特异性DcR2抗拮多肽及其筛选方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种特异性DcR2抗拮多肽，与该抗拮多肽在制备具有抑制高糖诱导的肾小管细胞衰老的药物中的应用。

背景技术

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见且较严重的并发症之一，也是导致终末期肾衰竭最主要的原因。肾小管间质纤维化在DN进展中发挥重要作用，与肾功能损害密切相关，并且决定了肾脏预后。目前研究认为肾小管细胞衰老是DN肾间质纤维化中重要的细胞生物学事件。一方面，细胞衰老后通过分泌大量炎症因子、趋化因子等衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，SASP)，促进组织炎症与纤维化；另一方面，衰老细胞还具有凋亡抵抗表型，促使衰老细胞存活，并持续分泌释放SASP，导致其损害效应迁延和放大，加速组织炎症和器官纤维化。在DN患者中，研究已证明肾小管细胞衰老与肾间质纤维化及肾功能损害呈正相关，在动物及细胞实验研究中进一步证明肾小管细胞衰老加速DN肾纤维化。因此探寻靶向干预肾小管细胞衰老的理想方法，将为防治DN肾间质纤维化发生发展提供新的策略，并对提升DN治疗水平及改善DN预后具有重要意义。

目前干预细胞衰老的方法除限制能量、增强体育锻炼等生活方式干预外，还可使用雷帕霉素、达沙替尼、槲皮素、白藜芦醇等抑制细胞衰老，但是特异性以及靶向性欠佳。此外，还可以p16为靶标靶向清除衰老细胞，但p16并非衰老肾小管细胞特有的生物标志，而是表达于所有的肾实质衰老细胞，包括血管内皮细胞、足细胞、间质成纤维细胞等，若采用靶向清除p16阳性衰老细胞可能会导致肾脏组织结构毁损、肾功能衰竭。因此，寻找衰老肾小管细胞特异性的生物标志并基于开发新型干预肾小管细胞衰老的新方法具有较好的应用前景。诱骗受体2(decoy receptor，DcR2)是肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)的II型跨膜受体，编码基因位于染色体8p21-22，是p53感应的DNA损伤(p53-sensed DNAdamage)调控基因之一。DcR2胞外段富含半胱氨酸结构域，可与配体TRAIL结合拮抗细胞凋亡；胞内段含有三个潜在的N-糖基化位点和一个截短的死亡结构域(Death Domain，DD)，可介导下游信号，发挥拮抗细胞凋亡的作用。此外，既往研究发现DcR2同其他经典衰老标志p16、SA-β-gal一样，在致癌基因诱导的癌前病变组织中高表达，而在肿瘤组织中表达水平明显降低，表明DcR2与肿瘤细胞凋亡抵抗、分化程度密切相关。一旦DcR2在衰老肿瘤细胞中高表达，可通过拮抗化疗药物诱导的凋亡效应从而降低化疗敏感性，导致肿瘤患者预后不良。研究还发现DcR2在活化的肝星状细胞衰老过程中持续高表达，可抑制NK细胞靶向清除星状细胞，致使其细胞外基质分泌增加进而加速肝脏纤维化。在DN患者肾组织样本中，我们首次发现DcR2特异性表达于DN衰老肾小管细胞，并且与肾间质纤维化密切关联。此外，我们利用免疫磁珠分选技术分选出DcR2阳性细胞，经过细胞衰老、细胞周期、增殖能力及凋亡抵抗表型评估等，证明其为高纯度的衰老肾小管细胞。以上表明DcR2可作为DN肾小管细胞衰老的特异性标志，DcR2可作为干预衰老肾小管细胞的理想靶标。我们前期通过转染DcR2siRNA质粒下调DcR2表达后，可抑制肾小管细胞衰老和DN肾间质纤维化。然而，siRNA治疗有着较为明显的缺点，即siRNA进入人体内容易被机体降解，从而导致作用持续时间及效应极大的降低。因此，以DcR2为靶标探寻新型干预肾小管细胞衰老的新方法，可为延缓DN肾间质纤维化进展提供有效措施。近年来利用噬菌体展示技术筛选能与靶向分子特异性结合的靶向多肽，具有较好的靶向性和特异性，在肿瘤等领域中广泛应用。本专利采用噬菌体展示技术筛选能与DcR2特异性结合的靶向多肽，旨在为靶向干预衰老肾小管细胞防治DN进展提供有效措施。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的主要目的在于提供特异性DcR2拮抗多肽及其筛选方法和应用。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种DcR2拮抗多肽，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO:1所示。

