一种复方药渣的含量检测方法

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及一种复方药渣的含量检测方法。

背景技术

六味地黄丸的药渣中含有丹皮酚、熊果酸等成分，目前比较多的研究是对药渣的处理方式研究、药渣对土壤微生物环境等的影响研究，而对其主要成分未做相关细化研究。

发明内容

本发明目的在于提供一种复方药渣(本发明中所述复方药渣指六味地黄丸浓缩丸的药渣)的含量检测方法，具体技术方案如下：

一种复方药渣的含量检测方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：

精密称取标准品丹皮酚、熊果酸、茯苓酸、23-乙酰泽泻醇B，配置成混合对照品溶液；

(2)供试品溶液的制备：

精密称取复方药渣至锥形瓶中，加入乙酸乙酯超声，离心后收集上清液，再加入乙酸乙酯超声，离心后合并两次上清液，将乙酸乙酯挥干，后用甲醇溶解稀释，微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液；

(3)HPLC检测：

分别吸取步骤(1)和(2)所得的对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定；其中，色谱条件为：色谱柱：C18反相色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.08％-0,1％磷酸溶液，梯度洗脱，0-10min，5％-65％A；10-40min，65％-80％A；40-60min，80％-95％A，流速为0.8-1.2mL/min，柱温28-32℃，检测波长：238-245nm，200-220nm。

进一步的，其中，所述步骤(1)对照品溶液的制备按照下述方法进行：精密称取标准品丹皮酚约2.00mg、熊果酸约3.00mg、茯苓酸约1.40mg，分别置于10mL的容量瓶中；精密称取标准品23-乙酰泽泻醇B约2.50mg置于25mL的容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得各标准品母液的浓度分别约为0.200mg/mL、0.300mg/mL、0.140mg/mL、0.100mg/mL。分别取丹皮酚溶液、熊果酸溶液、茯苓酸溶液、23-乙酰泽泻醇B溶液置10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，四个标准品混合溶液浓度分别约为0.002mg/mL、0.026mg/mL、0.024mg/mL、0.04mg/mL，作为混合对照品溶液。

进一步的，其中，所述步骤(2)供试品溶液的制备按照下述方法进行：称取复方药渣1g至锥形瓶中，加入10mL乙酸乙酯超声30min，2500r离心5min，收集上清液，再加入10mL乙酸乙酯超声30min，离心后合并两次上清液，倒入蒸发皿中并于60℃水浴锅上将乙酸乙酯挥干，后用15mL甲醇溶解稀释，微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

进一步的，其中，所述步骤(3)中色谱条件中，流动相为乙腈(A)－0.08％磷酸溶液(B)，流速为1mL/min，柱温为30℃；色谱柱为Athena C18 120A(4.6mm×250mm,5μm)，进样量为10μL；检测波长为238nm和210nm。

本发明的有益效果：建立了一种六味地黄丸药渣的检测方法，有利于对药渣的成分分析，为药渣的开发利用打好基础。

附图说明

附图1是六味地黄丸复方药渣的线性关系考察叠加色谱图

附图2是六味地黄丸复方药渣的加样回收考察叠加色谱图

附图3是六味地黄丸复方药渣和单味药渣对比色谱图

附图1-3中，1为丹皮酚，2为23-乙酰泽泻醇B，3为茯苓酸，4为熊果酸。

具体实施方式

实施例1

一种六味地黄丸浓缩丸的药渣的检测方法，包括如下步骤：

(1)对照品溶液的制备：精密称取标准品丹皮酚2.04mg、熊果酸3.00mg、茯苓酸1.38mg，分别置于10mL的容量瓶中；精密称取标准品23-乙酰泽泻醇B 2.45mg置于25mL的容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，得各标准品母液的浓度分别为0.204mg/mL、0.30mg/mL、0.138mg/mL、0.098mg/mL。分别取丹皮酚溶液、熊果酸溶液、茯苓酸溶液、23-乙酰泽泻醇B溶液120μL、870μL、1.74mL、4mL置10mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，四个标准品混合溶液浓度分别为0.002mg/mL、0.026mg/mL、0.024mg/mL、0.039mg/mL，作为混合对照品溶液。

(2)供试品溶液的制备：称取六味地黄丸复方药渣1g至锥形瓶中，加入10mL乙酸乙酯超声30min，2500r离心5min，收集上清液，再加入10mL乙酸乙酯超声30min，离心后合并两次上清液，倒入蒸发皿中并于60℃水浴锅上将乙酸乙酯挥干，后用15mL甲醇溶解稀释，微孔滤膜过滤，取续滤液，作为供试品溶液。

