萘醌类化合物及其制备方法、药物组合物和应用

技术领域

本发明涉及一种萘醌类化合物及其制备方法、药物组合物和应用，尤其涉及一种具有癌细胞干性抑制活性的萘醌类化合物及其制备方法、药物组合物和应用。

背景技术

肿瘤的形成是一种渐进和复杂的过程，在此过程中血管生成起着十分重要的作用。肿瘤血管生成之前，肿瘤体积至多不超过23mm

完成新生血管生成的单元有内皮细胞(ECs)、肿瘤细胞和肿瘤干细胞(CSCs)，它们表达和分泌多种因子，激活基质和ECs的生长和迁移，协调病理血管龛的形成。CSCs的生态以缺氧为特征，可通过上皮细胞向间充质细胞转化(EMT)和间充质细胞向上皮细胞转化(MET)的循环遗传过程实现癌细胞的侵袭和转移。在此循环遗传过程中，产生如内皮生长因子(VEGF)和白细胞介素8(IL-8)高水平的血管生成因子促进肿瘤新生血管。因此，抑制ECs对血管生成因子的反应和肿瘤细胞血管生成表型，可以有效降低癌细胞干性和肿瘤进展。

乙醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)是一种四连体蛋白。目前已在人类的基因组编码中发现19种ALDH的功能基因，这些基因可参与一系列外源性和内源性醛的NAD(P)

基于ALDH过度表达在癌症进展和治疗耐药中的作用，一些现有的小分子也被报道具有抑制ALDH的活性，如对二甲胺基苯甲醛(DEAB)、DIMATE、柠檬酸(citral)和达克罗宁(dyclonine)等。虽然它们单独用药或联合其它药物在体内外对多种癌细胞和肿瘤模型表现出一定的抑制作用，但是作为抗肿瘤药物其成药性较差，如DEAB的抑制活性受ALDH表达水平高低的影响，DIMATE的口服生物利用度尚未报道，柠檬醛具有严重的脱靶毒性，达克罗宁虽然应用较为广泛，但对肿瘤模型有效抑制剂量下会产生严重的毒副作用。目前已有针对ALDH1A1特异性抑制剂的报道，如CPD3、CM026、NCT-501和NCT-506等，但它们也都因为有限的疗效、生物利用度低、毒副作用大或难以实现口服给药等原因而难以成药。

发明内容

发明目的：本发明的第一目的是提供一种萘醌类化合物，第二目的是提供一种所述化合物的制备方法，第三目的是提供一种包含所述化合物的药物组合物，第四目的是提供一种所述化合物及其药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。

技术方案：本发明所述的萘醌类化合物具有式I的结构，还包含其药学上可接受的盐：

其中：

X选自-NH

优选，所述结构中：

X选自-NH

优选，所述结构中：

-C(O)NH-X位于所连接苯环的亚甲基的间位或对位。

当X为苯基时，其上取代基为至少一个氢、Br、F、Cl、-NH

优选，所述结构中：

X选自-NH

具体地，所述的萘醌类化合物选自以下任一的化合物：

本发明设计的化合物可选择性地有效抑制ALDH1A1酶活性和强效抑制肿瘤细胞，其在癌症和其它适应症中具有潜在效用，具有抑制癌细胞干性的能力。

进一步地，所述药学上可接受的盐为所述萘醌类化合物与选自以下任一的酸形成的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸、杏仁酸或阿魏酸。

本发明所述的萘醌类化合物的制备方法包含以下步骤：

1,4-萘醌与3-或4-苄基叠氮苯甲酸通过成环反应生成含有羧基的中间体IP，然后经缩合反应，得到所述萘醌类化合物I；

其中，中间体IP参照文献(J.Med.Chem.,2015,58,7807-19)方法制备，目标产物I中X的定义如前所述；

将相应的酸与以上方法制备的化合物I成盐，即得所述化合物的药学上可接受的盐。

具体方法如下：

1,4-萘醌和3-或4-苄基叠氮苯甲酸通过成环反应生成含有羧基的中间体IP，然后经缩合反应，得到所述萘醌类化合物I：

其中，EtOAc代表乙酸乙酯，HATU代表2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐，DIPEA代表N,N-二异丙基乙胺，DMF代表N,N-二甲基甲酰胺。

