一种提取高纯度南酸枣苷的方法及应用

技术领域

本发明属于中（壮/瑶）药有效成分提取分离及应用的技术邻域，具体涉及一种改进的南酸枣苷的提取分离方法和将其作为抗氧化剂的应用。

背景技术

南酸枣（拉丁学名：

有关资料还介绍，南酸枣具有以下功能：1、健胃消食：南酸枣果实成熟以后，味道酸甜爽口，含有大量果酸和天然柠檬酸和丰富的铁、钾、钠等微量元素，人们食用以后能促进胃部消化液的分泌，开胃消食，增加食欲，可以缓解食欲不振与消化不良，能让肠胃的消化能力明显提高。2、清肠排毒：南酸枣含有大量的纤维素，能促进肠胃蠕动，清肠排毒，缓解便秘。3、益脾利心：南酸枣果实收取以后晒干可以入药，入脾经、肝经以及心经，能行气活血，也能养心安神，对胸痹作痛、心悸、气短、心神不安和失眠多梦等不良症状。4、美容健肤；南酸枣含有维生素E等，有助于皮肤和毛发变得有光泽。5、行气活血；南酸枣还有去滞散结的作用，如果是由于气血瘀滞而导致的闭经、月经不调、痛经、胸闷、心慌等，也可以吃南酸枣。在中医方面来说，南酸枣主要是有安神去燥的作用，如果出现失眠多梦、心烦气躁、心绪不宁等，可以适量吃一些南酸枣果实。

本发明主要采用南酸枣树皮，据文献介绍，南酸枣树皮性味，味酸、涩，性凉。归经，入脾、胃经；功效，清热解毒，祛湿，杀虫；主治疮疡，阴囊湿疹，痢疾，白带，疥癣等病症。

几千年来，广西壮族先民流传在民间，有采用南酸枣果实或树皮用于治疗外伤出血、疮疡溃烂、疝气等疾病。现代一些学者也认为南酸枣树皮具有清热解毒、收敛止血的功效，在临床上对治疗肠胃炎，特别是痢疾方面有其特定的功效。

我们经过检索，查到目前针对南酸枣苷的提取分离方法的相关文献如下：

1、中国专利CN1032242395A公开了一种提取分离南酸枣苷的方法，其提取分离步骤为：将南酸枣树皮粉碎，进行多罐式动态逆流提取，提取液过滤、旋转浓缩，浓缩液加水分散，经过聚酰胺树脂柱吸附，醇水溶液洗脱，浓缩洗脱液，再经半制备型高速逆流色谱仪分离纯化得到南酸枣苷。该方法工艺流程简单，提取效率较高，且制备过程中，污染少，成本低。

2、中国专利CN104910220A也公开了一种南酸枣苷的制备方法及其在抗菌药物中的应用。其制备步骤为：以南酸枣树皮为原料，粉碎，加入超临界萃取釜中，乙酸乙酯为夹带剂进行超临界CO

在上述的公开文献中，提取分离的步骤和工序繁杂，难以实现快速地提取分离得到高纯度的南酸枣苷。

发明内容

发明目的是提升现有的南酸枣苷提取分离技术，本发明采用以南酸枣树皮为原料，提取分离出南酸枣苷，提供一种更简便、更高效、更安全的从南酸枣树皮中提取分离得到高纯度的南酸枣苷。

本发明的另一个目的是通过从南酸枣苷树皮中提取分离的南酸枣苷作为抗氧化剂的用途。

本发明采用的技术方案如下：

（1）提取：取已去粗品并已晒干的南酸枣树皮粉碎，置于烧瓶中，加入提取溶剂，提取时间1～3小时，提取温度：35～85℃，提取次数1～3次，合并所有的提取液；所述提取溶剂为体积浓度30%～90%的乙醇或30%～90%的甲醇溶液；所述液料比为5~10倍(v/w)；

（2）柱层析：将提取液浓缩至0.5g/mL～1.0g/mL，得浓缩液加甲醇溶解，上硅胶柱，二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于30～70℃水浴温度下，进行浓缩干燥，得到质量含量97.5%以上的南酸枣苷化合物，备用。

