一种多肽聚合物复合抗菌剂及制备方法

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种多肽聚合物复合抗菌剂及制备方法。

背景技术

在日常生活中人们受到一些意外创伤是非常常见的，较为严重的创伤需要手术缝合或者大面积的贴附创伤敷料进行伤口的治愈。手术切口感染是普通外科手术最常见的并发症之一，常导致切口延期愈合、裂开，影响患者后续治疗，严重者可引起全身性感染、器官功能障碍，甚至死亡。术后常规抗菌消炎药物虽然在一定程度上具有抗菌的作用，但因其不能形成有效的物理隔膜，药物的有效成分不能持续停留在创面部位，难以达到有效的抗菌效果。因此如何促进创面愈合，减少创伤和术后感染，是创伤或者术后迫切需要解决的问题。

目前市场上抗菌药剂主要有酒精、碘伏等液体，但是处理伤口时候会引起剧烈的疼痛感。抗菌软膏等膏剂，药物吸收较差，药效较差。后来市场上又发展了一些创面抗菌的喷剂，如银离子喷剂、壳聚糖喷剂或海藻酸盐的抗菌喷剂，但是银离子容易导致伤口颜色加深，壳聚糖喷剂或海藻酸盐的抗菌喷剂的抗菌效果较差。壳寡糖，又叫壳聚寡糖、是水溶性较好、功能作用大、生物活性高的低分子量产品。全溶于水，容易被生物体吸收利用等诸多独特的功能，其作用功效远高于壳聚糖。在酸性条件下，壳寡糖分子中的游离氨基质子化，质子化氨能与细菌带正电的细胞膜作用，干扰细菌细胞膜功能，造成细菌体内细胞质流失，对真菌和微生物的生长有抑制作用。另外壳寡低聚糖的免疫增强作用和抗感染作用被证实。但壳寡糖水溶性好，分子量小，容易从创面流失，并且单独壳寡糖的抗菌效果也比较有限。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有优异广谱抗菌和促修复作用的抗菌剂。

为了达到上述目的，本发明提供了一种多肽聚合物复合抗菌剂，包括多肽聚合物、聚乙烯醇和壳寡糖，其中，按质量比计，多肽聚合物：壳寡糖：聚乙烯醇＝(1-5)：(1-5)：(2-10)。

可选地，所述多肽聚合物为包含赖氨酸残基的均聚物。

可选地，所述多肽聚合物为包含赖氨酸残基和谷氨酸苄酯残基的共聚物。

本发明还提供了一种上述多肽聚合物复合抗菌剂的制备方法，包括：

步骤1，将多肽聚合物分散于无菌水中，搅拌混合，得到多肽聚合物溶液；

步骤2，将壳寡糖和聚乙烯醇分散于无菌水中，加热搅拌溶解，得到聚乙烯醇/壳寡糖溶液；

步骤3，将步骤1得到的多肽聚合物溶液和步骤2得到的聚乙烯醇/壳寡糖溶液混合，得到多肽聚合物复合抗菌剂；其中，按质量比计，多肽聚合物：壳寡糖：聚乙烯醇：无菌水＝(1-5)：(1-5)：(2-10)：200。

可选地，所述多肽聚合物为包含赖氨酸残基的均聚物，步骤1还包括：

步骤1.1，将N-ε-叔丁氧羰基-D,L-赖氨酸NCA和六甲基二硅氮化锂以摩尔比(2-3)：(4-6)的比例溶解于四氢呋喃中，搅拌后减压浓缩；

步骤1.2，加入冷石油醚，沉淀出侧链NHBoc保护的多肽聚合物，并重新溶解于四氢呋喃中；

步骤1.3，用三氟乙酸处理多肽聚合物，除去保护基团；

步骤1.4，在气流下除去过量的三氟乙酸，将甲基叔丁基醚倒入混合物中，沉淀出多肽聚合物。

可选地，所述多肽聚合物为包含赖氨酸残基和谷氨酸苄酯残基的共聚物，步骤1还包括：

步骤1.1，将γ-苄基-L-谷氨酸NCA、N-ε-叔丁氧羰基-D,L-赖氨酸NCA和六甲基二硅氮化锂以摩尔比(15-30)：(2-3)：(4-6)的比例溶解于四氢呋喃中，搅拌后减压浓缩；

