番茄SlMYB13蛋白及其编码基因在调控植物耐盐、耐旱性中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及番茄SlMYB13蛋白及其编码基因在调控植物耐盐、耐旱性中的应用。

背景技术

番茄 （

传统育种方式改良植物性状耗时久、工作量大且育种结果存在不确定性，不能满足当今植物育种的需求。而分子育种可以快速定向修饰植物基因，极大地提高了育种效率。通过分子育种方法来控制基因表达以改良植物性状，为培育优良品种提供理论依据和种质资源，是植物育种发展的重要方向。

目前该方面研究表明：土壤盐碱化是限制植物生长发育的重要非生物胁迫之一，盐胁迫可导致离子胁迫、植物细胞渗透失衡、pH值过高，尤其是细胞内部氧化对植物的危害非常大。MYB转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，直接参与植物苯丙烷类次生代谢，调节植物的生长发育、次生代谢以及相应的生物胁迫与非生物胁迫。SlMYB86-RNAi的T2代幼苗进行高浓度盐处理后，与野生型相比，SlMYB86-RNAi幼苗萎蔫更慢，这表明沉默SlMYB86基因增强了番茄在盐胁迫下的抗性，SlMYB86是抗盐性的负调控因子。另外，盐胁迫条件下，SlMYB102的过表达能提高ROS清除酶的活性，过表达植株抗氧化剂的含量增加，脯氨酸（Pro）的含量也比野生型高，表明SlMYB102正调控番茄盐胁迫反应。干旱同样为渗透胁迫，严重影响植物的生长发育及产量，利用 VIGS 技术验证 SlMYB14 基因的功能，发现与野生型相比，沉默 SlMYB14 基因番茄植株的抗旱能力减弱，表明 SlMYB14 是番茄面对干旱胁迫的正调控因子。SlMYB86 负调控番茄的抗旱性，与野生型幼苗相比，SlMYB86-RNAi幼苗对干旱胁迫的耐受性更强，叶片失水速率和丙二醛（MDA）含量比野生型更低，而其相对水分、叶绿素含量则明显高于野生型。SlMX1 编码番茄 MYB 转录因子，过表达 SlMX1 番茄植株的耐旱性显著增强，与野生型相比果实品质也得到了改善，SlMX1 可以提高番茄的抗旱能力。

因此，从基因水平改良番茄的耐盐水平，培育耐盐番茄新品种是解决番茄盐碱栽培的根本手段。MYB转录因子的研究为培育耐盐性番茄新品种提供了理论依据，对番茄生产及盐碱地开发利用具有重要的指导及实践意义。

发明内容

为了进一步解决现有技术问题，在现有研究的基础上，本发明进一步对番茄野生型材料进行盐胁迫处理，提取RNA，利用转录组分析筛选能够明显响应盐胁迫的基因，分析后获得基因SlMYB13，后经过其他逆境胁迫，发现干旱胁迫同样强烈抑制SlMYB13的表达。

本发明的技术方案包括：

第一方面，本发明提供番茄SlMYB13蛋白或其编码基因在调节番茄耐盐中的应用，具体通过使番茄SlMYB13蛋白失活或使其编码基因降低表达或不表达。

第二方面，本发明提供番茄SlMYB13蛋白或其编码基因在番茄耐旱中的应用。进一步的，具体通过使番茄SlMYB13蛋白失活或使其编码基因降低表达或不表达。

第三方面，本发明提供番茄SlMYB13蛋白或其编码基因在耐盐或/和耐旱番茄遗传育种或转基因植物制备中的应用。

本发明中，所述番茄SlMYB13蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

（1）如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

（2）如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

（3）与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列；优选地，所述同源性为至少90%；更优选为95%。

本发明中，番茄SlMYB13蛋白的编码基因的CDS序列具有如下任一种核苷酸序列：

（1）如SEQ ID NO.2所示的核苷酸；

（2）如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列经一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的核苷酸序列。

