一种MEIS1蛋白及其衍生肽在制备用于提高细胞中p53蛋白含量的产品中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别涉及一种MEIS1蛋白及其衍生肽在制备用于提高细胞中p53蛋白含量的产品中的应用。

背景技术

结直肠癌位列癌症致死率的第三位，其发生和发展与一系列抑癌或致癌蛋白包括APC、KRAS、BRAF和p53等突变相关。在结直肠癌中，p53是一个拥有广泛而强大功能的抑癌基因，被誉为“基因组守护者”。p53会响应细胞中的各种应激源(例如DNA损伤)而被激活。p53的激活会促进DNA修复，或促进异常的细胞受控死亡，从而阻止癌症的发生和发展。p53基因突变在许多癌症中非常常见，超过一半的癌症患者携带了p53基因突变。但值得注意的是，只有大约40％～50％的结直肠癌存在p53突变，突而50％以上的结直肠癌中p53状态为野生型p53。然而，当前众多研究主要聚焦于探索针对p53突变型结直肠癌的治疗靶标，特异靶向p53野生型结直肠癌的治疗靶点尚未完全明晰。

蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)参与包括细胞间的相互作用以及代谢和发育控制等多种生物学过程。PPI的错误调控、翻译后修饰和干扰与多种人类疾病有关，使得这些相互作用的调节成为药物发现的一个非常有吸引力的领域。p53是一种半衰期较短的蛋白质，细胞中p53蛋白的数量主要取决于它的降解速度。在保持野生型p53表达的肿瘤中，最广泛采用的p53靶向治疗方法是抑制p53的降解。p53降解的机制涉及E3泛素连接酶MDM2对p53的泛素化，导致p53的蛋白酶体降解。MDM2介导的泛素化依赖于其与p53的直接结合，促使人们寻找抑制MDM2–p53结合的小分子，作为稳定p53并使其恢复效力的手段。目前，MDM2-p53蛋白与蛋白的相互作用是近年来的研究热点，在肿瘤的治疗中发挥着重要的作用，但遗憾的是目前仍未有相应的抑制剂上市。

多肽药物是由氨基酸组成的短链蛋白质，具有广泛的生物活性和药理学效应。由于其精准结合目标蛋白的特性，多肽药物在医学领域展现出广泛的应用潜力。在癌症治疗中，一些多肽药物通过抑制肿瘤生长、促使凋亡或阻断血管生成等机制，显示出良好的疗效。此外，多肽药物还被应用于免疫调节、治疗代谢性疾病以及神经系统疾病等领域。然而，多肽药物面临一些挑战，如生物稳定性较差、给药途径限制和制备成本较高。尽管存在这些难题，研究人员不断努力克服，通过化学合成、生物制备等手段改进多肽药物的性质，推动其在临床应用中的发展，为创新药物研发提供了新的方向。总体而言，多肽药物因其靶向性、生物相容性等特点，成为治疗多种疾病的重要工具之一。随着科学技术的不断发展，多肽药物的应用领域还在不断扩展。

发明内容

基于此，本发明提供了一种MEIS1蛋白在制备用于提高细胞中p53蛋白含量的产品中的应用。

在其中一个实施例中，上述MEIS1蛋白通过抑制p53蛋白的降解提高细胞中p53蛋白含量。

在其中一个实施例中，上述降解为MDM2蛋白介导的泛素化降解。

在其中一个实施例中，上述细胞为结直肠癌细胞。

本发明还提供了一种MEIS1衍生肽在制备用于提高细胞中p53蛋白含量的产品中的应用，上述MEIS1衍生肽的序列如SEQ ID NO：1所示。

在其中一个实施例中，上述MEIS1衍生肽通过抑制p53蛋白的降解提高细胞中p53蛋白含量。

在其中一个实施例中，上述降解为MDM2蛋白介导的泛素化降解。

在其中一个实施例中，上述细胞为结直肠癌细胞。

本发明还提供了上述MEIS1蛋白或MEIS1衍生肽在制备用于抑制MDM2蛋白与p53蛋白结合的产品中的应用。

在其中一个实施例中，上述产品为注射剂型的药物。

本发明的上述方案具有如下的有益效果：

本发明通过研究发现MEIS1与MDM2结合能够稳定P53蛋白表达，阻止p53被MDM2介导泛素化降解，提高p53蛋白含量。进一步地，基于MEIS1蛋白序列设计合成了一种靶向MDM2-p53轴的一种多肽(MEIS1衍生肽)，体内体外实验验证证明该多肽能够抑制MDM2与p53蛋白的结合，阻止p53被泛素化降解，从而上调p53蛋白，抑制保持野生型p53表达的肿瘤细胞的增殖，可用于治疗相关的癌症或作为分子试剂用于癌症领域的进一步研究，有望改变癌症的治疗格局，从而使更多的患者受益。

附图说明

图1为本发明实施例1中对照组(NC)与过表达MEIS1的结直肠癌细胞p53蛋白表达水平的western bolt检测结果；

图2为本发明实施例1中p53免疫共沉淀泛素化检测的实验结果；

图3为本发明实施例1中对照组(Vector)与过表达MEIS1(oe MEIS1)的结直肠癌细胞p53蛋白半衰期的放线菌酮示踪法检测结果；

图4为本发明实施例1中HCT116 P53-/-细胞在不同条件下p53蛋白表达水平的western bolt检测结果；

图5为本发明实施例2中结直肠癌细胞加入不同浓度的MEIS1衍生肽(10uM、20uM、30uM)孵育48小时后的荧光照片；

图6为本发明实施例2中结直肠癌细胞加入不同浓度的MEIS1衍生肽(10uM、20uM、30uM)孵育48小时后p53蛋白表达水平的western bolt检测结果；

