来源于谷子的蛋白质相关的生物材料及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及来源于谷子的蛋白质相关的生物材料及其应用。

背景技术

氮素作为植物生长发育的必需元素和主要限制因子，其在生境中存在状况特别是其含量水平高低对植物生长发育和各种生理代谢有着重要影响。氮素水平的高低不仅直接影响到如叶绿素、蛋白质、生物碱等含氮化合物的合成也和简单酚类如类黄酮、花色素、类胡萝卜素等非含氮化合物的合成有着密切关系。

在农作物培育中，氮肥被广泛应用，氮肥施用不足会影响农作物的生长和产出，而氮肥施用过多不仅会导致植物体内硝态氮的大量积累，过量的氮还会对土壤和地下水中造成严重的污染。因此，选用耐低氮能力强的品种可以减少氮肥的用量、提高氮素的利用效率。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种低氮条件下的氮素高效利用相关基因。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种生物材料的应用，所述应用为下述任一种：

D1)在调控植物的生物产量中的应用；

D2)在制备调控植物的生物产量的产品中的应用；

D3)在调控植物的经济产量中的应用；

D4)在制备调控植物的经济产量的产品中的应用；

D5)在调控植物的主茎穗重中的应用；

D6)在制备调控植物的主茎穗重的产品中的应用；

D7)在调控植物生长中的应用；

D8)在制备调控植物生长的产品中的应用；

D9)在植物育种中的应用；

所述生物材料为下述任一种：

B1)、编码氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质的核酸分子；

B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；

B6)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；

B7)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官。

为了使B1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。

所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质SiNAR2.1B的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质SiNAR2.1B的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质SiNAR2.1B且具有蛋白质SiNAR2.1B功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。

前述应用中所述生物产量可为植物一生中生产和积累的有机物的总量，不包括根系。所述生物产量可为单株地上植株的干重。所述生物产量即为实施例中的生物量(biomass)。

前述应用中所述经济产量为栽培目的所需要的产品收获量。所述经济产量可为禾本科植物的主茎穗重。所述主茎穗重即指主茎穗子的风干重。

前述应用中所述调控植物的生物产量是调控植物在低氮条件下的生物产量。所述低氮条件是指环境中的氮元素含量不能满足植物正常生长发育的环境。所述环境可为土壤或营养液体。

本发明中，所述调控可为上调或增强或提高蛋白质的编码基因表达或蛋白质的含量或活性。

上述生物材料中，所述含有编码SiNAR2.1B的核酸分子的表达盒(SiNAR2.1B基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达SiNAR2.1B的DNA，该DNA不但可包括启动SiNAR2.1B转录的启动子，还可包括终止SiNAR2.1B转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV35S终止子、tml终止子、豌豆rbcSE9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。

可用现有的表达载体构建含有所述SiNAR2.1B基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1305、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

具体而言，B1)所述核酸分子为如C1)、C2)或C3)所示的所述蛋白质的编码基因：

C1)编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子；

C2)核苷酸序列是SEQ ID No.3的cDNA分子或DNA分子；

C3)与C2)限定的cDNA或DNA分子杂交且编码具有相同功能的蛋白质的cDNA分子或DNA分子。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。

本发明中所述植物为下述任一种：

G1)单子叶植物或双子叶植物；

G2)禾本科植物；

G3)狗尾草属植物；

G4)粟种植物；

G5)谷子。

本发明还提供了蛋白质的下述任一种应用：

D1)在调控植物的生物产量中的应用；

D2)在制备调控植物的生物产量的产品中的应用；

D3)在调控植物的经济产量中的应用；

D4)在制备调控植物的经济产量的产品中的应用；

D5)在调控植物的主茎穗重中的应用；

D6)在制备调控植物的主茎穗重的产品中的应用；

D7)在调控植物生长中的应用；

D8)在制备调控植物生长的产品中的应用；

D9)在植物育种中的应用；

所述蛋白质为下述任一种：

A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；

A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的由A1)衍生的或与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性的蛋白质；