上述如SEQ ID NO.2 所示的核苷酸序列为番茄中SlMYB13蛋白的CDS序列。考虑到密码子的简并性，所有编码所述番茄SlMYB13 蛋白的核苷酸序列均在本发明的保护范围内。

本发明中，优选的，通过抑制因子抑制番茄SlMYB13蛋白的编码基因的表达，所述抑制因子为gRNA或干扰RNA，

优选地，所述gRNA的靶序列为所述番茄SlMYB13蛋白的编码基因的第三个外显子的第135-154位。

更优选地，所述gRNA包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

上述gRNA的靶位点为本发明通过大量筛选获得，利用上述 gRNA能够高效实现番茄SlMYB13蛋白的编码基因的部分敲除，使得番茄SlMYB13失活。

第四方面，本发明提供一种编辑番茄SlMYB13基因的gRNA，所述gRNA的靶序列为所述番茄SlMYB13基因的第三个外显子的第135-154位。

上述gRNA可与CRISPR/Cas9基因编辑系统配合作用，实现番茄SlMYB13基因的高效敲除。

优选地，所述gRNA包含如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。

第五方面，本发明提供包含所述用于编辑番茄SlMYB13基因的gRNA的生物材料，所述生物材料包括表达盒、载体、转基因细胞或工程菌。

所述表达盒可为含有AtU6启动子和所述gRNA的表达盒；

所述载体可为含有AtU6启动子、所述gRNA以及Cas9表达盒的CRISPR-Cas9基因编辑载体；

所述工程菌可为含有所述CRISPR-Cas9基因编辑载体的大肠杆菌或农杆菌。

第六方面，本发明提供一种调控植物耐盐、耐旱性的方法，其包括：调控SlMYB13基因的表达量。

所述番茄SlMYB13基因的编码蛋白具有如下任一种氨基酸序列：

（1）如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；

（2）如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列经一个或多个氨基酸的替换、插入或缺失得到的具有相同功能蛋白的氨基酸序列；

（3）与如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有至少80%同源性的氨基酸序列；

优选地，所述同源性为至少90%；更优选为95%。

优选地，上述方法中，通过降低所述植物中番茄SlMYB13基因的表达量，提高所述植物的耐盐、耐旱性；或者，通过将番茄SlMYB13基因的失活突变株系与其他株系杂交，培育耐盐、耐旱性株系。

上述降低所述植物中番茄 SlMYB13 基因的表达量可通过本领域常规技术手段实现。

优选地，降低所述植物中番茄SlMYB13基因的表达量为利用CRISPR/Cas9 系统实现，所述CRISPR/Cas9系统使用的gRNA的靶序列包含所述番茄SlMYB13基因第三个外显子上含有 NGG 序列特征的序列，具体为SlMYB13基因的第三个外显子的第135-154位。

作为本发明的优选实施方式，所述CRISPR-Cas9系统的构建方法为将所述gRNA连接到载体上得到重组crispr/cas9载体。

本发明中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。所述植物包括但不限于番茄、水稻、拟南芥、葡萄、大豆、黄瓜、小麦、玉米等。

本发明提供番茄SlMYB13蛋白及其编码基因在调控植物耐盐、耐旱性中的应用，具备如下有益效果：

本发明通过筛选分析发现番茄SlMYB13基因能够负调控植物耐盐、耐旱性，通过降低SlMYB13基因的表达量，可有效提高植物耐盐、耐旱性。SlMYB13基因耐盐、耐旱性调控功能的发现为培育耐盐、耐旱性植物新品种提供了宝贵的基因资源和新的方法。一方面可通过将栽培番茄的SlMYB13基因定点突变，获得耐盐、耐旱性更强的番茄品系；另一方面，也可利用本发明提供的SlMYB13基因失活植株与其他番茄品种杂交，培育耐盐、耐旱品系，丰富番茄耐盐种质资源。SlMYB13基因及其抑制因子在番茄耐盐、耐旱性育种中具有重大的应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例1中SlMYB13构建基因编辑载体pHSbdcas9i-SlMYB13重组质粒图谱；

