgaaag aggtgctgga cgcgaccctg atccaccaga gcatcaccgg 4260
cctgtacgag acgcgcatcg acctgtcgca gctgggcggc gacaagcgcc cggcggcgac 4320
gaagaaggcg ggccaggcga agaagaagaa gtaatctaga attggcatgc aagctcgagt 4380
ttctccataa taatgtgtga gtagttccca gataagggaa ttagggttcc tatagggttt 4440
cgctcatgtg ttgagcatat aagaaaccct tagtatgtat ttgtatttgt aaaatacttc 4500
tatcaataaa atttctaatt cctaaaacca aaatccagta ctaaaatcca gatcccccga 4560
attactgcag 4570
<210> 2
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcccgtga gtcctgcatc cccatcgtgc accgtattca cctcatcgtt tggccccctt 60
ctcacaggtc aaggtc 76
<210> 3
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggactaca aggaccacga cggcgactac aaggaccacg acatcgacta caaggacgac 60
gacgacaag 69
<210> 4
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggccccca agaagaagcg caaggtcggc atccacggcg tgcccgccgc g 51
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagcgcccgg cggcgacgaa gaaggcgggc caggcgaaga agaagaag 48
<210> 6
<211> 160
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tttctccata ataatgtgtg agtagttccc agataaggga attagggttc ctatagggtt 60
tcgctcatgt gttgagcata taagaaaccc ttagtatgta tttgtatttg taaaatactt 120
ctatcaataa aatttctaat tcctaaaacc aaaatccagt 160
<210> 7
<211> 10594
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ctgcaggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc 60
tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag 120
cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta 180
gagcagcttg agcttggatc agattgtcgt ttcccgcctt cagtttaaac tatcagtgtt 240
tgacaggata tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataacggata 300
tttaaaaggg cgtgaaaagg tttatccgtt cgtccatttg tatgtgcatg ccaaccacag 360
ggttcccctc gggatcaaag tactttgatc caacccctcc gctgctatag tgcagtcggc 420
ttctgacgtt cagtgcagcc gtcttctgaa aacgacatgt cgcacaagtc ctaagttacg 480
cgacaggctg ccgccctgcc cttttcctgg cgttttcttg tcgcgtgttt tagtcgcata 540
aagtagaata cttgcgacta gaaccggaga cattacgcca tgaacaagag cgccgccgct 600
ggcctgctgg gctatgcccg cgtcagcacc gacgaccagg acttgaccaa ccaacgggcc 660
gaactgcacg cggccggctg caccaagctg ttttccgaga agatcaccgg caccaggcgc 720
gaccgcccgg agctggccag gatgcttgac cacctacgcc ctggcgacgt tgtgacagtg 780
accaggctag accgcctggc ccgcagcacc cgcgacctac tggacattgc cgagcgcatc 840
caggaggccg gcgcgggcct gcgtagcctg gcagagccgt gggccgacac caccacgccg 900
gccggccgca tggtgttgac cgtgttcgcc ggcattgccg agttcgagcg ttccctaatc 960
atcgaccgca cccggagcgg gcgcgaggcc gccaaggccc gaggcgtgaa gtttggcccc 1020
cgccctaccc tcaccccggc acagatcgcg cacgcccgcg agctgatcga ccaggaaggc 1080
cgcaccgtga aagaggcggc tgcactgctt ggcgtgcatc gctcgaccct gtaccgcgca 1140
cttgagcgca gcgaggaagt gacgcccacc gaggccaggc ggcgcggtgc cttccgtgag 1200
gacgcattga ccgaggccga cgccctggcg gccgccgaga atgaacgcca agaggaacaa 1260
gcatgaaacc gcaccaggac ggccaggacg aaccgttttt cattaccgaa gagatcgagg 1320
cggagatgat cgcggccggg tacgtgttcg agccgcccgc gcacgtctca accgtgcggc 1380
tgcatgaaat cctggccggt ttgtctgatg ccaagctggc ggcctggccg gccagcttgg 1440
ccgctgaaga aaccgagcgc cgccgtctaa aaaggtgatg tgtatttgag taaaacagct 1500
tgcgtcatgc ggtcgctgcg tatatgatgc gatgagtaaa taaacaaata cgcaagggga 1560
acgcatgaag gttatcgctg tacttaacca gaaaggcggg tcaggcaaga cgaccatcgc 1620
aacccatcta gcccgcgccc tgcaactcgc cggggccgat gttctgttag tcgattccga 1680
tccccagggc agtgcccgcg attgggcggc cgtgcgggaa gatcaaccgc taaccgttgt 1740
cggcatcgac cgcccgacga ttgaccgcga cgtgaaggcc atcggccggc gcgacttcgt 1800
agtgatcgac ggagcgcccc aggcggcgga cttggctgtg tccgcgatca aggcagccga 1860
cttcgtgctg attccggtgc agccaagccc ttacgacata tgggccaccg ccgacctggt 1920
ggagctggtt aagcagcgca ttgaggtcac ggatggaagg ctacaagcgg cctttgtcgt 1980
gtcgcgggcg atcaaaggca cgcgcatcgg cggtgaggtt gccgaggcgc tggccgggta 2040
cgagctgccc attcttgagt cccgtatcac gcagcgcgtg agctacccag gcactgccgc 2100
cgccggcaca accgttcttg aatcagaacc cgagggcgac gctgcccgcg aggtccaggc 2160
