一种具有降尿酸和抗痛风功效的南极磷虾源多肽及其应用

技术领域

本发明属于多肽制备技术领域，尤其是涉及一种具有降尿酸和抗痛风功效的南极磷虾源多肽及其应用。

背景技术

高尿酸血症(HUA)是一种代谢性综合征，其特征是体内尿酸(UA)的产生和排泄失衡。UA大量积聚，容易导致尿酸盐晶体沉积在关节、肾脏和其他组织中，从而导致痛风。同时，它还可能伴有肾结石、糖尿病等多种代谢综合征。大量流行病学结果表明，HUA的患病率逐年上升。别嘌醇和非布索坦具有很强的抗高尿酸血症活性，但它们会引起过敏、肾衰竭等副作用。因此，迫切需要制备安全有效的天然物质来缓解HUA。

目前，降尿酸肽/XOD抑制肽已从太平洋蓝鳍金枪鱼、圆舵鲣、太平洋白虾、卵清蛋白、乳清蛋白、大米、芸豆和脱酚核桃粕中制备和鉴定出来，被证明有较强的降尿酸作用。迄今为止，海洋源降尿酸肽/XOD抑制肽来源包括鲣鱼、金枪鱼、卵形鲳鲹、多宝鱼、小黄鱼、牡蛎、鳕鱼等，但大多数肽XOD抑制IC50值较高。

许多活性肽已被全球批准用于糖尿病、癌症、骨质疏松症、HIV感染等多种疾病的治疗，胰岛素、艾塞那肽、利拉鲁肽、恩夫韦肽和齐考诺肽是已在临床使用的肽类药物。然而，目前关于缓解HUA和痛风的生物活性肽的研究较少。通过对这些生物活性肽的收集和分类，可以获得重要的生物活性肽数据库，为研究生物活性肽的结构-有效关系提供数据支持。从南极磷虾可以得到不同序列和活性的降尿酸肽，可为海洋生物活性肽的生产、分离、鉴定、组成和序列提供足够的证据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有降尿酸和抗痛风功效的南极磷虾源多肽及其应用，即一种源于南极磷虾，具有降尿酸和抗痛风功能，可应用于降尿酸及抗痛风药物或功能食品中的五肽EE5。

本发明首先提供一种具有降尿酸和抗痛风功能的五肽EE5，其氨基酸序列为EFDGE(SEQ ID NO:1)，具有降尿酸及抗痛风功能。

所述的降尿酸及抗痛风功能的五肽EE5可用于制备具有降尿酸及抗痛风功效的药物或功能食品。

本发明再一个方面提供一种具有降尿酸及抗痛风功效的药物或功能食品，所述的药物或功能食品中包含有药理有效浓度的五肽EE5。

本发明得到的降尿酸五肽EE5从南极磷虾酶解液中提取得到，具有显著的XOD抑制活性，可显著降低HK-2高尿酸细胞模型上清的UA含量，并可显著降低RAW 264.7痛风细胞的炎症因子水平，主要通过调节尿酸盐转运蛋白和调节炎症信号通路，可以有效地用于降尿酸和抗痛风药物或降尿酸功能食品中，具有很好的应用和经济前景。

附图说明

图1为五肽EE5的二级质谱图，

图2为五肽EE5 XOD抑制活性的IC

图3为五肽EE5与XOD的分子对接图，

图4为五肽EE5对HK-2细胞上清尿酸含量的影响图，

图5为五肽EE5对HK-2细胞尿酸盐转运蛋白的影响图，

图6为五肽EE5对RAW 264.7细胞炎症因子的影响图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

本发明的五肽EE5的氨基酸序列为Glu-Phe-Asp-Gly-Phe(EFDGE，SEQ ID NO:1)，分子量为613.20Da。

本发明的五肽EE5可通过固相合成获得，固相合成方法具体如下：采用Fmoc固相合成策略，以Fmoc保护的氨基酸为原料，选用聚苯乙烯树脂作为固相载体，使肽链从C端向N端延伸，固相合成五肽EE5；另一方面所述五肽可通过生物合成方法获得，生物合成方法具体如下：合成编码五肽的基因，利用其构建重组质粒，然后将其转入宿主菌中，发酵培养诱导肽的表达，分离多肽。

以下各实施例中，采用比色法测定XO抑制活性的方法如下：

(1)溶液的配置

0.2mol/L(pH 7.5)磷酸缓冲液(PBS)：准确称取30.0838gNa

黄嘌呤溶液：准确称取6.4mg黄嘌呤，先用1mL 1M NaOH将其溶解，再加入100mlPBS，以1M HCl调节pH值至7.5。

黄嘌呤氧化酶：取120μL酶液，以PBS稀释至8mL。

别嘌呤醇：准确称取1mg别嘌呤醇，定容至100mL，配置成10μg/mL的别嘌呤醇。

(2)样品预处理：

将样品配成不同浓度，于96孔板中每孔加入50μL待测样品(或水作为对照)及50μL浓度为0.02U/mL的黄嘌呤氧化酶溶液，振荡30s,25℃保温5min，加入150μL 0.48mM的黄嘌呤溶液，振荡30s后，25℃保温25min，加入80μL的1M盐酸测定290nm处的吸光值。每个样品都需设空白，即加酶的同时加入80μL的1M盐酸。