(3)HPLC检测，分别吸取步骤(1)和(2)所得的对照品溶液和供试品溶液，分别注入高效液相色谱仪中进行测定；其中，色谱条件为：色谱柱：C18反相色谱柱Athena C18 120A(4.6mm×250mm,5μm)，流动相A为乙腈，流动相B为0.08％磷酸溶液，梯度洗脱，0-10min，5％-65％A；10-40min，65％-80％A；40-60min，80％-95％A，流速为0.8-1.2mL/min，柱温28-32℃，检测波长：238nm和210nm。

(4)检测结果：

本批次六味地黄丸药渣中丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸和熊果酸的含量分别为0.023mg/g、0.932mg/g、0.294mg/g、0.371mg/g。

以下内容为本发明检测方法的方法学考察内容

1.线性关系考察：

分别精密吸取上述实施例1中混合对照品溶液2μL、4μL、8μL、10μL、15μL、20μL，注入液相色谱仪，以对照品色谱峰面积Y为纵坐标，对照品的进样量X为横坐标，进行线性回归，见图1和表1

表1四种成分回归方程与线性范围如下所示：

结果表明：丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸和熊果酸在测定浓度范围内的线性关系良好。

2.精密度：

精密吸取实施例1中同一供试品溶液10μL，连续重复进样6次，测定丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸和熊果酸的峰面积积分值，并计算RSD。

结果：4种待测成分的RSD分别为1.17％、0.46％、0.63％、0.67％。结果表明：本法仪器精密度较好。

4.3稳定性：

精密吸取实施例1中同一供试品溶液10μL，分别放置0h，2h，4h，8h，12h，24h，测定各待测成分的峰面积积分值，并计算RSD。

结果：丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸和熊果酸的RSD分别为2.79％、1.86％、1.73％、2.82％。结果表明：供试品溶液放置24h内基本稳定。

4.4重复性：

称取复方药渣1g，按上述实施例1中制备供试品溶液的方法平行制备6份溶液，按以上色谱条件进样测定。

结果：丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸和熊果酸的RSD分别为2.41％、1.77％、2.10％、2.05％。结果表明：本法的重复性较好。

4.5加样回收：

取已知含量的六味地黄丸药渣(丹皮酚含量按0.020mg/g、23-乙酰泽泻醇B0.934mg/g、茯苓酸0.294mg/g、熊果酸0.382mg/g计)约0.5g，精密称定置锥形瓶中，加入用乙酸乙酯溶液制成的丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸、熊果酸混合对照品溶液(每毫升含丹皮酚0.0006mg、23-乙酰泽泻醇B 0.0200mg、茯苓酸0.0150mg、熊果酸0.0023mg)10mL超声30min，2500r离心5min，收集上清液，再加入10mL混合对照品溶液超声30min，离心后合并两次上清液，倒入蒸发皿中并于60℃水浴锅上将乙酸乙酯挥干，后用15mL甲醇溶解稀释，微孔滤膜过滤，即得。制成6份加样供试溶液，测定并计算4种待测成分的平均加样回收率和RSD值。见图2和表2。

表2：加样回收试验结果如下所示：

4.6含量测定

4.6.1复方药渣含量测定：

称取复方药渣1g至锥形瓶中，加入10mL乙酸乙酯超声30min，2500r离心5min，收集上清液，再加入10mL乙酸乙酯超声30min，离心后合并两次上清液，倒入蒸发皿中并于60℃水浴锅上将乙酸乙酯挥干，后用15mL甲醇溶解稀释，微孔滤膜过滤。此处理方法平行操作3次测定，制备供试品溶液。并计算六味地黄丸药渣中丹皮酚、23-乙酰泽泻醇B、茯苓酸和熊果酸的含量。

如下所示：

4.6.2单味药渣含量测定：

分别称取牡丹皮、泽泻、茯苓和山茱萸药渣0.3g、0.2g、0.5g、0.1g至锥形瓶中，于上述同样的方法处理样品溶液。并计算六味地黄丸单味药渣中牡丹皮(丹皮酚)、泽泻(23-乙酰泽泻醇B)、茯苓(茯苓酸)和山茱萸(熊果酸)的含量。

单味药渣牡丹皮中含有0.077mg/g的丹皮酚，泽泻中含有2.320mg/g的23-乙酰泽泻醇B，茯苓中含有1.306mg/g的茯苓酸，山茱萸中含有6.020mg/g的熊果酸。

复方药渣和单味药渣色谱图见图3。