gctggccgct gaaattaaat caaaactcat ttgagttaat gaggtaaaga gaaaatgagc 2220
aaaagcacaa acacgctaag tgccggccgt ccgagcgcac gcagcagcaa ggctgcaacg 2280
ttggccagcc tggcagacac gccagccatg aagcgggtca actttcagtt gccggcggag 2340
gatcacacca agctgaagat gtacgcggta cgccaaggca agaccattac cgagctgcta 2400
tctgaataca tcgcgcagct accagagtaa atgagcaaat gaataaatga gtagatgaat 2460
tttagcggct aaaggaggcg gcatggaaaa tcaagaacaa ccaggcaccg acgccgtgga 2520
atgccccatg tgtggaggaa cgggcggttg gccaggcgta agcggctggg ttgtctgccg 2580
gccctgcaat ggcactggaa cccccaagcc cgaggaatcg gcgtgacggt cgcaaaccat 2640
ccggcccggt acaaatcggc gcggcgctgg gtgatgacct ggtggagaag ttgaaggccg 2700
cgcaggccgc ccagcggcaa cgcatcgagg cagaagcacg ccccggtgaa tcgtggcaag 2760
cggccgctga tcgaatccgc aaagaatccc ggcaaccgcc ggcagccggt gcgccgtcga 2820
ttaggaagcc gcccaagggc gacgagcaac cagatttttt cgttccgatg ctctatgacg 2880
tgggcacccg cgatagtcgc agcatcatgg acgtggccgt tttccgtctg tcgaagcgtg 2940
accgacgagc tggcgaggtg atccgctacg agcttccaga cgggcacgta gaggtttccg 3000
cagggccggc cggcatggcc agtgtgtggg attacgacct ggtactgatg gcggtttccc 3060
atctaaccga atccatgaac cgataccggg aagggaaggg agacaagccc ggccgcgtgt 3120
tccgtccaca cgttgcggac gtactcaagt tctgccggcg agccgatggc ggaaagcaga 3180
aagacgacct ggtagaaacc tgcattcggt taaacaccac gcacgttgcc atgcagcgta 3240
cgaagaaggc caagaacggc cgcctggtga cggtatccga gggtgaagcc ttgattagcc 3300
gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc gagctagctg 3360
attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg 3420
attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg 3480
caggcaaggc agaagccaga tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg 3540
gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg 3600
agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca 3660
acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa 3720
ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg 3780
ggaacccaaa gccgtacatt gggaaccgga acccgtacat tgggaaccca aagccgtaca 3840
ttgggaaccg gtcacacatg taagtgactg atataaaaga gaaaaaaggc gatttttccg 3900
cctaaaactc tttaaaactt attaaaactc ttaaaacccg cctggcctgt gcataactgt 3960
ctggccagcg cacagccgaa gagctgcaaa aagcgcctac ccttcggtcg ctgcgctccc 4020
tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc 4080
tacggccagg caatctacca gggcgcggac aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc 4140
gcccacatca aggcaccctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 4200
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 4260
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt 4320
agcgatagcg gagtgtatac tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag 4380
tgcaccatat gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc 4440
gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg 4500
tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 4560
agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg 4620
cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 4680
ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg 4740
tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg 4800
gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc 4860
gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg 4920
gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca 4980
ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt 5040
ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag 5100
ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg 5160
gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc 5220
ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt 5280
tggtcatgca ttctaggtac taaaacaatt catccagtaa aatataatat tttattttct 5340
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agggacaatc cgatatgtcg atggagtgaa agagcctgat gcactccgca tacagctcga 5760
taatcttttc agggctttgt tcatcttcat actcttccga gcaaaggacg ccatcggcct 5820