所述步骤（2）中洗脱溶剂为体积比(200:1~1:1)的二氯甲烷-甲醇溶液，硅胶为100~400目。

上述得到的质量含量97.5%以上的南酸枣苷化合物采用进一步纯化得到质量更优的南酸枣苷，采用的方法为半制备液相色谱分离纯化：本发明可以用四种方法进行纯化：A：甲醇-水；B：乙腈-水；C：甲醇-酸；D：乙腈-酸为流动相进行分离纯化，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于30～70℃水浴温度下，进行浓缩干燥，得到纯度为质量含量99.5%以上的南酸枣苷；所述的流动相溶剂为体积浓度的10%～60%；检测波长为260nm；所述流动相的流速为2.0~4.0mL/min，主机转速为500~1050r/min。

当流动相溶剂为甲醇-酸；或者乙腈-酸溶液的时候，所述的酸为三氟乙酸时，溶剂的pH为4～6。本发明在进行南酸枣苷纯化的时候，采用的四种方法纯化A：甲醇-水；B：乙腈-水；C：甲醇-三氟乙酸；D：乙腈-三氟乙酸的时候最终含量都可以达到99.5%以上。

本发明所述的提取制备南酸枣苷的方法获得的南酸枣苷在抗氧化方面的效果良好。

本发明人经过试验，发现用南酸枣苷树皮含有的微量元素和氨基酸等营养物质被内服或涂抹在皮肤后，对皮肤代谢起很好的促进作用，这就是南酸枣苷具有较好的抗氧化性，抑制有害菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌）的成活，因此可以防止皮肤表面炎症的发生。

另外，南酸枣主要是入心经，所以有养心安神的作用，如果出现失眠多梦、心烦气躁、心绪不宁等，可以吃一些鲜果。本发明人用南酸枣树皮提取的南酸枣苷也具有行气活血、养心安神、消食、解毒、醒酒、杀虫、抗心肌缺血、保护心功能等功效。可以适用于气滞血瘀，胸痹作痛，心悸气短，心神不安等方面，对气血瘀滞而导致的闭经、月经不调、痛经也有作用。

本发明人认为，用南酸枣苷树皮提取分离南酸枣苷能够有抗氧化作用及其具有很多中西药所没有报道过的。

经化学分析，我们检测到南酸枣苷(Choerospondin) 是一种双氢黄酮类化合物，为南酸枣的树皮中提取分离得到，分子式为C

本发明人认为由于南酸枣果实和果核具有的健胃消食、清肠排毒、美容健肤、行气活血，归结于南酸枣苷的结构特点。

因为人体在生命活动过程，人体之所以会从年轻变老的状态，就是产生氧化应激的过程，国外学者提出自由基衰老是由于自由基攻击生命大分子而造成组织细胞损伤，自由基是机体中许多生化反应的中间代谢产物，正常情况下，人体内的自由基场地产生和消除处于动态平衡中，若体内自由基产生过多或消除过慢就可能损害细胞成分，破坏细胞结构和功能，给机体造成损伤，导致蛋白质变异，危及正常蛋白质的合成。

进一步说，因为人体在生命活动过程中人体内会不断合成稳定的氮中心的自由基，氧化应激可以引起蛋白质变性及交联性改变,甚至导致某些异常蛋白质的出现；引起DNA的氧化与交联，使核酸变性， 导致DNA发生突变，对热的稳定性改变、单链断裂等，从而影响它们传递信息的功能以及转录与复制的特性,导致蛋白质的合成能力下降和合成差错，尤其是RNA合成差错的积累，会影响蛋白质合成的准确性，甚至危及整个机体的蛋白质合成；自由基还会对细胞外的多糖高分子聚合物及其它可溶性成分发生比较明显的氧化损伤作用，同时还可以引起脂质过氧化情况，所以当机体自由基变化，我们就容易生病。

本发明所述的南酸枣苷就是一种能够起到抗氧化作用，防止自由基氧化应激，引起蛋白质变性及交联性改变，保证人体机体健康的物质，由于肠胃不适，气滞血瘀，胸痹作痛，心悸气短，心神不安等状况发生的时候，可能人体血液就会粘滞，影响到心肺功能，代谢物就会发生变化，机体不平衡，身体就感觉不舒服，南酸枣苷化合物就起到抗氧化剂的作用。

