二甲双胍在激活雌性生殖干细胞的应用

技术领域

本申请涉及二甲双胍用途技术领域，尤其涉及二甲双胍在激活雌性生殖干细胞的应用。

背景技术

干细胞是理想的种子细胞，具有自我更新和多重分化的潜力，在维持机体稳态、细胞再生和修复方面起着基础性作用。雌性生殖干细胞(FemaleGermlineStemCells，FGSCs)作为众多干细胞中的其中一种，存在于卵巢表面上皮中，并且可分化为卵母细胞并能促进卵泡更新。已有研究表明可以成功从出生后哺乳动物卵巢中分离出雌性生殖干细胞，同时在移植FGSCs后，可恢复各阶段的卵泡，并产生健康的后代。因此，FGSCs的增殖能力有助于维持卵泡发育和延长生殖周期。

二甲双胍为治疗肥胖2型糖尿病经典药物，迄今为止，尚未见关于二甲双胍激活雌性生殖干细胞，并促进其增殖的作用报道。

发明内容

有鉴于此，本申请提供二甲双胍的新用途，即本申请提供了二甲双胍在激活雌性生殖干细胞方面的应用，以解决目前尚未见关于二甲双胍对于雌性生殖干细胞具有激活作用的问题。

第一方面，本申请提供了二甲双胍在激活雌性生殖干细胞中的应用。

第二方面，本申请提供了二甲双胍用于制备激活雌性生殖干细胞的产品中的应用。

第三方面，本申请提供了二甲双胍通过激活雌性生殖干细胞用于制备预防和/或治疗多囊卵巢综合征的产品中的应用。

第四方面，本申请提供了二甲双胍通过激活雌性生殖干细胞用于制备预防和/或治疗卵巢早衰的产品中的应用。

第五方面，本申请提供了二甲双胍通过激活雌性生殖干细胞用于制备预防和/或治疗不孕症的产品中的应用。

进一步地，所述产品包括药物、食品和保健品。

进一步地，所述药物的剂型包括软胶囊、滴丸、乳剂、片剂、洗剂、搽剂、软膏剂或栓剂。

本申请首次发现二甲双胍可以激活雌性生殖干细胞，并促使其增殖。并通过严谨的科学实验，验证了二甲双胍激活雌性生殖干细胞的作用及机制。二甲双胍不仅可以激活雌性生殖干细胞，促进细胞增殖，改善卵巢储备功能及卵泡发育过程。同时，还可以有效避免PCOS糖耐量异常、体重增加、排卵异常及卵巢多囊病变。本申请对于直接利用二甲双胍激活雌性生殖干细胞的发生提供了证据和基础。

附图说明

为了更清楚地说明本申请的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1A为各组小鼠体重指数结果的柱状图；

图1B为各组小鼠治疗前的口服葡萄糖耐量的折线图；

图1C为各组小鼠治疗后的口服葡萄糖耐量的折线图；

图1D为各组小鼠治疗前口服糖耐量断线下的面积的柱状图；

图1E为各组小鼠治疗后口服糖耐量断线下的面积的柱状图；

图2A为各组小鼠睾酮水平的柱状图；

图2B为各组小鼠雌激素水平的柱状图；

图2C为各组小鼠黄体生成素水平的柱状图；

图2D为各组小鼠黄体生成素与卵泡刺激素水平比值的柱状图；

图2E为各组小鼠AMH水平的柱状图；

图2F为各组小鼠免疫组化检测抗多勒安激素的表达结果；

图3A为各组小鼠动情周期的实验结果；

图3B为各组小鼠卵泡计数的柱状图；

图3C为各组小鼠发情周期的H&E染色结果；

图3D为各组小鼠卵巢组织的H&E染色结果；

图4A为各组小鼠DDX4/MVH的免疫组化研究结果；

图4B为各组小鼠DDX4/MVH和PCNA的免疫荧光分析结果；

图4C为各组小鼠FGSC数量的柱状图；

图4D为各组小鼠DDX4、PCNA、细胞周期蛋白D2的分析结果；

图4E为各组小鼠DDX4/MVH蛋白相对表达量结果；

图4F为各组小鼠PCNA蛋白相对表达量结果；

图4G为各组小鼠细胞周期蛋白D2蛋白相对表达量结果。

具体实施方式

下面将详细地对实施例进行说明，其示例表示在附图中。下面的描述涉及附图时，除非另有表示，不同附图中的相同数字表示相同或相似的要素。以下实施例中描述的实施方式并不代表与本申请相一致的所有实施方式。仅是与权利要求书中所详述的、本申请的一些方面相一致的系统和方法的示例。