图2为本发明实施例1中构建基因编辑载体pHSbdcas9i-SlMYB13转化大肠杆菌菌斑鉴定；M为DNA Mark，泳道编号为转化菌斑编号，条带大小由上向下依次为6000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；

图3为本发明实施例1中PCR筛选含有Cas9基因的部分转化植株的电泳检测结果图，其中，泳道编号为转化植株编号，CK为野生型对照植株，M为DNA Mark，条带大小由上向下依次为1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp；

图4为本发明实施例1中SlMYB13基因的基因结构以及纯合突变体植株的SlMYB13基因靶序列突变情况，WT为野生型；-表示碱基缺失；

图5为本发明实施例2中提供的SlMYB13基因敲除株系（myb13-29）和野生型（WT）材料干旱和盐胁迫处理下种子萌发对照图；

图6为本发明实施例2中提供的SlMYB13基因敲除株系（myb13-29）和野生型（WT）材料干旱、盐胁迫处理前后的生长状态对照图；

图7为本发明实施例2中提供的SlMYB13基因敲除株系（myb13-29）和野生型（WT）材料干旱、盐胁迫处理后相关酶活性的比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对发明作进一步说明，可以使本领域的技术人员进一步理解本发明，但不作为对发明内容的限制，凡基于本发明所述原理的技术均属于本发明的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1基于CRISPR-Cas9系统的番茄SlMYB13基因定点突变

（1）gRNA靶点的选择

登录NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/），查询番茄SlMYB13基因的序列（CDS序列如SEQ ID NO.2所示，编码蛋白序列如SEQ ID NO.1所示）。根据SlMYB13基因序列可知，其含有三个外显子，基于CRISPR-Cas9的gRNA序列特点，本发明通过筛选和分析选择位于SlMYB13基因的第三个外显子正义链上含有NGG序列特征的序列，具体为第135位至第154位：5’-TGTAGATGTACATTTGGAGG-3’(SEQ ID NO.3），经转录后形成的RNA链可特异结合SlMYB13基因并指导CRISPR-Cas9系统对番茄SlMYB13基因进行高效的定点突变。

（2）基因编辑载体构建

根据选定的gRNA靶点序列靶标(SEQ ID NO.3）合成引物gRNA-F:cagtggtctcatgcaTGTAGATGTACATTTGGAGG(SEQ ID NO.4）；gRNA-R:cagtggtctcaaaacCCTCCAAATGTACATCTACA(SEQ ID NO.5），进行PCR扩增，反应程序为：94℃5min；94℃30s，50℃45s，72℃46s，30个循环；72℃10min，16℃30min。100V，200mA对PCR扩增产物电泳30min，利用DNA凝胶回收试剂盒（Axygen）进行回收，回收产物标记为rDNA1。

将pHSbdcas9i质粒经BsaI/Eco31I酶切后与rDNA1连接，使用T4连接酶将双链靶序列连接到质粒载体上，获得MYB13编辑载体pHSbdcas9i-SlMYB13，见图1重组图谱。

转化大肠杆菌DH5α后，设计检测引物JC-F:GTAAAACGACGGCCAGT（SEQ ID NO.6）和JC-R:CCAGAAATTGAACGCCGAAG（SEQ ID NO.7），反应程序为94℃5min；94℃30s，50℃45s，72℃54s，30个循环；72℃10min，16℃30min，扩增序列850bp，PCR扩增电泳检测结果见图2。

（3）pHSbdcas9i-SlMYB13质粒转化根癌农杆菌

将步骤（2）中的重组pHSbdcas9i-SlMYB13载体通过热激方法转化进入农杆菌GV3101菌株中，获得重组农杆菌。具体方法为：取50µL农杆菌GV3101感受态细胞于离心管中，加入2µL pHSbdcas9i-SlMYB13质粒，冰浴45min，液氮冷冻1min，37℃水浴3min，加入1mLYEB液体培养基，28℃125rpm培养3h，12000rpm离心1min浓缩菌液，加入400µLYEB液体培养基回融菌液，并涂于YEB固体培养基（含Kan50mg·L