A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。

此外，前文所述生物材料、蛋白质和核酸分子均属于本发明的保护范围。

氮肥的过量施入导致了土壤结构破坏和环境污染等问题，本发明通过实验表明，在低氮条件下，过表达SiNAR2.1B基因的植株的草重、主茎穗重和生物量都显著高于野生型植株。由此可见，SiNAR2.1B基因可高效利用氮素。利用SiNAR2.1B进一步培育氮高效品种，可作为应对上述问题的有效方法之一，进而保证农业的可持续发展。

附图说明

图1为SiNAR2.1B过表达材料在正常和低氮处理条件下的表型分析。其中，A图为正常条件下WT、过表达植株OE1和过表达植株OE2植株的表型，B图为低氮条件下WT、过表达植株OE1和过表达植株OE2植株的表型；C图为正常条件下WT、过表达植株OE1和过表达植株OE2植株的草重统计结果，D图为低氮条件下WT、过表达植株OE1和过表达植株OE2植株的草重统计结果；E图为正常条件下WT、过表达植株OE1和过表达植株OE2植株的主茎穗重统计结果，F图为低氮条件下WT、过表达植株OE1和过表达植株OE2植株的主茎穗重统计结果；G图为正常条件下WT、过表达植株OE1和过表达植株OE2植株的生物量统计结果，H图为低氮条件下WT、过表达植株OE1和过表达植株OE2植株的生物量统计结果。图1中，不同小写字母表示具有显著差异，P<0.05。

图2为SiNAR2.1B在正常和低氮处理条件下，不同时间段中根、茎和叶中的表达情况。其中，CK表示正常条件组，LN表示低氮条件组，R表示根，S表示茎，L表示叶。

图3为SiNAR2.1B的亚细胞定位。

图4为SiNAR2.1B和SiNRT2家族相关基因的酵母双杂和BIFC互作。

图5为SiNAR2.1B和SiNRT1.1A、SiNRT1.1B的互作。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

谷子Ci846(谷子品种846)和豫谷一号：记载于文献“Guanqing Jia,XuehuiHuang,Hui Zhi,Yan Zhao,Qiang Zhao,Wenjun Li,Yang Chai,Lifang Yang,Kuny anLiu,Hengyun Lu,Chuanrang Zhu,Yiqi Lu,Congcong Zhou,Danlin Fan,Qijun Weng,Yunli Guo,Tao Huang,Lei Zhang,Tingting Lu,Qi Feng,Hangfei Hao,Hong kuan Liu,Ping Lu,Ning Zhang,Yuhui Li,Erhu Guo,Shujun Wang,Suying Wang,Jinrong Liu,Wenfei Zhang,Guoqiu Chen,Baojin Zhang,Wei Li,Yongfang Wang,Haiquan Li,BaohuaZhao,Jiayang Li,Xianmin Diao,Bin Han.A haplotype map of genomic variationsand genome-wide association studies of agronomic traits in foxtail millet(Setariaitalica).Nat Genet.2013Aug；45(8):957-61.doi:10.1038/ng.2673.Epub2013Jun 23.”，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

pCAMBIA1390载体：购买于上海联迈生物工程有限公司(LMAl Bio)，货号LM-2101。

下述实施例采用GraphPad Prism8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用One-way ANOVA检验，P＜0.05(*)表示具有显著性差异。

实施例1、过表达植株的构建

一、SiNAR2.1B转基因过表达植株的获得

SiNAR2.1B是氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质，其来源于谷子。SiNAR2.1B的基因组基因的核苷酸序列是SEQ ID No.4，SiNAR2.1B基因的转录本cDNA序列是SEQ ID No.3，SiNAR2.1B基因的CDS序列是SEQ ID No.2。

SEQ ID No.4(2010bp)

SEQ ID No.3(975bp)

SEQ ID No.2(612bp)

SEQ ID No.1(203aa)

通过农杆菌介导的转化方法将pCAMBIA1390-SiNAR2.1B载体转入谷子品种846中，获得了两个阳性过表达植株。具体过程如下：

1、重组载体pCAMBIA1390-SiNAR2.1B是以核苷酸序列为SEQ ID No.2的DNA分子和经Pst1单酶切后的pCAMBIA1390载体连接得到的重组表达载体，重组载体pCAMBIA1390-SiNAR2.1B表达SiNAR2.1B基因。