第一方面，本申请提供了二甲双胍在激活雌性生殖干细胞中的应用。

第二方面，本申请提供了二甲双胍用于制备激活雌性生殖干细胞的产品中的应用。

第三方面，本申请提供了二甲双胍通过激活雌性生殖干细胞用于制备预防和/或治疗多囊卵巢综合征的产品中的应用。

第四方面，本申请提供了二甲双胍通过激活雌性生殖干细胞用于制备预防和/或治疗卵巢早衰的产品中的应用。

第五方面，本申请提供了二甲双胍通过激活雌性生殖干细胞用于制备预防和/或治疗不孕症的产品中的应用。

进一步地，所述产品包括药物、食品和保健品。

进一步地，所述药物的剂型包括软胶囊、滴丸、乳剂、片剂、洗剂、搽剂、软膏剂或栓剂。

本申请首次发现二甲双胍可以激活雌性生殖干细胞，并促使其增殖。并通过严谨的科学实验，验证了二甲双胍激活雌性生殖干细胞的作用及机制。二甲双胍不仅可以激活雌性生殖干细胞，促进细胞增殖，改善卵巢储备功能及卵泡发育过程。同时，还可以有效避免PCOS糖耐量异常、体重增加、排卵异常及卵巢多囊病变。本申请对于直接利用二甲双胍激活雌性生殖干细胞的发生提供了证据和基础。

为了证实二甲双胍具有上述新应用，进行了如下实验。

1.技术方案：

多囊卵巢综合征(PCOS)是卵泡发育障碍的典型疾病，是研究雌性生殖干细胞的良好模型，我们以PCOS小鼠模型为例，证实二甲双胍激活雌性生殖干细胞，及改善糖耐量异常、体重增加、排卵异常，保护卵巢功能的作用。

PCOS小鼠的模型建立及治疗。

来曲唑是芳香化酶抑制剂，可以抑制卵巢雄激素向雌激素的转化，从而造成高雄激素血症。具体实施：高脂喂养加灌胃给来曲唑，1mg·kg

2.实验结果监测及数据收集：

A.阴道分泌物涂片用于动情周期测定；具体实现时，使用滴管吸取适量生理盐水，在同一时间点冲洗、吸取阴道分泌物于载玻片上，H&E染色在显微镜下观察细胞形态，判断动情周期。取材前连续7天检测动情周期。

B.口服葡萄糖耐量实验(OGTT)；具体实现时，在造模第20天及治疗后27天后进行OGTT实验。方法：禁食14-16h，灌糖前测体重，分别在0、15、30、60、120min测血糖。

C.ELISA法检测性激素；具体实现时，采用ELISA法检测各血清样品中T、E2、LH、FSH及AMH的含量，操作严格按照试剂盒说明书要求进行。

D.组织形态学检测；具体实现时，检测包括H&E染色、免疫组化、免疫荧光。镜下观察，拍照保存。其中免疫组化中兔抗AMH(1:50)、兔抗DDX4/MVH(1:1000)；免疫荧光中MVH兔抗(1:400)、PCNA鼠抗(1:200)，相应荧光二抗(1:300)。

E.Westernblot检测DDX4/MVH、PCNA、cyclinD2、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白的表达；具体实现时，提取卵巢组织蛋白，BCA试剂盒定量，上样，电泳，电转200mA、2h，5％牛奶封闭1h，孵相应一抗(除β-actin浓度为1:2000、PCNA1:4000外，其余所用抗体均为1:1000)4℃过夜，次日，孵相应二抗，室温1h，放射自显影，用ImageJ图像分析软件测定各条带灰度值。