此外，由于南酸枣苷化合物作为外用药物的时候能够对刀伤、烧伤烫伤等外伤引起的伤口溃疡、细菌感染起到治愈作用也是因为它与细菌繁殖的条件隔离，缺氧、耗氧，使细菌的蛋白质不再繁殖，不能存活，也是抗氧化的作用之一。

本发明的突出的实质性特点和显著的进步为一次性快速地从南酸枣树皮中提取南酸枣苷，有益效果如下：

1.采用连续回流提取技术，利用循环提取不断地将有效成分提取出来，节省了提取时间和提取成本。时间缩短0.5～1小时，即可得到质量含量97.5%以上的南酸枣苷化合物。

2.采用硅胶柱色谱法将提取物分离成相对较纯的粗成品，极大的缩短了初步分离过程。

3.采用半制备液相色谱法和两个溶剂组成的流动相，分离工艺简单、安全、使用仪器设备不多，得到成品纯度极高。

4、经过纯化，能够得到纯度为99.5%以上的南酸枣苷。

上述方案在现有技术中并未发现采用连续回流提取技术、硅胶柱色谱法和半制备液相色谱法等方法来提取南酸枣苷的相关报道，第一次就可以得到纯度高达97.5%以上的南酸枣苷；也未见有经过纯化，得到最终纯度为质量含量99.5%以上的南酸枣苷的文献报道。

在作为抗氧化剂方面的应用，实验提示南酸枣苷可能延缓运动性疲劳发生和加快体能恢复，其作用机理可以是直接作用在自由基，或是间接消耗掉容易生成自由基的物质，防止发生进一步反应。人体在不可避免地产生自由基的同时，南酸枣苷也在产生着抵抗自由基的抗氧化物质，以抵消自由基对人体细胞的氧化攻击。

本发明南酸枣苷对皮肤代谢起很好的促进作用，这就是南酸枣苷具有较好的抗氧化性以及抗炎作用，抑制有害菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌）的成活，因此可以防止皮肤表面炎症的发生。

附图说明

图1是说明书实施例2步骤（2）中本发明南酸枣化合物（98.56%）的液相色谱图；图中峰值最高的代表南酸枣苷，低峰值是其它化合物，说明本提取方法将南酸枣苷分离效果很好；

图2是本发明实施例2步骤（3）经过纯化后得到的南酸枣苷的液相色谱图，从图2中最高峰表示为南酸枣苷的纯度，本发明经过纯化过后的南酸枣苷纯度能够达到99.5%以上；

图3是南酸枣苷与对照(Vc)DPPH清除率的对比图；

图4是南酸枣苷对 LPS 诱导 RAW264.7 细胞分泌的 IL-6 的影响。

具体实施方式

为使本发明上述目的和优点能够通俗易懂，下面通过具体实施方式对本发明做进一步说明，但本发明要求保护的范围并不局限于这些实施方式。

实施例1

（1）提取：将南酸枣树皮去粗皮，晒干，粉碎，过30目筛，称取南酸枣树皮粉末1 kg，置于圆底烧瓶中，加入10 L 80%的甲醇溶液，水浴温度35℃，提取2次，每次1 h，合并提取液；

（2）柱层析：将提取液浓缩至0.5g/mL，得到浓缩液，加甲醇溶解，上硅胶柱，二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于30℃水浴温度下，进行浓缩干燥，得到质量含量97.57%的南酸枣苷化合物；所述的洗脱溶剂二氯甲烷-甲醇溶液的体积比为200:1～1:1，硅胶为200目；

（3）半制备液相色谱分离纯化：将步骤（2）得到的南酸枣苷化合物用甲醇溶解，注入到半制备液相色谱仪中，以30%的乙腈-水为流动相进行纯化分离，检测波长：260nm，流动相的流速为2.0 mL/min，主机转速为500 r/min，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于30℃水浴温度下，进行浓缩干燥得到纯度为质量含量99.78%的南酸枣苷。