(3)计算公式

式中：

A1——样品溶液加酶的吸光度；

A2——样品溶液不加酶吸光度

A3——缓冲液代替样品溶液的空白组的吸光度

A4——空白组不加酶的吸光度

以下各实施例中，肽与XOD分子对接的实验方法如下：

非布司他与牛XOD复合物(PDB ID:1N5X)的晶体结构从蛋白质数据库(PDB)(https://www.rcsb)下载。将受体和配体准备好后，使用Auto Dock Vina进行分子对接。将x＝96、y＝54和z＝39设置为对接坐标，对接盒尺寸为30×30×30，其他参数为默认值。然后将多肽与XOD晶体结构逐一对接。使用PyMOL和Discovery Studio 2019Client分析多肽和XOD之间的相互作用。

以下各实施例中，品对HK-2高尿酸细胞的作用的实验方法如下：

HK-2细胞培养

(1)细胞复苏

将细胞从液氮中取出后，立刻37℃水浴加热并轻轻晃动，直至完全解冻。1200r/min离心5min后，弃掉上清，加入2mL的MEM完全培养基(含有10％的胎牛血清FBS和1％的双抗青霉素-链霉素混合液)，吹打使细胞悬浮，转移至T25培养瓶中，再加入3mL培养基，“米”字型晃动培养瓶使细胞分布均匀，放置于5％ CO2、37℃的培养箱中培养待用，每48h更换一次新鲜培养基。

(2)细胞传代

观察HK-2细胞生长状况，待细胞数量达到长满培养瓶底板80％-90％时进行传代。吸出瓶中的培养液，加入3mL PBS洗两次之后，加入新鲜的培养基，用移液枪将细胞轻轻吹打下来，取适量细胞接种于新的T25培养瓶中，加入适量培养基，放入培养箱中继续培养，完成传代。

(3)细胞冻存

配制细胞冻存液：60％的MEM培养基、30％的FBS、10％的二甲基亚砜(DMSO)，混合均匀并过0.22μm滤膜除菌后制成。将细胞悬液1200r/min离心5min后弃掉上清液，加入细胞冻存液并吹打均匀后，转移至冻存管中。将冻存管放入梯度降温冻存盒中，放入-80冰箱，24h后转移至液氮中冻存。

操作步骤：

①接板：细胞经胰酶消化后计数，接种于96孔板中，密度为104个/孔(稀释至6.25×10

②预培养：NC和MC组不做处理，PC组100μmol/L别嘌呤醇，HL组加入0.2mM肽，HH组加入1mM的肽，预孵育24h。

③诱导：培养基吸出，每孔用PBS洗涤3次，模型组、阳性组、样品组都加入含3mmol/L腺苷无血清培养基250μL，对照组加无血清培养基，孵育24h。

④加酶：每孔加入50μL 0.01U/mL XO(溶于PBS)，处理后6h收集上清液，HPLC测定尿酸含量。

高效液相色谱测定组分的降尿酸活性：

细胞上清液过0.22μm滤膜，利用液相上清液中生成的尿酸量。

流动相：20mM磷酸氢二钾缓冲溶液:甲醇＝88:12；

色谱柱：Zorbax SB-C18(3.5μm,4.6*100mm)；

进样体积：10μL；流速：0.3mL/min；柱温：30℃；检测波长：290nm；

运行时间:22min。

以下各实施例中，肽样品对RAW 264.7痛风细胞的作用的实验方法如下：

(1)细胞培养

①细胞复苏

将冻存的RAW 264.7细胞快速融化直至完全解冻后，将细胞悬液移入15mL离心管中于1200r/min离心5min，弃上清，加入适量DMEM完全培养基(含10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素混合液)，轻吹混匀，移至T25培养瓶中，晃动培养瓶使细胞分布均匀。将细胞置于5％ CO2、37℃的培养箱中孵育，每14h更换新鲜培养基。

②细胞传代

观察细胞状态和生长密度及时传代。吸出瓶中的培养液，加入PBS清洗三次之后，加入3mL新鲜培养基，用移液枪轻轻将细胞吹打下来，加入适量DMEM完全培养基移至T25培养瓶中使细胞分布均匀。将细胞置于5％ CO2、37℃的培养箱中孵育，每14h更换新鲜培养基。

③细胞冻存

配制细胞冻存液：72％ DMEM培养基+20％ FBS+8％ DMSO，混匀后过无菌滤膜除菌。将细胞离心5min弃上清，加入1mL配置好的细胞冻存液并吹打50次，转移至冻存管中。将细胞梯度降温，最终转移至液氮中冻存。