3.实验结果：

3.1高脂喂养联合灌胃给予来曲唑可造成小鼠肥胖、糖耐量异常表型，本申请给予二甲双胍治疗后有明显改善。

图1B所示，高脂喂养联合灌胃给予来曲唑建立PCOS模型，通过测量小鼠体重，计算体重指数(BMI)证明PCOS模型组小鼠体重指数明显高于正常组，OGTT显示糖耐量明显受损。

进一步地，图1A所示，在给予二甲双胍治疗后，与PCOS模型组相比，体重显著下降。

进一步地，参见图1D和图1E，OGTT显示二甲双胍治疗组血糖值，在给糖后第30min、60min、90min、120min均显著低于PCOS模型组与正常组相近，曲线下面积AUC亦显示。

进一步地，图1C所示，二甲双胍组血糖比正常组有明显改善。

3.2高脂喂养联合灌胃给予来曲唑可造成小鼠高雄激素血症及雌激素紊乱，本申请给予二甲双胍可改善性激素紊乱。

参见图2A、2C和2D，通过检测血清性激素水平，与正常组小鼠相比，PCOS模型组小鼠血清睾酮T、黄体生成素LH水平及LH/FSH比值明显增高。

进一步地，参见图2B，雌二醇水平也明显低于正常组，而经二甲双胍干预后，睾酮、黄体生成素LH水平及黄体生成素LH/卵泡刺激素FSH比值显著降低，而且二甲双胍能有效增高雌激素水平。

进一步地，二甲双胍降低多囊卵巢AMH表达，AMH显示卵巢储备功能，多项研究表明PCOS患者血清中会产生大量的AMH，AMH水平能够反映PCOS的严重程度，可作为临床诊断、预测PCOS的重要参考指标。如图2F免疫组化所示，正常组中卵泡周围和颗粒细胞间有AMH表达(黄染部分)，但表达量不高；模型组可以明显看到AMH的表达远高于正常组及其他组；而在二甲双胍组中，卵泡周围和颗粒细胞间黄染面积明显比模型组少，说明AMH在PCOS模型组小鼠的卵巢中高表达。参见图2E，血清AMH结果也证实本申请中二甲双胍可以减轻PCOS的严重程度，保护卵巢功能。

3.3二甲双胍可以改善PCOS小鼠卵巢形态和功能。

小鼠的动情周期类似人的月经周期，反映卵巢排卵功能及内分泌功能。根据阴道分泌物涂片观测的细胞种类和形态，将动情周期分为动情前期、动情期、动情后期及动情间期。具体实现时，通过小鼠阴道涂片持续检测动情周期，发现正常组小鼠动情周期规则，呈现出动情前期、动情期、动情后期、动情间期交替。其中，4-5天为一周期且规律出现。

参见图3C，PCOS模型组涂片持续见大量白细胞，极少量梭形上皮细胞，失去正常动情周期而处在持续间期。结合图3A和图3C可以看出，二甲双胍组在治疗前同模型组，处于持续间期，但是给予治疗后，逐步出现动情前期、动情期、动情后期，直至取材前恢复正常规律动情周期。由此可见，二甲双胍组可以明显改善小鼠的动情周期。

进一步，参见图3D，进行卵巢形态学实验，通过H&E染色发现：正常小鼠卵巢可见多个不同发育阶段的卵泡及黄体，颗粒细胞形态完整且排列整齐。PCOS模型组小鼠卵巢表现为多个空腔卵泡、颗粒层稀疏，多数卵泡闭锁。二甲双胍治疗组小鼠卵巢闭锁卵泡的数量显著减少，卵巢内均可见多个发育不同阶段的卵泡，接近成熟期的卵泡可见卵母细胞及放射冠，颗粒细胞层增厚并紧密聚集，形态接近正常组。