图7为本发明实施例3中裸鼠皮下成瘤实验给药第18天后对照组与MEIS1衍生肽组剥离的肿瘤照片；

图8为本发明实施例3中裸鼠皮下成瘤实验给药第18天后对照组与MEIS1衍生肽组剥离的肿瘤重量对比；

图9为本发明实施例3中裸鼠皮下成瘤实验对照组与MEIS1衍生肽组肿瘤体积随给药后时间的变化对比；

图10为本发明实施例3中裸鼠皮下成瘤实验给药第18天后对照组与MEIS1衍生肽组剥离的肿瘤组织p53蛋白表达水平的western bolt检测结果。

具体实施方式

为使本发明要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

此外，下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。实施例中采用的试剂和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。

实施例1MEIS1能够逆转MDM2对p53蛋白的降解效果

通过在结直肠癌细胞HCT8中转染pEGFP-N1-MEIS1(NCBI Reference Sequence:NP_002389.1)，提取蛋白，检测MEIS1对p53蛋白稳定性的影响。该步骤用的主要技术包括细胞转染、蛋白提取、免疫共沉淀以及western bolt实验。

首先进行细胞转染，吸取200μl转染试剂buffer，往buffer里面加入4μl的转染试剂，然后向其中加入1.5～2ug的质粒，用枪轻柔吹吸均匀，使体系充分混合，在室温下孵育10～15min；等到孵育结束后，向培养皿中加入配置好的转染混合液，轻轻摇晃以混合均匀，使之在培养基中分散均匀；6～8h后对细胞进行换液，观察细胞状况。

细胞培养48h后，取出细胞，弃去旧培养液，用PBS清洗细胞2～3遍，吸尽残余PBS，根据细胞量的多少，加入合适体积的蛋白裂解液，于冰上裂解30min以上；细胞裂解完成后，用细胞刮子将细胞刮落下来，并将全部转移至Ep管中，4℃离心20min，转速12000rpm，离心后将上清液转移到新的Ep管中，进行western bolt检测等实验。

如图1所示，相比于对照组，转染了MEIS1过表达质粒的细胞中p53蛋白的含量明显更高，说明过表达MEIS1能够提高细胞中p53蛋白的含量。

进一步地，在HCT8细胞中将MEIS1和p53质粒共转染24小时，用加有PIC(1：50)和PMSF(1：100)的IP裂解缓冲液，在冰上提取蛋白30分钟。裂解液与指定抗体于4℃孵育过夜。然后将蛋白抗体混合物与蛋白A/GPLUS-Agarose混合，在室温下孵育2小时后，用IP裂解缓冲液清洗珠子，结合的融合蛋白用相应的洗脱缓冲液从珠子上洗脱下来，进行Western印迹分析泛素化水平。如图2所示，免疫共沉淀实验结果证实过表达MEIS1能抑制p53泛素化降解，稳定p53蛋白的含量。

如图3所示，使用环己酰亚胺(Cycloheximide,CHX)100μg/ml处理结直肠癌HCT8细胞0h、1h、2h、4h后，western bolt实验检测过表达MEIS1对p53蛋白半衰期的影响，结果显示过表达MEIS1能够使p53蛋白半衰期明显延长。

并且，如图4所示，我们在HCT116 P53-/-细胞(p53缺失人结肠癌细胞)中分别转染如下质粒：①NC组；②p53组；③MDM2+p53；④MEIS1+MDM2+p53，转染24h后，提蛋白，westernbolt实验证实过表达MEIS1能够抑制MDM2对p53蛋白的降解作用。

综上结果，可以证明MEIS1能够明显逆转MDM2对p53蛋白的降解效果。

实施例2MEIS1衍生肽及其对p53蛋白的影响

基于上述MEIS1抑制p53蛋白降解的现象，我们通过分析MEIS1与MDM2的结合位点设计合成了截短的MEIS1衍生肽，序列为：NFCHRYISCLK(SEQ ID NO：1)，并在N端加上FITC标记多肽，用以检测多肽的脂溶性，并探究MEIS1衍生肽对P53蛋白稳定性的影响。

(1)在结直肠癌HCT8细胞中加入不同浓度的MEIS1衍生肽(0uM、10uM、20uM、30uM)，孵育48小时后，检测MEIS1衍生肽的脂溶性，如图5所示，MEIS1衍生肽能够进入细胞内，脂溶性较好。

(2)确定MEIS1衍生肽的脂溶性后，将孵育MEIS1衍生肽48h后的HCT8细胞收样，提取蛋白，western bolt检测p53蛋白表达变化，结果如图6所示，说明p53蛋白含量随MEIS1衍生肽的孵育浓度增高呈梯度上升趋势，可见该截短的MEIS1衍生肽依然能够抑制细胞中p53蛋白的降解。

实施例3裸鼠皮下成瘤实验检测MEIS1衍生肽对肿瘤生长的影响

实验动物为4周的雄性裸鼠。将培养在培养皿中的HCT116细胞用胰蛋白酶消化为分散细胞后，计数3×10

同时，取适量瘤体组织剪碎后用液氮进行研磨后，然后加入合适体积的蛋白裂解液，于冰上裂解30min以上；细胞裂解完成后，用细胞刮子将细胞刮落下来，并全部转移至Ep管中，4℃离心20min，转速12000rpm，离心后将上清液转移到新的Ep管中，进行westernbolt实验检测p53表达变化。结果如图10所示，注射MEIS1衍生肽的小鼠肿瘤组织中p53蛋白的含量明显高于对照组，可见MEIS1衍生肽能够抑制细胞中p53蛋白的降解，提高其含量。

以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。