本发明所述的药物组合物包含所述的萘醌类化合物以及药学上可接受的载体，具体通过添加香料、甜味剂、液体/固体填料、稀释剂等常用药用辅料，制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、糖浆、悬浮剂或注射剂。

本发明所述的萘醌类化合物或其药物组合物应用于制备抗肿瘤药物，具有选择性抑制ALDH1A1酶活性的特性。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：

该类化合物可有效抑制ALDH1A1酶活性(IC

附图说明

图1为化合物22对癌症干细胞蛋白标志物的抑制作用结果。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例中所有试剂均为分析纯。化合物的核磁光谱由Bruker ARX-600核磁共振仪测定，内标为TMS；高分辨质谱采用Agilent6224 TOF LC/MS仪测定。

实施例1：中间体IP的制备

(1)将2.37g的1,4-萘醌和1.77g的3-苄基叠氮苯甲酸溶解在50mL的乙酸乙酯中加热回流反应24h，反应结束后，冷却析出浅黄色固体，过滤，滤饼用冰乙醇冲洗(3×10mL)，得到中间体IP-1。

(2)将2.37g的1,4-萘醌和1.77g的4-苄基叠氮苯甲酸溶解在50mL的乙酸乙酯中加热回流反应24h，反应结束后，冷却析出浅黄色固体，过滤，滤饼用冰乙醇冲洗(3×10mL)，得到中间体IP-2。

实施例2：化合物1的制备

将1.50g的IP-1(实施例1中所得中间体)溶解在20mL的甲醇中，加入5mL的浓硫酸，加热回流24-48h，TLC监测至反应完全。反应结束后将反应液浓缩至约1/3体积，出现絮状物。用饱和碳酸氢钠溶液调节pH至碱性，用乙酸乙酯萃取(3×10mL)，收集有机相，浓缩，再用饱和碳酸氢钠溶液洗1次，饱和氯化钠溶液洗1次，收集有机层，无水硫酸钠干燥，浓缩，用20mL甲醇重结晶得到黄色固体(中间体IP-1的甲酯，1.40g，产率80.4％)。将0.35g上述黄色固体溶解在20mL的甲醇中，在搅拌下缓慢加入0.32g的水合肼，加入回流反应24-48h，TLC检测至反应完全。反应结束后，旋干溶剂，滤饼用10mL甲醇重结晶，得到棕黄色固体0.32g，产率96.7％。

实施例3：化合物2的制备

将0.33g IP-1(实施例1中所得中间体)，0.46g的HATU溶解在10mL的DMF中，室温下搅拌10min，加入0.26g的DIPEA继续搅拌10min，加入2-溴乙氨，N