cactcatgag cagattgctc cagccatcat gccgttcaaa gtgcaggacc tttggaacag 5880
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gtatttaaag ataccccaag aagctaatta taacaagacg aactccaatt cactgttcct 6180
tgcattctaa aaccttaaat accagaaaac agctttttca aagttgtttt caaagttggc 6240
gtataacata gtatcgacgg agccgatttt gaaaccgcgg tgatcacagg cagcaacgct 6300
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aacaaattga cgcttagaca acttaataac acattgcgga cgtttttaat gtactgaatt 6600
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aaattttatt gatagaagta ttttacaaat acaaatacat actaagggtt tcttatatgc 6720
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gttatcgcag atccaatcgg gcacactact acggactggg cgactggcgg gcgtcaccac 8040
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gggttattgt atatatcggg accatcgtga ttgttggcca ttgattatgg tggtcgtatt 8820
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ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 9180
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gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 9300
ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 9360
gaattcgagc tcggtacctc caaagccgct ctcatggcat ggcacagagg tatatcgtta 9420
catatatccg tttgtgtcaa cgtcgagggg ttcccctcgt tcaagcctct tcagacattg 9480
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tcgaagtgac ttctcttgac tttctatgtc cgacctcaag gtcgctccgg ggccacaggc 9660
ctaaatacga ccaccataat caatggccaa caatcacgat ggtcccgata tatacaataa 9720
cccttggttt tggcgtagca atgccaggaa attgctagtg tctcatctca atctgagcac 9780
aggcatggaa cgtcggtctg gaaagccgag gccgaagtag ggtacttgat ggaaagctga 9840
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ttattcaaag aaggtgaaca aaggtcgccc caaggcggtc aacaggtaat tggaagaagg 9960
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ccatccgcgt cgtctgacga tgcatatggc gagacaggcc gagtcaaaga tggcacgttt 10200
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cttactcact cttcatcccc ctctcaacgg atcc 10594
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cgtctgggat aagggacgtg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaagcgagca ttcgcttacg 20
<210> 10
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgtctgggat aagggacgtg acttcgctac tgtccgaaaa gttctttcta tgcctcaggt 60
caacatcgtt aaaaagactg aagttcaaac cggtggattc tctaaggagt ctattctccc 120
taagcgtaac tctgacaaat tgatcgctcg aaaaaaggat tgggacccta aaaagtatgg 180
tggattcgat tctcctaccg tcgcttactc tgttcttgtc gttgctaaag tcgaaaaggg 240
aaagtctaaa aagctcaagt ctgttaaaga gttgcttgga atcactatta tggaacgttc 300
ttctttcgag aagaatccta tcgacttcct cgaagctaag ggttacaagg aggtcaaaaa 360
ggatcttatc attaagctcc ctaaatactc tttgttcgaa cttgagaacg gtcgtaagcg 420
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<210> 11
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<212> DNA
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<400> 11
ctgcaggcat gcaagcttgg cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact gggaaaaccc 60
tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct ggcgtaatag 120
cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg gcgaatgcta 180
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tgacaggata tattggcggg taaacctaag agaaaagagc gtttattaga ataacggata 300
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gaactgcacg cggccggctg caccaagctg ttttccgaga agatcaccgg caccaggcgc 720
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caggaggccg gcgcgggcct gcgtagcctg gcagagccgt gggccgacac caccacgccg 900
gccggccgca tggtgttgac cgtgttcgcc ggcattgccg agttcgagcg ttccctaatc 960
atcgaccgca cccggagcgg gcgcgaggcc gccaaggccc gaggcgtgaa gtttggcccc 1020
cgccctaccc tcaccccggc acagatcgcg cacgcccgcg agctgatcga ccaggaaggc 1080
cgcaccgtga aagaggcggc tgcactgctt ggcgtgcatc gctcgaccct gtaccgcgca 1140
cttgagcgca gcgaggaagt gacgcccacc gaggccaggc ggcgcggtgc cttccgtgag 1200