步骤1.2，加入冷石油醚，沉淀出侧链NHBoc保护的多肽聚合物，并重新溶解于四氢呋喃中；

步骤1.3，用三氟乙酸处理多肽聚合物，除去保护基团；

步骤1.4，在气流下除去过量的三氟乙酸，将甲基叔丁基醚倒入混合物中，沉淀出多肽聚合物。

可选地，步骤2中，加热温度为85℃-95℃。

可选地，步骤3中，利用均质机将溶液分散混合，均质机转速为20000rpm/时-40000rpm/时，剪切时间150秒-300秒。

本发明的有益效果为：

(1)本发明的多肽聚合物复合抗菌剂，利用聚乙烯醇的羟基与抗菌多肽聚合物/壳寡糖的氨基等基团具有比较强的氢键作用，抗菌多肽聚合物与聚乙烯醇/壳寡糖分子链缠绕在一起，形成比较均匀的分散，并且能够较好保护抗菌多肽聚合物/壳寡糖受到外界环境的影响，保持较好的稳定性和抗菌活性；采用聚乙烯醇调节了剂的粘度，喷至创口处，形成有效的物理隔膜，抗菌多肽聚合物和壳寡糖能持续停留在创面部位，缓慢的释放出来，发挥较长时间的抗菌修复作用。

(2)本发明制备得到的多肽聚合物复合抗菌剂具有优异的抗菌效果，多肽聚合物能与细胞膜相互结合，借助静电引力破坏细胞膜的通透性，导致细胞膜破碎溶解，使胞内物质外流，从而引起细胞死亡，从而实现抗菌效果，且不易产生耐药性，无毒害副作用；并且还能促进创面修复，调节免疫，通过细胞因子生产的调制、细胞迁移、增值，促进血管生成和体内抗炎，从而促进创口愈合。

(3)抗菌多肽聚合物和壳寡糖在破坏细菌膜的具有很好的协同作用。壳寡糖分子量小，释放和移动速率更快，能够较快的破坏细菌膜，而抗菌多肽聚合物分子量大，移动慢，在后续过程中能够持续发挥抗菌作用。另外，壳寡糖刺激机体，激活T淋巴细胞与巨噬细胞，提高免疫力，促进修复。与抗菌多肽聚合物促进免疫，协同作用，相互促进，提高创口愈合速度。