实施例4：化合物3的制备

采用中间体IP-1和乙醇胺，参考实施例3所述方法制备，得淡粉色固体，产率81.5％。

实施例5：化合物4的制备

采用中间体IP-1和乙二胺，参考实施例3所述方法制备，得到灰白色固体，产率69.7％。

实施例6：化合物5的制备

采用中间体IP-1和N,N-二甲基乙二胺，参考实施例3所述方法制备，最终得到棕褐色固体，产率75.8％。

实施例7：化合物6的制备

采用中间体IP-1和3-氨基丙酸甲酯，参考实施例3所述方法制备，得到土黄色固体，产率83.4％。

实施例8：化合物7的制备

采用中间体IP-1和2,2-二氟乙胺，参考实施例3所述方法制备，得到淡粉色固体，产率90.1％。

实施例9：化合物8的制备

采用中间体IP-1和1-氨基-2-丙醇，参考实施例3所述方法制备，得到灰绿色固体，产率74.9％。

实施例10：化合物9的制备

采用中间体IP-1和3-氨基-1-丙醇，参考实施例3所述方法制备，得到淡粉色固体，产率87.3％。

实施例11：化合物10的制备

采用中间体IP-1和1,3-二氨基丙烷，参考实施例3所述方法制备，得到灰白色固体，产率79.2％。

实施例12：化合物11的制备

采用中间体IP-1和4-氨基丁酸甲酯，参考实施例3所述方法制备，得到土黄色固体，产率79.4％。

实施例13：化合物12的制备

采用中间体IP-1和1-(2-氨乙基)哌啶，参考实施例3所述方法制备，得到土黄色固体，产率80.6％。

实施例14：化合物13的制备

采用中间体IP-1和N-(2-氨基乙基)吗啉，参考实施例3所述方法制备，得到淡黄色固体，产率85.1％。

实施例15：化合物14的制备

采用中间体IP-1和1-(3-氨基丙基)吡咯烷，参考实施例3所述方法制备，得到深棕色固体，产率75.4％。

实施例16：化合物15的制备

采用中间体IP-1和1-(3-氨基丙基)咪唑，参考实施例3所述方法制备，得到灰棕色固体，产率71.6％。

实施例17：化合物16的制备

采用中间体IP-1和N-(3-氨丙基)吗啉，参考实施例3所述方法制备，得到淡黄色固体，产率73.2％。

实施例18：化合物17的制备

采用中间体IP-1和2-溴乙氨，参考实施例3所述方法制备，得到灰白色固体0.30g，产率79.7％。

实施例19：化合物18的制备

采用中间体IP-2和乙醇胺，参考实施例3所述方法制备，得到淡粉色固体，产率73.9％。

实施例20：化合物19的制备

采用中间体IP-2和乙二胺，参考实施例3所述方法制备，得到灰色固体，产率71.2％。

实施例21：化合物20的制备

采用中间体IP-2和N,N-二甲基乙二胺，参考实施例3所述方法制备，得到棕褐色固体，产率75.8％。

实施例22：化合物21的制备

采用中间体IP-2和3-氨基丙酸甲酯，参考实施例3所述方法制备，得到土黄色固体，产率86.7％。

实施例23：化合物22的制备

采用中间体IP-2和2,2-二氟乙胺，参考实施例3所述方法制备，得到淡粉色固体，产率87.2％。

实施例24：化合物23的制备

采用中间体IP-2和1-氨基-2-丙醇，参考实施例3所述方法制备，得到灰绿色固体，产率78.5％。

实施例25：化合物24的制备

采用中间体IP-2和1-(3-氨基丙基)吡咯烷，参考实施例3所述方法制备，得到深棕色固体，产率72.1％。

实施例26：化合物25的制备

采用中间体IP-2和1-(3-氨基丙基)咪唑，参考实施例3所述方法制备，得到灰棕色固体，产率68.4％。

实施例27：化合物26的制备

采用中间体IP-2和苯胺，参考实施例3所述方法制备，得到淡黄色固体，产率63.7％。

实施例28：化合物27的制备

采用中间体IP-2和2-氯苯胺，参考实施例3所述方法制备，得到淡黄色固体，产率48.7％。

实施例29：化合物28的制备

采用中间体IP-2和1,2-苯二胺，参考实施例3所述方法制备，得到淡黄色固体，产率51.4％。

实施例30：化合物29的制备

采用中间体IP-2和3,4-二甲氧基苯胺，参考实施例4所述方法制备，得到淡黄色固体，产率64.2％。

实施例31：化合物30的制备

采用中间体IP-2和1-萘甲胺，参考实施例3所述方法制备，得到淡黄色固体，产率51.8％。

实施例32：化合物31的制备

采用中间体IP-2和4-甲胺-1,1’-联苯，参考实施例3所述方法制备，得到黄色固体，产率67.4％。

实施例33：化合物的细胞毒活性评价

1、实验方法

采用MTT方法对本发明的代表性化合物进行细胞毒活性测试。取对数生长期的细胞计数，接种于96孔培养板内，每孔约8000-10000个细胞。培养过夜，待细胞贴壁后进行给药，分别设给药组和对照组。待测的化合物用DMSO溶液配制成贮液，临用前用细胞培养基稀释成一系列浓度，其中DMSO的终浓度不超过4‰(下面实验类同)。每个浓度设3个复孔。加药后培养72h，加20μL浓度为5mg/mL的MTT，37℃孵育4h，去上清，加入150μL的DMSO溶解。用酶标仪在490波长下测定每孔的OD值，并计算抑制率，做浓度-抑制率曲线计算IC

2、实验结果

测试了本发明代表性化合物对人结肠癌细胞HCT-116、宫颈癌细胞HeLa、肝癌细胞HepG2、卵巢癌细胞A2780、非小细胞肺癌细胞H1975和A549及三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231的抗增殖活性，以二乙氨基苯甲醛(DEAB)、双硫仑和Napabucasin(BBI608)作为阳性对照。通过观察化合物在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况，计算抑制率及其IC