编码前述DcR2拮抗多肽的基因。

在某个具体实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

含有前述基因的表达载体。

含有前述基因的转基因细胞系。

含有前述基因的宿主菌。

以前述DcR2拮抗多肽为活性成分的抑制高糖诱导的肾小管细胞衰老的药物。

关于药物的表述：

优选地，所述药物还包括药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于)：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂或吸附载体。

本发明的药物可根据需要制备成各种剂型，包括但不限于，片剂、溶液剂、颗粒剂、贴剂、膏剂、胶囊剂、气雾剂或栓剂。

本发明的药物的施用途径不受限制，只要它能发挥期望的治疗效果或预防效果即可，包括但不限于口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。

本发明的药物还可与其他治疗高糖诱导的肾小管细胞衰老的药物联用使用；

DcR2拮抗多肽在制备抑制高糖诱导的肾小管细胞衰老的药物中的应用。

一种前述DcR2拮抗多肽的筛选方法，包括如下步骤：

1)DcR2过表达质粒转染293F细胞，表达纯化DcR2重组蛋白；

2)以噬菌体展示技术，以DcR2重组蛋白进行12肽文库多轮筛选出DcR2拮抗多肽。

与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

本发明首次利用噬菌体展示技术(Phage Display Technology)，以DcR2蛋白进行12肽文库多轮筛选出特异性多肽，经测序筛选出DcR2拮抗多肽序列为：YTNDPAKHGPWL，HPLC检测该拮抗多肽纯度为91.59％，MS质谱检测该拮抗多肽的分子量为1398.6Da，亲和力KD值为9.76E-05(M)。共聚焦检测发现DcR2拮抗多肽可与细胞中DcR2共定位，进一步细胞实验证明DcR2拮抗多肽可以增加高糖诱导的肾小管细胞的活力，明显抑制肾小管细胞衰老标志SA-β-gal、p21等表达。以上表明DcR2拮抗多肽可有效抑制肾小管细胞衰老，从而延缓DN进展。因此，以DcR2为靶标，开发新型DcR2拮抗多肽药物对于防治DN进展的具有重要的社会意义和广阔的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例1中关于细胞中DcR2蛋白纯化SDS-PAGE的结果；

图2为本发明实施例1中DcR2蛋白纯化的WB结果；

图3为本发明实施例1中DcR2拮抗多肽的纯度测试情况；

图4为本发明为实施例1中DcR2拮抗多肽的分子量测试情况；

图5为本发明为实施例1中DcR2拮抗多肽与DcR2相结合的亲和力情况；

图6为本发明中实施例1中DcR2拮抗多肽与DcR2之间的共定位关系情况；

图7为本发明DcR2拮抗多肽对高糖环境下肾小管细胞活力的影响情况；

图8为本发明DcR2拮抗多肽对肾小管细胞衰老的影响，其中A:SA-β-gal染色以及免疫荧光检测p21和Lamin B1表达；B-D半定量分析阳性细胞百分率。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合附图和实施例对本发明做进一步详细描述，但不能将其理解为对本发明保护范围的限定。任何基于本发明构思所作出的形式上的等效变换都应视为本发明的范畴。

本发明对实验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。所涉及试验方法或测试方法，如无特殊说明，均为常规方法；所用试剂或仪器，如未注明生产厂商，均为市售的常规产品，以常规方法制备或使用。