2、将重组载体pCAMBIA1390-SiNAR2.1B通过冻融法导入农杆菌EHA105菌株，侵染谷子Ci846(以下简称野生型(WT))的幼胚，得到T0代植株。农杆菌转化法由中国农业科学院作物科学研究所张皓珊研究员进行转化。具体步骤如下：

3、PCR验证

分别提取野生型(WT)和T0代植株的基因组DNA，利用SiNAR2.1B过表达检测引物(F/R)验证前述植株是否为转基因阳性植株。

F：5'-GCCCTGCCTTCATACGCTATTT-3'；

R：5'-CAAGACCGGCAACAGGATTCA-3'。

结果表明，共有2株T0代植株为SiNAR2.1B过表达植株，分别命名为OE1和OE2。将T0代OE1和OE2移植至温室栽培，分别单株收种，得到T1代转基因种子，之后繁殖得到纯合T2代种子，进行下述实验。

二、SiNAR2.1B过表达植株在正常和低氮处理条件下的表型分析

表1-1改良后的霍格兰营养液

本试验采取随机区组设计，两个施氮水平，即低氮(LN，正常浇水)、正常(CK，浇改良后的霍格兰营养液)。每个处理重复三次，选用大田中反复种植作物消耗氮素后的土壤种植谷子，将野生型(WT)和过表达植株(WT、OE1和OE2)分别种植在花盆中，每个花盆种植3株，到两叶一心期进行间苗，每个花盆只保留一株健康谷子植株。随后，LN处理的谷子每隔一段时间正常浇水，CK处理的谷子每隔一段时间浇营养液，保证谷子的正常水量供给。除前述处理条件不同外，其它环境条件均相同。于成熟期进行室内考种，测定相关性状。

草重(Straw weight,SW)：是指谷子除穗子外的地上部分(包括分蘖、分枝和叶片)的风干重。

生物量(biomass)：单株地上植株的风干重。

主茎穗重(Main stem spike weight)：主茎穗子的风干重。

结果如图1所示，在正常条件下，WT和过表达植株间表型无明显差异(图1中A图)，而在低氮处理条件下，SiNAR2.1B过表达植株较WT的生长延迟(图1中B图)。统计结果表明，过表达植株在低氮处理条件下，其草重(图1中D图)、生物量(图1中F图)和主茎穗重(图1中H图)均显著高于WT(P<0.05)。

三、SiNAR2.1B在正常和低氮处理条件下，不同时间段中根、茎和叶中的表达情况

低氮组(图2中LN)：为了研究SiNAR2.1B在正常(CK)和低氮(LN)条件下，在处理后0、1、3、6、12、24h根、茎、叶中的表达情况，挑选豫谷一号的饱满健康的种子，室温下浸泡过夜，随后将其埋入蛭石中，光照14h/10h、温度24℃/21℃、湿度60％培养，当长出一叶一心(约7d)，挑选健康一致的幼苗，移入96孔黑色避光水培盒中，用低氮营养液(改良后的霍格兰营养液中Ca(NO

SiNAR2.1B-F：GCGTGCTGAGTTCTTAATTTCC

SiNAR2.1B-R：TGCACCCGTGTAAATCCATC

Siactin-F：GGCAAACAGGGAGAAGATGA

Siactin-R：GAGGTTGTCGGTAAGGTCACG

对照组(图2中CK)：将豫谷一号的种子按照低氮组所述方法处理并种植，并且以正常营养液替代低氮组中的低氮营养液，其他操作同低氮组。

结果如图2所示，SiNAR2.1B在根和叶中受低氮诱导上调表达，且在叶片中的表达量要高于根系中(图2)。

四、SiNAR2.1B的亚细胞定位

1、载体构建

将SiNAR2.1B的CDS序列连接到经过BamHI酶切后的16318hGFP载体上，得到重组载体SiNAR2.1B-16318hGFP，该重组载体SiNAR2.1B-16318hGFP可表达融合蛋白SiNAR2.1B-16318hGFP。以空载体16318hGFP为空白对照载体(即图3中的GFP-EV)，操作同SiNAR2.1B-16318hGFP。