此外，以Napabucasin(BBI608)为阳性对照，还进一步测试了化合物22对人食管癌细胞KYSE-150和TE-1、胰腺癌细胞PANC-1、乳腺癌细胞MDA-MB-453和胶质瘤细胞U251的抗增殖活性；另还以顺铂为阳性对照，测试了化合物22对人鳞状上皮舌癌细胞SCC-9、鼻咽癌细胞CNE-2及其顺铂耐药癌细胞CNE-2/cDDP的抗增殖活性。通过观察化合物22在不同浓度下对肿瘤细胞生长的抑制情况，计算抑制率及其IC

表1.化合物对ALDH1A1酶的抑制活性和对不同癌细胞的抗增殖活性

表2.化合物22对多种癌细胞的抗增殖活性

“-”表示没有测定。

实施例34：化合物的体外酶活性评价

1、实验方法

采用商业化的ALDH1A1试剂盒检测本发明代表性化合物对ALDH1A1酶的抑制活性。ALDH1A1试剂盒和ALDH1A1蛋白均购置于上海抚生实业有限公司。按照ALDH1A1试剂盒说明书提供的说明，测试样品化合物对ALDH1A1酶的抑制活性。

2、实验结果

本发明代表性化合物对ALDH1A1酶的抑制活性也列于表1。

由表1数据可知，在1,4-萘醌左侧结构引入3-(1H-1,2,3-三氮唑-1-亚甲基)苯甲酸，得到相关中间体，然后在中间体结构中通过酰胺键引入含有可以作为氢键供体和/或受体的功能性基团(如卤素原子、羟基、胺基、酯基或杂环基团)的C2-C3脂肪链，得到化合物1-16。其中：

(1)含有酰肼基的化合物1，对ALDH1A1的抑制活性达到63.91nM，优于阳性药物，但其对癌细胞的毒性相对较低，最高的是对A549细胞，IC

(2)当酰胺的脂肪链尾端为胺基时，化合物4、5和10对ALDH1A1的抑制活性一般，IC

(3)当酰胺的脂肪链含有羟基时，如化合物3对ALDH1A1抑制活性较强，IC

(4)当酰胺的脂肪链尾端含有2个强电负性的氟原子时，化合物7对ALDH1A1的抑制活性达到了37.11nM，同时对多种癌细胞也表现出较强的细胞毒性，对所测癌细胞的IC

(5)当酰胺的脂肪链尾端含有酯基时，如化合物6和11，它们对ALDH1A1的IC

(6)当酰胺的脂肪链尾端为含有氮原子、氧原子的饱和或不饱和的五元-六元杂环时，所得化合物12-16对ALDH1A1的抑制活性一般，对应的IC

在1,4-萘醌右侧结构引入4-(1H-1,2,3-三氮唑-1-亚甲基)苯甲酸，得到相关中间体，然后在中间体结构中通过酰胺键引入含有可以作为氢键供体和/或受体的功能性基团(如卤素原子、羟基、胺基、酯基或杂环基团)的C2-C3脂肪链，得到化合物17-25。由表1数据可知，当在苯环亚甲基对位的酰胺引入脂肪链时，所得化合物对ALDH1A1酶的抑制活性和对所测癌细胞的细胞毒性通常高于在苯环亚甲基间位的酰胺引入对应的脂肪链的化合物。如化合物22，其对ALDH1A1的IC

由表2数据可知，化合物22对所测癌细胞表现出很强的抗增殖活性，有的优于阳性对照物BBI608或与之相当；在对头颈癌细胞时，化合物22表现出优于顺铂的抗增殖活性，并且可以克服顺铂耐药。

实施例35：化合物22对人激酶的抑制活性评价

1、实验方法

基于化合物22对ALDH1A1酶的高抑制活性，我们通过ICE生物科学有限公司(北京)提供的商业化激酶谱筛选服务，测定了1μM化合物22对207个人类激酶的抑制活性。

2、实验结果

结果见表3，化合物22对所测207个激酶的任何一个没有表现出强的抑制活性。在1μM浓度下化合物22对HIPK1酶的抑制率仅为34.18％，而对其它所测激酶的抑制率均小于32％。