实施例2

（1）提取：将南酸枣树皮去粗皮，晒干，粉碎，过50目筛，称取南酸枣树皮粉末1 kg，置于圆底烧瓶中，加入10 L 80%的甲醇溶液，水浴温度60℃，提取2次，每次1 h，合并提取液；

（2）柱层析：将提取液浓缩至1.0g/mL，得到浓缩液，加甲醇溶解，上硅胶柱，二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于50℃水温度下，进行浓缩干燥，得到南酸枣苷化合物；所述的洗脱溶剂二氯甲烷-甲醇溶液的体积比为200:1～1:1，硅胶为400目；

（3）半制备液相色谱分离纯化：将步骤（2）得到的南酸枣苷化合物用甲醇溶解，注入到半制备液相色谱仪中，以20%的乙腈-水为流动相进行分离纯化，检测波长：260nm，流动相的流速为2.0 mL/min，主机转速为700 r/min，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于30℃水浴温度下，进行浓缩干燥得到高纯度的南酸枣苷。

采用高效液相色谱仪对实施例2中提取得到的产品进行检测，其中液相色谱条件：色谱仪型号：Waters e2695；色谱柱：月旭 Ultimate LP~C18 ( 5 µm, 4.6 x 250 mm)；检测波长：260nm。其中步骤（2）中提取的南酸枣苷化合物检测得到的色谱图如图1所示，图1中的各相关数据见表1，其中图1中在260nm处有最大吸收峰，为表1中的序号6，是本发明提取得到的南酸枣苷，表中%高表示纯度，可以看出实施例2得到的南酸枣苷的质量含量达到98.56%。而在经过步骤（3）纯化之后的南酸枣苷纯度能够达到99.5%以上，从表2中可以看出，其中检测得到的色谱图如图2所示，图2中的峰结果如表2所示。表1 实施例2步骤（2）液相色谱检测数据

表2 实施例2步骤（3）液相色谱检测数据

实施例3

（1）提取：将南酸枣树皮去粗皮，晒干，粉碎，过50目筛，称取南酸枣树皮粉末1 kg，置于圆底烧瓶中，加入10 L 65 %的甲醇溶液，水浴温度80℃，提取1次，每次1 h，合并提取液，趁热过滤，得提取滤液；

（2）柱层析：将提取液浓缩至0.5g/mL，得到浓缩液，加甲醇溶解，上硅胶柱，二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于70℃水浴温度下，进行浓缩干燥，得到质量含量97.98%的南酸枣苷化合物；所述的洗脱溶剂二氯甲烷-甲醇溶液的体积比为200:1～1:1，硅胶为100目；

（3）半制备液相色谱分离纯化：将步骤（2）得到的南酸枣苷化合物用甲醇溶解，注入到半制备液相色谱仪中，以40%的乙腈-三氟乙酸溶液为流动相进行分离纯化，其中pH=4～5，检测波长：260nm，流动相的流速为4.0 mL/min，主机转速为1000r/min，收集洗脱液，使用用旋转蒸发仪，于70℃水浴温度下，进行浓缩干燥得到纯度为质量含量99.89%的南酸枣苷。

实施例4

（1）提取：将南酸枣树皮去粗皮，晒干，粉碎，过10目筛，称取南酸枣树皮粉末1 kg，置于圆底烧瓶中，加入10 L 50%的甲醇溶液，水浴温度75～78℃，提取1次，每次2 h，合并提取液，趁热过滤，得提取滤液；

（2）柱层析：将提取液浓缩1.0g/mL，得到浓缩液，加甲醇溶解，上硅胶柱，二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于50℃水浴温度下，进行浓缩干燥，得到质量含量98.90%的南酸枣苷化合物；所述的洗脱溶剂二氯甲烷-甲醇溶液的体积比为200:1～1:1，硅胶为100目；

（3）半制备液相色谱分离纯化：将步骤（2）干燥的南酸枣苷化合物用甲醇溶解，注入到半制备液相色谱仪中，以45%的乙腈-三氟乙酸溶液为流动相进行分离纯化，其中pH=5~6，检测波长：260nm，流动相的流速为4.0 mL/min，主机转速为1050r/min，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于50℃水浴温度下，进行浓缩干燥得到纯度为质量含量99.90%的南酸枣苷。