(4)本发明的配方简单，生物安全性好。

附图说明

图1为各组小鼠创口愈合情况图。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

随着抗菌的巨大的需求，抗菌肽也逐渐被人们重视和发现，抗菌肽具有广谱抗菌活性，对细菌有很强的杀伤作用，尤其是对某些耐药性病原菌的杀灭作用，除此之外，人们还发现，抗菌肽对部分病毒、真菌、原虫和癌细胞等有杀灭作用，甚至能提高免疫力、加速伤口愈合过程，因此，抗菌肽的广泛的生物学活性显示了其在医学上良好的应用前景。然而从天然中获取抗菌肽比较有限，人们也开始发展通过人工合成抗菌多肽聚合物。本发明合成了一种新型的抗菌多肽聚合物，以抗菌多肽聚合物/壳寡糖作为医用抗菌喷剂的抗菌成分，抗菌多肽聚合物/壳寡糖的氨基等基团与聚乙烯醇的羟基能够形成氢键，抗菌多肽聚合物/壳寡糖能够均匀的分散在聚乙烯醇中，多肽聚合物与聚乙烯醇/壳寡糖分子相互缠绕，保证抗菌喷剂的有效成分的均匀性，保护抗菌多肽聚合物受到外界环境的影响，保持稳定性和抗菌活性。聚乙烯醇作为成膜剂和缓释基材，聚乙烯醇和抗菌多肽聚合物喷剂通过喷嘴喷出后，雾滴中的水分蒸发，聚乙烯醇在创口处快速成膜，在膜表面的抗菌多肽聚合物迅速发挥作用，内部的抗菌多肽聚合物和壳寡糖克服聚乙烯醇的氢键作用慢慢的释放出来(一方面是通过创口处渗出液溶胀聚乙烯醇膜，另外一方面是通过抗菌多肽聚合物的扩散作用)，发挥抗菌多肽聚合物和壳寡糖的协同作用，具有广谱抗菌和促修复作用。另外聚乙烯醇调节了剂的粘度，喷至创口处，形成有效的物理隔膜，使抗菌多肽聚合物和壳寡糖能持续停留在创面部位，缓慢的释放出来，发挥较长时间的抗菌修复作用。

本发明提供的多肽聚合物复合抗菌剂的制备方法，包括：

步骤一，制备多肽聚合物溶液：将γ-苄基-L-谷氨酸NCA、N-ε-叔丁氧羰基-D,L-赖氨酸NCA和六甲基二硅氮化锂以摩尔比(15-30)：(2-3)：(4-6)的比例溶解于四氢呋喃中，搅拌反应后减压浓缩；可选地，先将γ-苄基-L-谷氨酸NCA和N-ε-叔丁氧羰基-D,L-赖氨酸NCA溶解于四氢呋喃，再加入已经溶解于部分四氢呋喃中的六甲基二硅氮化锂；将冷石油醚加入混合物，过滤收集第一沉淀物；将第一沉淀物溶解于四氢呋喃，向溶液中加入过量的三氟乙酸以除去保护基团；在气流下除去三氟乙酸，加入甲基叔丁基醚，获得第二沉淀物，将第二沉淀物冻干，得到多肽聚合物。

将得到的多肽聚合物分散于无菌水中，搅拌混合，得到多肽聚合物溶液。

本发明提供的多肽聚合物可以是包含赖氨酸残基的均聚物，或包含赖氨酸残基和谷氨酸苄酯残基的共聚物，结构式如下：

构型为L、D或DL；链长n为1-1000，x％为100％-30％，y％为0-70％。

步骤二，制备聚乙烯醇/壳寡糖溶液：将壳寡糖和聚乙烯醇分散于无菌水中，加热搅拌溶解，得到聚乙烯醇/壳寡糖溶液；可选地，加热温度为85℃-95℃。

步骤三，制备多肽聚合物复合抗菌剂：将步骤二得到的多肽聚合物溶液与步骤三得到的聚乙烯醇/壳寡糖溶液混合，得到多肽聚合物复合抗菌剂；按质量比计，多肽聚合物：壳寡糖：聚乙烯醇：无菌水＝(1-5)：(1-5)：(2-10)：200。可选地，利用匀质机将多肽聚合物溶液与聚乙烯醇/壳寡糖溶液混合，均质机的转速为20000-40000rpm/时，剪切时间为150-300秒。