表3.化合物22对激酶的抑制作用

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实施例36：化合物22的干性抑制活性评价

1、对癌症干细胞标志物CD133和CD44的抑制

(1)实验方法

取对数生长期的HepG2细胞计数，接种于2块6孔培养板内，培养至细胞贴壁后进行给药，分别加入10μM的BBI608和不同浓度的化合物23(5、10和20μM)，空白组作为对照。24h后离心收集细胞，每个离心管中加入300μL PBS，在一块6孔板的不同孔中加入1μL CD133-FITC抗体，在另外一块6孔板的各孔中分别加入1μL CD44-FITC抗体，避光孵育30min，分别转移至2mL离心管中，用流式细胞仪测定。

(2)实验结果

表4.化合物22对CD133的抑制效果

表5.化合物22对CD44的抑制效果

以BBI608作为阳性对照，测定了化合物22对HepG2细胞内干细胞标志物CD133和CD44表达的影响，所得结果分见表4和表5。由结果可知，HepG2细胞与样品孵育24h后，化合物22在10μM下，对癌症干细胞标志物CD133和CD44的抑制率分别为41.52％和45.44％，高于等浓度下BBI608对CD133和CD44的抑制率。此外，化合物22对CD133和CD44呈现剂量依赖性抑制，表现出较强的对癌细胞干性的抑制能力。

2、对癌症干细胞标志物OCT4、Nanog和SOX2蛋白的抑制

(1)实验方法

①蛋白提取。在6孔板的各孔中加入2.0mL浓度为1×10

②蛋白定量及其制样。采用考马斯亮蓝G250法在Varioskan多模微板分光光度计上测定蛋白质含量，之后在提取的蛋白中加入Loading Buffer，100℃煮样15min。

③SDS-PAGE凝胶的制备与上样。将提前配置好的12％的分离胶中加入TEMED并吹打均匀，转入电泳仪的凹凸玻璃板内，并立即用水密封。待胶完全凝固后，去除水分，加入6％的浓缩胶，插入槽齿。待胶完全凝固后缓慢拔掉槽齿，并在凝胶的槽齿中加入用SDS稀释的上述样品10.0μL，并加入Marker作为参考。将电泳仪电压调制100V跑胶30min，再调制150V，待Marker完全分开，Loading Buffer跑到凝胶最下方时停止。

④转膜。将PVDF膜用甲醇完全浸湿，和滤纸一起完全浸泡在转膜液中。取出上述凝胶，将含有目标蛋白的部分完全置于转膜液中浸泡10min，之后和PVDF一起放入半干转膜仪上，350mA电流下转膜45-60min。结束后将PVDF膜放入5％脱脂奶粉中，置于摇床上封闭90min。

⑤免疫与曝光。将上述封闭好的PVDF膜放在摇床上用TBST清洗。孵育一抗4℃下过夜，结束后在摇床上用TBST清洗，重复五次，每次30min。摇晃孵育二抗37℃下孵育1h，结束后在摇床上用TBST清洗，重复五次，每次10min。最后用Odyssey扫描系统进行成像。

(2)实验结果

通过Western blot分析了化合物22在不同浓度下对HepG2细胞中癌症干细胞标志物OCT4、Nanog和SOX2蛋白的表达情况，评估了化合物22对HepG2细胞的干性抑制作用，同时选用索拉非尼和BBI608作为阳性对照。由图1可知，化合物22对癌症干细胞标志物OCT4、Nanog和SOX2蛋白的表达呈现剂量依赖性抑制作用。在10μM的相同给药浓度下，化合物22的对上述三种蛋白的抑制作用明显优于BBI608，而索拉非尼无明显抑制作用。以上结果表明化合物22对癌细胞干性具有强效抑制作用。

综上所述，本发明是以1,4-萘醌为母体化合物，通过结构修饰得到一类新型的化合物。该类化合物具有明显的抗癌活性，部分化合物对癌细胞的细胞毒性和对ALDH1A1酶的抑制活性均优于阳性对照药物。通过流式细胞仪和Western blot实验进一步证实化合物22对癌症干细胞标志物CD133和CD44及对OCT4、Nanog和SOX2蛋白都具有强效的抑制作用，抑制能力高于BBI608，可用于制备抗肿瘤药物。