（4）农杆菌介导的番茄转化

选取饱满、大小一致、新鲜的番茄种子用无菌水清水反复冲洗数次，然后用70%的酒精对番茄种子消毒30s、10%次氯酸钠消毒20min，将消毒后的种子用无菌水冲洗4~5遍，使用无菌滤纸将水分吸干后，将种子接种于MS培养基中，光照强度1600~1800lx，光照25℃/16h，黑暗18℃/8h。

取50μL重组农杆菌菌液于50mLYEB液体培养基（Kan50mg·L

选取番茄子叶作为外植体进行转化，将子叶切成0.5cm×0.5cm大小的叶块，水平放置于预培养基（MS+ZT2.0mg·L

（5）转基因番茄鉴定及突变位点检测

分别以检测引物cas9-F:GCACCCGGTGGAGAACACGC（SEQ ID NO.8），cas9-R:GTTCAGGTACGCGTCATGGGC（SEQ ID NO.9）进行载体序列检测，鉴定阳性植株，阳性植株鉴定PCR扩增电泳检测结果见图3。

再以阳性植株基因组为模板运用引物SlMYB13-F（SEQ ID NO.10 CGCGGATCCATGGGGAGATCTCCTTGCTGTGA）和SlMYB13-R（SEQ ID NO.11 TCCCCCGGGTCATAATTCAGGCAATTCTAACATCAACTC）扩增SlMYB13基因全序列，送PCR产物测序，通过测序序列判断靶位点是否发生突变。

测序结果表明获得转化植株中myb13-29为两条染色体同时发生突变的纯合株系，测序结果见图4，第三外显子144-149缺失ACATTT。

缺失后的DNA序列如SEQ ID NO.12所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.13(MGRSPCCEKLGLKRGPWSKEEDYLLINYIKKNGHPNWRALPKLAGLLRCGKSCRLRWTNYLRPDIKRGNFTHQEEDTIIKLHQVLGNSWSAIAARLPGRTDNEIKNIWHTRLKKKRNESQLKETQSEPENTNVDGRRPTILMINIPKYRILK-)所示；myb13-29由于碱基的缺失，造成PAM位点后序列翻译错位，蛋白翻译提前终止，功能改变。挑选myb13-29

实施例2 转基因株系番茄耐盐性检测

（1）选取经测序验证为纯合的敲除株系slmyb13-29纯合系种子与野生型进行发芽实验，每个品种选10粒种子分别放置于不同浓度NaCl溶液（0、50mM和60mM）和不同浓度PEG6000溶液（5%、10%）的含有滤纸的培养皿中萌发，光周期为光照16h，黑暗8h，温度为28±1℃。七天测定种子发芽率，每组进行三个生物学重复。结果如图5所示，与WT相比，slmyb13-29种子在盐胁迫及PEG模拟干旱条件下萌发率更高。

（2）选取经测序验证为纯合的敲除株系slmyb13-29，对其进行300mM高盐及10%PEG6000模拟干旱处理，进而分析SlMYB13在调节番茄植株耐盐及抗旱中的功能。

挑选长势一致的野生型番茄株系，基因敲除株系slmyb13-29的幼苗。盐胁迫及干旱胁迫处理前拍照作为对照。

盐胁迫处理，每盆各浇300mM NaCl溶液200mL。

模拟干旱胁迫处理，每盆各浇10%PEG6000溶液200mL。

观察各株系的生长状况，直到处理第五天各株系之间生长情况出现较明显的差异后，拍照，结果如图6所示，与WT相比，slmyb13-29在盐胁迫、干旱胁迫处理后生长状态更好。

另选取（2）中经盐胁迫、干旱处理后的slmyb13-29和野生型（WT）进行过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶活性及丙二醛、脯氨酸含量的测定。测定结果如图7所示，与WT相比，slmyb13-29过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）活性显著较高，脯氨酸含量更高，丙二醛含量更低。

POD、SOD和CAT是植物抗氧化系统中的主要酶，其活性能反映植物受外界逆境影响的程度。SOD能催化超氧阴离子转化为H

上述对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。