用于SiNAR2.1B亚细胞定位的SiNAR2.1B-16318hGFP的引物序列如下(下划线表示酶切位点BamHI)：

SiNAR2.1B-16318hGFP-F:

TATCTCTAGA

SiNAR2.1B-16318hGFP-R:

TGCTCACCAT

2、原生质体制备及镜检

挑取两叶期的豫谷1号，切割至0.2mm左右，置于10mL酶解液(1.25％CelluloseR10和0.75％Macerozyme R10)中酶解，黑暗真空30min，50r/min酶解4h；加入等体积W5溶液，经120目细胞筛过滤，以100r/min离心3min，弃上清；加入1mLW5溶液洗涤原生质体，之后以100r/min离心3min；弃上清，加入1mLMMG溶液重悬，暗保存。

PEG-钙介导法：吸10μL(2μg/μL)质粒DNA(步骤1中制备的重组载体SiNAR2.1B-16318hGFP或空载体16318hGFP)于2mL离心管，缓慢加入100μL上述原生质体悬浮液，并混匀；加入110μL 40％PEG溶液，缓慢混匀，黑暗条件下转染15min；加入400μL W5溶液，终止转染，以120r/min离心2min；去上清，加入1mL W5溶液，暗培养12h。

3、原生质体亚细胞定位观察

用共聚焦显微镜(Zeiss LSM980，CarlZeiss，Oberkochen，德国)观察原生质体细胞中的荧光，并用Zen2010软件(CarlZeiss，Oberkochen，德国)获取图像。

结果见图3(标尺＝10μm)，上面的为转入16318hGFP空载体的对照(GFP-EV)；下面的为转入重组载体SiNAR2.1B-16318hGFP的原生质体(SiNAR2.1B-16318hGFP)中SiNAR2.1B定位图，由图可知SiNAR2.1B主要定位于细胞膜。

五、SiNAR2.1B和SiNRT2家族相关基因的酵母双杂和BIFC互作

1、酵母双杂交实验方法：

1.1载体构建

膜系统酵母双杂交体系中，根据诱饵蛋白质的定位不同，需要选择不同的载体以便于与互作蛋白相连的泛素NubG和Cub-LexA-VP16可以相互作用，从而被泛素特异性蛋白酶(UBPs)识别、切割、启动报告基因表达。由于SiNAR2.1B的N端和C端均位于胞质内，因此诱饵蛋白载体选用pBT3-N，猎物蛋白载体选用pPR3-N。限制性酶切位点分别选用Noc I和EcoRI，对pBT3-N和pPR3-N载体进行酶切。酶切体系如表2-1。

表2-1酶切体系

酶切后电泳纯化酶切产物，并进行胶回收，再用

表2-2

1.2复苏酵母菌

将酵母细胞采用划线法接种到YPD固体培养基中培养1周左右，至培养基上长出白色单克隆。

1.3酵母感受态细胞的制备

(1)挑取酵母单克隆接种至1mL的YPD液体培养基中，30℃，250rpm培养3-5h；

(2)将酵母菌转移至50mL YPD培养基中，30℃，250rpm过夜培养至OD

(3)将酵母菌液转移至50ml无菌的离心管中，室温，700g离心5min；

(4)弃去上清，加入25～50ml无菌ddH2O轻柔重悬酵母；

(5)室温下1000g离心5min；

(6)轻轻倒去上清，将细胞重悬于1.5ml无菌的醋酸锂中，备用。

至此，酵母感受态细胞制备完成。以上操作除离心外均在超净工作台中进行。

1.4质粒的转化

(1)向无菌的1.5mL离心管中加入诱饵质粒DNA(pBT3-N)和捕获质粒DNA(pPR3-N)各0.1ug，再加入0.1mg鲱鱼精载体DNA，轻弹管壁混匀；

(2)向管中加入250uL无菌的PEG/LiAc溶液(购于TAKARA公司，货号为630439)，快速振荡混匀；

(3)30℃，200rpm，振荡培养30min；

(4)向管中加入20uL DMSO，轻弹混匀；

(5)42℃水浴热激15min，期间每5min上下颠倒混匀一次；

(6)取出后立即在冰上冰浴1-2min；

(7)室温下，3000rpm离心5min，弃上清；

(8)用0.5mL无菌的生理盐水重悬酵母菌；

(9)取约100uL体积的菌液涂布在选择性SD固体培养基平板上，包括二缺(SD/–Leu/–Trp)和四缺(SD/–Ade/–His/–Leu/–Trp)培养基，涂布后放置在30℃培养箱中培养2-4天，直至长出菌斑，并记录实验结果；