在一些实施例中，将步骤三得到的多肽聚合物复合抗菌剂装入灌装机给料桶，再定量灌入手动泵喷剂瓶中，形成多肽聚合物复合抗菌喷剂。

实施例1

首先分别参考文献合成γ-苄基-L-谷氨酸NCA(BLG NCA)和N-ε-叔丁氧羰基-D,L-赖氨酸NCA(Boc-D,L-Lys NCA)[Nat.Commun.2018,9(1),5297；Tetrahedron Lett.1988,29(46),5859-5862]，在开口烧瓶中，将Boc-D,L-Lys NCA(6.0g,22.0mmol)和BLG NCA(0.65mg,2.5mmol)溶解在四氢呋喃(110mL)中。将在四氢呋喃(10mL)中的六甲基二硅氮化锂(LiHMDS，819.9mg,4.9mmol)添加到搅拌的单体混合物中，室温搅拌5分钟后，反应完成，混合物减压浓缩。然后，将大量冷石油醚(200mL)倒入混合物中，以沉淀出侧链NHBoc保护的多肽聚合物的白色固体沉淀物。将固体重新溶解在四氢呋喃(20mL)中。在温和搅拌下用三氟乙酸(TFA)处理多肽聚合物过夜以除去保护基团。在气流下除去过量的三氟乙酸，然后将大量冷的甲基叔丁基醚(200mL)倒入混合物中，沉淀出已经除去保护基团的聚合物，过滤得到白色固体。再次进行溶解和沉淀两次循环操作之后，在冻干后获得抗菌多肽聚合物。

将0.2kg合成的抗菌多肽聚合物分散于10kg无菌水中进行混合，搅拌，得抗菌多肽聚合物溶液。将1kg聚乙烯醇(醇解度：98.0-99.0mol％，黏度：5.2-6.0mPa.s)和0.2kg壳寡糖分散于20kg无菌水中，加热至85-95℃，搅拌溶解，冷却后成为均一的聚乙烯醇/壳寡糖溶液。将以上抗菌多肽聚合物溶液与聚乙烯醇/壳寡糖溶液混合，采用均质机进行混合分散，转速为30000rpm/时，剪切时间为200秒。混合均匀，得多肽聚合物复合抗菌剂。

将配制好的抗菌剂装入灌装机给料桶，定量灌入30mL手动泵喷剂瓶中，形成多肽聚合物复合抗菌喷剂。

实施例2

在开口烧瓶中，将Boc-D,L-Lys NCA(4.1g,22.0mmol)和BLG NCA(0.78mg,3mmol)溶解在四氢呋喃(110mL)中。将在四氢呋喃(10mL)中的六甲基二硅氮化锂(LiHMDS，1004.0mg,6mmol)添加到搅拌的单体混合物中，室温搅拌5分钟后，反应完成，混合物减压浓缩。然后，将大量冷石油醚(200mL)倒入混合物中，以沉淀出侧链NHBoc保护的多肽聚合物的白色固体沉淀物。将固体重新溶解在四氢呋喃(20mL)中。在温和搅拌下用三氟乙酸(TFA)处理肽聚合物过夜以除去保护基团。在气流下除去过量的三氟乙酸，然后将大量冷的甲基叔丁基醚(200mL)倒入混合物中，沉淀出已经除去保护基团的聚合物，过滤得到白色固体。在另外两个溶解和沉淀循环之后，在冻干后获得抗菌多肽聚合物。

将0.2kg合成的抗菌肽聚合物分散于10kg无菌水中进行混合，搅拌，得抗菌多肽聚合物溶液。将0.9kg聚乙烯醇(醇解度：98.0-99.0mol％，黏度：5.2-6.0mPa.s)和0.45kg壳寡糖分散于20kg无菌水中，加热至85-95℃，搅拌溶解，冷却后成为均一的聚乙烯醇/壳寡糖混合溶液。将以上抗菌多肽聚合物溶液与聚乙烯醇/壳寡糖混合溶液混合，采用均质机进行混合分散，转速为20000rpm/时，剪切时间为300秒。混合均匀，得多肽聚合物复合抗菌剂。