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gctacaagat cgtaaagagc gaaaccgggc ggccggagta catcgagatc gagctagctg 3360
attggatgta ccgcgagatc acagaaggca agaacccgga cgtgctgacg gttcaccccg 3420
attacttttt gatcgatccc ggcatcggcc gttttctcta ccgcctggca cgccgcgccg 3480
caggcaaggc agaagccaga tggttgttca agacgatcta cgaacgcagt ggcagcgccg 3540
gagagttcaa gaagttctgt ttcaccgtgc gcaagctgat cgggtcaaat gacctgccgg 3600
agtacgattt gaaggaggag gcggggcagg ctggcccgat cctagtcatg cgctaccgca 3660
acctgatcga gggcgaagca tccgccggtt cctaatgtac ggagcagatg ctagggcaaa 3720
ttgccctagc aggggaaaaa ggtcgaaaag gtctctttcc tgtggatagc acgtacattg 3780
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tacgccccgc cgcttcgcgt cggcctatcg cggccgctgg ccgctcaaaa atggctggcc 4080
tacggccagg caatctacca gggcgcggac aagccgcgcc gtcgccactc gaccgccggc 4140
gcccacatca aggcaccctg cctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 4200
atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 4260
cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggcg cagccatgac ccagtcacgt 4320
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tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa 4560
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cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga 4680
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taatcttttc agggctttgt tcatcttcat actcttccga gcaaaggacg ccatcggcct 5820
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ctttataccg gctgtccgtc atttttaaat ataggttttc attttctccc accagcttat 6000
ataccttagc aggagacatt ccttccgtat cttttacgca gcggtatttt tcgatcagtt 6060
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gtatttaaag ataccccaag aagctaatta taacaagacg aactccaatt cactgttcct 6180
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gtataacata gtatcgacgg agccgatttt gaaaccgcgg tgatcacagg cagcaacgct 6300
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atacacatgg ggatcagcaa tcgcgcatat gaaatcacgc catgtagtgt attgaccgat 7440
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atcgaagctg aaagcacgag attcttcgcc ctccgagagc tgcatcaggt cggagacgct 7800
gtcgaacttt tcgatcagaa acttctcgac agacgtcgcg gtgagttcag gctttttcat 7860
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gttatcgcag atccaatcgg gcacactact acggactggg cgactggcgg gcgtcaccac 8040
ctgcgtcact cggcgcttgc cggactgggg cggtctcccg ccaatgagcg ctagttgcgt 8100
ctgactcttc agcctcagcc tagactcggc ccgtccctcg cccttgccat ctctccgatg 8160
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gggttattgt atatatcggg accatcgtga ttgttggcca ttgattatgg tggtcgtatt 8820
taggcctgtg gccccggagc gaccttgagg tcggacatag aaagtcaaga gaagtcactt 8880
cgacttcttg cctctgcgac cagttgttca acgaacacca attgcaaggc gagaaacgag 8940
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gcccaatgtc tgaagaggct tgaacgaggg gaacccctcg acgttgacac aaacggatat 9060
atgtaacgat atacctctgt gccatgccat gagagcggct ttggaccaac atggtgggtt 9120
ggcaagctgc tctagccaat acgcaaaccg cctctccccg cgcgttggcc gattcattaa 9180
tgcagctggc acgacaggtt tcccgactgg aaagcgggca gtgagcgcaa cgcaattaat 9240
gtgagttagc tcactcatta ggcaccccag gctttacact ttatgcttcc ggctcgtatg 9300
ttgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt cacacaggaa acagctatga ccatgattac 9360
gaattcgagc tcggtacctc caaagccgct ctcatggcat ggcacagagg tatatcgtta 9420
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ctaaatacga ccaccataat caatggccaa caatcacgat ggtcccgata tatacaataa 9720
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ttattcaaag aaggtgaaca aaggtcgccc caaggcggtc aacaggtaat tggaagaagg 9960
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ttggggtatt gtgtgagaaa gagacgaggt gcagctcgac atggctggag atggcggggg 10080
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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tccaggtagt gcttgtgctg 20
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