进一步，参见图3B，卵泡计数发现：模型组相对于正常组小鼠，闭锁卵泡明显增多，而原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡以及成熟卵泡明显减少，而二甲双胍组闭锁卵泡明显减少，其他各级卵泡增多。

综上结果表明：二甲双胍可明显恢复PCOS小鼠的动情周期，改善PCOS小鼠卵巢病理性多囊，改善卵巢功能。

3.4二甲双胍激活雌性生殖干细胞并促进其增殖。

DDX4/MVH是FGSCs的特异性标记物。参见图4A中箭头处为免疫组化染色显示DDX4/MVH阳性表达，分布在卵巢皮质层，证明了FGSCs的存在。

为了进一步确定FGSCs的数量以及增殖性，参见图4B，通过免疫荧光进行MVH/DDX4、PCNA共标。PCNA是增殖细胞核抗原，是反映细胞增殖的重要指标，如图所示绿色荧光(箭头处)为DDX4/MVH阳性表达，提示该细胞为FGSCs，红色荧光(箭头处)为PCNA阳性表达，提示该细胞具有增殖活力。

进一步地，参见图4C，可以看出各组均存在FGSCs，尤其二甲双胍治疗组FGSCs数量明显增加，成簇表达，PCNA染色阳性，表明具有增殖活性。PCOS模型组虽然存在少量FGSCs，但大多无PCNA阳性表达，表明该细胞无增殖性。

进一步地，如图4D所示，Westernblot结果也发现二甲双胍组FGSCs特异性蛋白DDX4/MVH、细胞增殖蛋白PCNA及cyclinD2明显比模型组增多，图4E、4F、4G为其相对蛋白定量结果，均证明了二甲双胍可以激活FGSCs，并促进其增殖。

PCOS可伴有肥胖、胰岛素抵抗、代偿性高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、脂质异常等一系列代谢异常特征，而糖脂代谢等紊乱反过来会促进PCOS病情进展。

在本申请中，来曲唑联合HFD建立的PCOS模型小鼠，表现出肥胖、糖耐量异常、高雄激素血症及雌激素紊乱，并且出现动情周期紊乱、排卵障碍、卵巢功能障碍等生殖障碍表型。而在给予二甲双胍治疗后，糖脂代谢紊乱、激素水平紊乱及卵巢功能障碍等表征，都有明显改善。由于PCOS引起的不孕症主要机理是卵泡发育障碍及排卵障碍，高LH/FSH(黄体生成素/卵泡刺激素)水平是PCOS的典型特征之一。高LH会抑制FSH功能，使颗粒细胞黄素化，小窦卵泡发育停止，卵巢多囊。通过上述实验结果也验证了二甲双胍可以调节LH/FSH稳态，改善卵泡发育异常和颗粒细胞状态。

FGSCs的耗竭导致卵母细胞数量减少和卵巢功能障碍。本申请通过上述实验结果显示，PCOS模型小鼠虽然存在一定数量的FGSCs，但是缺乏增殖能力。而给予二甲双胍治疗后，FGSCs数量明显增加，且具有增殖能力。同时Westernblot结果发现二甲双胍治疗组小鼠雌性生干细胞特异性标记物DDX4/MVH蛋白及细胞增殖蛋白PCNA、cyclinD2明显上调，进一步证实二甲双胍能激活FGSCs并促进其增殖。该发现为促进卵母细胞再生、补充卵泡池，从而增加妊娠率提出了新的方向。

综上所述，本申请通过PCOS动物模型，证实了二甲双胍改善PCOS糖脂代谢紊乱、性激素紊乱、排卵障碍等作用。发现并验证二甲双胍通过调控AMH稳态，从而改善卵泡发育成熟。本申请将为PCOS、卵巢早衰等卵巢功能障碍性疾病的发病机制研究及临床治疗提供新线索。

本申请提供的实施例之间的相似部分相互参见即可，以上提供的具体实施方式只是本申请总的构思下的几个示例，并不构成本申请保护范围的限定。对于本领域的技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下依据本申请方案所扩展出的任何其他实施方式都属于本申请的保护范围。