将配制好的抗菌剂灌装液装入灌装机给料桶，定量灌入20mL手动泵喷剂瓶中，即形成多肽聚合物复合抗菌喷剂。

实施例3

在开口烧瓶中，将Boc-D,L-Lys NCA(8.18g,30.0mmol)和BLG NCA(0.52mg,2.0mmol)溶解在四氢呋喃(110mL)中。将在四氢呋喃(10mL)中的六甲基二硅氮化锂(LiHMDS，668.5mg,4.0mmol)添加到搅拌的单体混合物中，室温搅拌5分钟后，反应完成，混合物减压浓缩。然后，将大量冷石油醚(200mL)倒入混合物中，以沉淀出侧链NHBoc保护的多肽聚合物的白色固体沉淀物。将固体重新溶解在四氢呋喃(20mL)中。在温和搅拌下用三氟乙酸(TFA)处理肽聚合物过夜以除去保护基团。在气流下除去过量的三氟乙酸，然后将大量冷的甲基叔丁基醚(200mL)倒入混合物中，沉淀出已经除去保护基团的聚合物，过滤得到白色固体。在另外两个溶解和沉淀循环之后，在冻干后获得抗菌多肽聚合物。

将0.3kg合成的抗菌多肽聚合物分散于10kg无菌水中进行混合，搅拌，得抗菌多肽聚合物溶液。将1kg聚乙烯醇(醇解度：87.0-89.0mol％，黏度：40-48mPa.s)和0.3kg壳寡糖分散于50kg无菌水中，加热至85-95℃，搅拌溶解，冷却后成为均一的聚乙烯醇/壳寡糖溶液。将以上抗菌多肽聚合物溶液与聚乙烯醇/壳寡糖溶液混合，采用均质机进行混合分散，转速为40000rpm时，剪切时间为200秒。混合均匀，得多肽聚合物复合抗菌剂。

将配制好的抗菌剂灌装液装入灌装机给料桶，定量灌入15mL手动泵喷剂瓶中，形成多肽聚合物复合抗菌喷剂。

抑菌率测试：

以仅包含壳寡糖的单一成分抗菌剂和仅包含多肽聚合物的单一成分抗菌喷剂作为对比样液。将试验菌24h新鲜斜面培养物用PBS洗下，制成5×10

表1处理5分钟抑菌率

表2各抗菌剂的5分钟的最低抑菌浓度MIC和最低杀菌浓度MBC

如表1和表2所示，本申请多肽聚合物复合抗菌喷剂抗菌效率高，对白色念珠球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌5分钟的最低抑菌浓度MIC和5分钟的最低杀菌浓度MBC远小于单独壳寡糖和单独多肽聚合物抗菌喷剂，显示出协同效应，表现出1+1远大于2的效果，并且无致敏、无刺激、超广谱抗菌。

促皮肤修复测试：

首先构建小鼠伤口模型，将背部有伤口的C57BL/6小鼠(6-8周)，将金黄色葡萄球菌悬液(3*106CFU，50μL)滴在创面，分别滴加1mL的生理盐水(对照组)、1mL多肽聚合物复合抗菌喷剂(实施例2制备)、单独同样浓度的壳寡糖喷剂和单独多肽聚合物抗菌喷剂。每隔几天(0，4，7，10，14)记录小鼠的伤口面积。

如图1所示，经过多肽聚合物复合抗菌喷剂处理的小鼠创口愈合速度显著快于对照组、单独壳寡糖组和单独多肽聚合物组的小鼠，显示出壳寡糖和多肽聚合物的协同效果，说明本发明制备的多肽聚合物复合抗菌喷剂能够显著的促进伤口愈合，在第10天小鼠创口基本愈合，在第14天创口已经完全愈合。这主要是由于抗菌多肽聚合物和壳寡糖能够调节免疫，激发巨噬细胞和T细胞，通过细胞因子生产的调制、细胞迁移、增值，促进血管生成和体内抗炎，从而促进创口愈合。

综上所述，本发明合成新型多肽聚合物复合抗菌剂以抗菌多肽聚合物/壳寡糖作为医用抗菌喷剂的抗菌和促修复成分，利用聚乙烯醇作为成膜剂和缓释基材，具有优异广谱抗菌和促修复作用，配方简单，制备工艺简单，价格成本低廉，人体安全性高。

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。