实施例5

（1）提取：将南酸枣树皮去粗皮，晒干，粉碎，过10目筛，称取南酸枣树皮粉末1 kg，置于圆底烧瓶或蒸馏烧瓶中，加入5 L 30%的乙醇溶液，水浴温度50～60℃，提取1次，每次3h，合并提取液，趁热过滤，得提取滤液；

（2）柱层析：将提取液浓缩1.0g/mL，得到浓缩液，加甲醇溶解，上硅胶柱，二氯甲烷~甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于70℃水浴温度下，进行浓缩干燥得到质量含量为98.17%的南酸枣苷化合物；所述的洗脱溶剂二氯甲烷-甲醇溶液的体积比为200:1～1:1，硅胶为400目；

（3）半制备液相色谱分离纯化：将步骤（2）南酸枣苷化合物用甲醇溶解，注入到半制备液相色谱仪中，以60%的甲醇-水为流动相，检测波长：260nm，流动相的流速为3.0 mL/min，主机转速为500 r/min，收集洗脱液，用旋转蒸发仪，于50℃水浴温度下，进行浓缩干燥得到纯度为质量含量99.77%的南酸枣苷。

实施例6

（1）提取：将南酸枣树皮去粗皮，晒干，粉碎，过50目筛，称取南酸枣树皮粉末1 kg，置于蒸馏烧瓶中，加入8 L 90%的乙醇溶液，水浴温度70～75℃，提取1次，每次3 h,合并提取液，趁热过滤，得提取滤液；

（2）柱层析：将提取液浓缩至0.8 g/mL，得到浓缩液，加甲醇溶解，上硅胶柱，二氯甲烷-甲醇溶液梯度洗脱，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于70℃水浴温度下，进行浓缩干燥，得到质量含量为97.75%的南酸枣苷化合物；所述的洗脱溶剂二氯甲烷-甲醇溶液的体积比为200:1~1:1，硅胶为400目；

（3）半制备液相色谱分离纯化：将步骤（2）干燥的南酸枣苷用甲醇溶解，注入到半制备液相色谱仪中，以10 %的甲醇-三氟乙酸溶液为流动相进行分离纯化，其中pH=5~6，检测波长：260nm，流动相的流速为3.0 mL/min，主机转速为1050 r/min，收集洗脱液，使用旋转蒸发仪，于70℃水浴温度下，进行浓缩干燥得到纯度为质量含量99.95%的南酸枣苷。

抗氧化能力测试：

将实施例1~6制备得到的南酸枣苷进行DPPH自由基清除能力测定。

实验方法：

称取DPPH适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为500µg/mL的DPPH母液，用甲醇分别稀释母液制备质量浓度为50µg/mL的DPPH工作液备用。称取Vc对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为1000µg/mL的Vc母液，依次稀释成质量浓度100、200、400、600、800、1000µg/mL的系列Vc对照溶液。称取南酸枣苷适量，加甲醇制成质量浓度为1000µg/mL的样品溶液，分别稀释制成质量浓度为100、200、400、600、800、1000µg/mL的系列样品溶液。取各样品溶液与DPPH工作液各1 mL于离心管中混匀，为反应液，室温避光静置30min，取反应液150µL于96孔板，在酶标仪517nm处测定光密度(OD)值，每个样品平行做3个复孔，计算各样品清除率。以Vc为阳性对照，计算DPPH自由基清除率。使用SPSS 24软件计算其半数抑制浓度(half inhibitory concentration，IC

结论：从图3可看出，对照组(维生素C)的自由基清除率可达81%，南酸枣苷(IC

抗炎活性测试

探究南酸枣苷对LPS诱导RAW264.7细胞分泌的IL-6的影响

本实验应用双抗体夹心法测定标本中 RAW264.7 细胞培养上清液的 IL-6 分泌水平。

如图4所示，当给药浓度≥0.4μg/mL 时，与模型组相比IL-6分泌水平显著降低(

说明南酸枣苷能够在抗炎、灭菌上起到较好作用，也验证了本发明作为抗氧化方面是具有突出效果的。