2、BIFC互作实验方法：

BIFC验证SiNAR2.1B与SiNRT2家族基因互作采用Q6和Q10载体，酶切位点均选用BamH I，酶切和连接方法同上。采用PEG介导法进行谷子原生质体的转化。用Zeiss LSM 700(德国)共聚焦显微镜观察原生质体中的YFP的荧光信号，用ZEN 2010软件获取图片。具体操作步骤如下：

(1)培养谷子幼苗，约一周左右大小时进行试验；

(2)配置15mL酶解液，酶解液配方如表3-1：

表3-1酶解液配制体系

配制完成后，55℃水浴10min，冷却至室温后加入1mL 0.15M的CaCl

(3)将叶片切成约0.5mm宽的细条，使其完全浸于酶解液中，抽真空30min；

(4)在28℃，转速为50rpm的摇床上避光酶解3小时左右，使细胞壁充分裂解；

(5)加入等体积预冷的W5溶液，轻轻摇晃，使原生质体释放出来；

(6)用100目的筛子过滤原生质体至50mL离心管中；

(7)转速100g，加速度为1，离心2min；

(8)弃上清，用预冷的W5溶液轻轻重悬原生质体(W5溶液的量根据原生质体的量而定)，动作要轻柔，重悬后冰上静置30min，W5溶液配方如表3-2：

表3-2W5溶液配制体系

配制好后用KOH溶液调pH至5.8，高温、高压灭菌20min，室温保存；

(9)转速100g，加速度为1，离心2min；

(10)弃上清，用400μLMMG溶液轻轻悬浮原生质体。到此，原生质体的制备就已全部完成。MMG溶液的配制方法如表3-3：

表3-3MMG溶液配制体系

(11)分别取浓度约1000ng/μL的两种互作质粒10μL于2.0mLEP管中，加入100μL的原生质体，轻弹混匀；

(12)加入110μL的PEG4000溶液并迅速轻弹混匀，室温，避光诱导30min，PEG4000溶液的配制方法如表3-4：

表3-4PEG4000溶液配制体系

(13)加入两倍体积的W5溶液终止反应，转速100g，加速度为1，离心1min；

(15)弃上清，加入200μL的W5溶液轻柔混匀，置于23℃培养箱中避光培养16-18h；

(16)在激光共聚焦显微镜下观察黄色荧光信号。

酵母双杂交实验结果如图4所示，SiNAR2.1B不能够和SiNRT2.1、SiNRT2.3、SiNRT2.4、SiNRT2.5、SiNRT2.6、SiNRT2.8互作(图4)。鉴于前述实验结果以及SiNAR2.1A的互作结果，从中挑选了3个互作较强SiNRT2家族基因(SiNRT2.3、SiNRT2.5、SiNRT2.6)和SiNAR2.1B进行BIFC实验，发现SiNAR2.1B不能够和SiNRT2.3、SiNRT2.5、SiNRT2.6互作，进一步支持了酵母双杂交的结果。

六、SiNAR2.1B和SiNRT1.1A、SiNRT1.1B的互作

SiNAR2.1B与SiNRT1.1的互作采用nLUC载体和cLUC载体，nLUC酶切位点选用KpnI和SalI双酶切，cLUC酶切位点选用KpnI和BamHI双酶切。将SiNAR2.1B与cLUC载体构建融合载体，SiNRT1.1A和SiNRT1.1B分别与nLUC载体构建融合载体。通过农杆菌转化法，注射烟草，48h后用植物活体成像仪(NightSHADELB985)进行观察。

通过LUC实验表明，SiNAR2.1B能够和SiNRT1.1A、SiNRT1.1B互作(图5)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。