(2)细胞铺板

将处于对数生长期的RAW264.7细胞培养至汇合，调整细胞浓度并接种至12孔板中，每孔加2mL细胞悬液(5×105/mL)培养24h。

(3)预培养

①NC组：正常组，加入2mL DMEM完全培养基培养24h，设置6个平行；

②MC组：模型组，加入2mL DMEM完全培养基培养24h，设置6个平行；

③PC组：阳性对照组，加入2mL含100μmol/L双氯芬酸钠的DMEM完全培养基培养24h，设置6个平行；

④HL组：加入2mL含0.2mM肽的DMEM/F-12完全培养基培养24h，设置6个平行；

⑤HH组：加入2mL含1mM肽的DMEM/F-12完全培养基培养24h，设置6个平行。

(4)诱导

将1克尿酸溶解于含有6mL 1mol/L NaOH的200mL沸水中，通过添加NaOH调节pH至8.9，将溶液在4℃下结晶过夜。将结晶过滤出来并在42℃下干燥，制得尿酸钠(MSU)晶体。将12孔板中培养基吸出，每孔用PBS洗涤3次，正常组加入2mL DMEM不完全培养基，其余各组都加入2mL含MSU悬浮液的DMEM不完全培养基诱导6h。

下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。

实施例1：多肽的制备、纯化并测序

所述五肽EE5通过酶解南极磷虾获得，酶解南极磷虾的方法具体如下：取南极磷虾肉糜匀浆，匀浆后的虾肉糜按照1：4的比例加入一定质量的蒸馏水，然后加入虾肉质量的0.8％碱性蛋白酶，调节体系pH值为8.5，在55℃下保温水解4小时，得到酶解产物。酶解产物通过SP Sephadex C25阳离子交换色谱通过含0-0.5mol/L NaCl的醋酸缓冲液在1mL/min的流速对酶解物进行分离纯化；继续采用超纯水洗脱，经Sephadex G15凝胶过滤色谱以流速为0.5mL/min的流速对组分进行分离纯化；最后利用反相高效液相色谱配置Zorbax SB-C18半制备柱对五肽EE5进行富集。

采用UHPLC-Q-Orbitrap鉴定活性最高组分的氨基酸序列。所用色谱柱为AgilentAdvance-Bio Peptide Map C18 column(2.1×150mm，2.7μm)。UHPLC参数：流动相A：0.1％甲酸-乙腈，流动相B：0.1％甲酸-水，流速：0.25mL/min，柱温：40℃，梯度洗脱程序0～2min(5％A)、2～27min(5％A～20％A)、27～37min(20％A～35％A)、37～39min(35％A～80％A)。扫描范围：50～1500m/z，电喷雾模式：电喷雾正离子，电喷雾电压5500v。

如图1所示，测序确定五肽EE5的氨基酸序列为EFDGE，分子量为613.20Da。此肽含有5个氨基酸，含有芳香族氨基酸(苯丙氨酸)。

实施例2：多肽的降尿酸及抗痛风功效检测

固相合成五肽EE5，并对活性肽EE5的XOD抑制活性IC

根据对接结果的3D图(图3)可以看出，肽EE5的结构可嵌入到XOD的活性口袋中，以阻断XOD与底物结合的通道。肽EE5与XOD的Glu711、Ser876、Glu879和Glu1143形成常规氢键，与His875形成碳氢键，与Pro1012形成疏水相互作用力，其中Ser876被认为是影响XOD活性的关键氨基酸残基。

图4显示了肽EE5对高尿酸血症HK-2细胞尿酸水平的影响。与NC组相比，经腺苷诱导后，MC组细胞上清尿酸含量显著升高(p<0.01)，证明高尿酸细胞模型成功建立。另外，EL和EH处理的细胞上清尿酸含量分别减少15.00％和24.29％(p<0.01)，呈浓度依赖性。EE5具有较强的降尿酸活性。

图5探究了肽EE5对高尿酸HK-2细胞中GLUT9和ABCG2的mRNA水平的影响。如图5所示，经腺苷诱导后，MC组GLUT9的mRNA水平较NC组有显著升高(p<0.01)，这表明HUA可能是由尿酸的重吸收增加引起的。此外，别嘌呤醇处理会降低GLUT9的mRNA水平，且肽EE5以剂量依赖性降低GLUT9的mRNA水平，这表明MAHP可能通过抑制GLUT9水平降低尿酸的重吸收。另外，与NC组相比，MC组ABCG2的mRNA水平显著降低(p<0.01)，这表明腺苷诱导可致使尿酸分泌受阻，从而引发HUA。肽EE5使ABCG2的mRNA水平增加，这表明其对尿酸分泌转运蛋白的水平有显著的调节作用，这与促进尿酸的分泌密不可分。

为了研究纯肽对MSU晶体刺激的RAW 264.7巨噬细胞中抗痛风性关节炎的影响，在MSU晶体(0.2mg/mL)刺激之前，用纯肽(0.2和1mM)或双氯芬酸钠(100μmol/L)处理细胞。如图6所示，MSU晶体刺激显著增强了IL-1β和TNF-α，使其水平显著升高。另一方面，与MC组相比，多肽处理组可显著降低促炎因子水平，类似于双氯芬酸钠。