实施例1：DcR2拮抗多肽的筛选

本实施例提供了DcR2拮抗多肽的筛选方法，具体为：

1)DcR2过表达质粒转染293F细胞，表达纯化DcR2重组蛋白。

①转染前一天，计数正常培养的293F细胞，吸取适量细胞悬液离心(1000rpm，5min)，弃上清后以新鲜Expi293

②次日准备转染复合物：

a)在15ml无菌离心管中加入2.5ml Expi293

b)加入150μl Lipofectin至上述稀释好的DNA溶液中，再次涡旋混匀；

c)室温孵育10min；

d)将转染复合物加入至45ml的293F培养物中，继续37℃，5％CO2，124rpm培养；

e)4–5d后离心收集表达细胞和上清(1000rpm，5min)，用于蛋白纯化；

③重组蛋白的镍柱亲和层析：分别采用5mM、10mM、25mM、50mM(pH 7.4+0.2％Triton X-100)和250mM、500mM咪唑(pH 7.4+0.05％ Triton X-100)洗涤纯化细胞中的蛋白；对每个洗脱浓度的蛋白质进行SDS电泳检测，确定洗脱杂质蛋白和目标蛋白的最佳浓度作为后续洗脱条件，并对纯化的蛋白进行WB检测，结果如图1和图2所示，从图中可知采用250mM咪唑(pH7.4+0.05％ Triton X-100)可洗涤纯化出DcR2重组蛋白。

2)噬菌体展示文库筛选DcR2拮抗多肽与检测

①噬菌体滴度检测方法

1.1 2738菌株接种到LB培养基(含30ug/ml Tet抗生素)进行活化后，按照1:100比例接种到5ml新鲜LB培养基(含30ug/ml Tet抗生素)中进行培养至OD600 0.4～0.6；

1.2准备琼脂平板：称取1.25g IPTG和1g Xgal溶解于25ml DMF储存于-20℃待用；按照1L LB培养基添加15g/L琼脂，1ml IPTG/Xgal储存液进行制备平板制备，储存于4℃避光待用；

1.3按照10倍梯度稀释法，用LB培养基稀释噬菌体；按照需求将扩大培养的宿主菌均分后，每个管中分别加入10ul经过LB稀释的梯度噬菌体，轻轻混合后室温孵育30min；

1.4将步骤(1.3)经过感染的宿主菌涂板于步骤(2)准备的平板中，37℃过夜培养；

1.5噬菌斑计数。

②噬菌体扩大培养

1.1 2738菌株接种到LB培养基(含30ug/ml Tet抗生素)进行活化后，按照1:100比例接种到5ml新鲜LB培养基(含30ug/ml Tet抗生素)中进行培养至OD600 0.4～0.6；

1.2取10ul噬菌体接种到上述经过扩大培养的宿主菌中，200rpm，37℃震荡培养3-6h。8000rpm离心收集上清，即为噬菌体培养物。

③12肽噬菌体展示文库筛选

1.1抗原包被：将DcR2蛋白用PBS缓冲液稀释至4μg/ml，取96孔酶标板，选择3复孔，每孔加入100μl(400ng/孔)，4℃包被过夜，PBS作为阴性对照；

1.2封闭：弃去包被液，每孔加入150μl 2％脱脂奶粉，室温封闭1h；

1.3孵育噬菌体：用PBST洗涤4次，取4.2制备的噬菌体溶液，用2％脱脂奶粉，稀释至5×10

1.4洗脱：弃去噬菌体样品，用PBST洗涤10次，再用PBS洗涤5次，每孔加入100μl新鲜配制的0.1M三乙胺，室温静置10min，吸出洗脱液迅速用等体积1M Tris-HCl(pH7.4)中和；

1.5洗脱液噬菌体滴度测定：参考4.1方法测定洗脱液中噬菌体的滴度；

1.6重复步骤1.1～1.5步骤两次，完成第二轮和第三轮淘选；

④序列测定

测序引物：CCCTCATAGTTAGCGTAACG(5’-3’)(SEQ ID NO:3)

⑤多肽测序及合成

从第三轮筛选后的平板上挑取单克隆进行测序，送擎科生物公司进行测序，获得特异性DcR2拮抗多肽序列为YTNDPAKHGPWL(SEQ ID NO:1)，编码DcR2拮抗多肽的核苷酸序列为AAGCCAAGGACCATGCTTAGCCGGATCATTCGTATA(SEQ ID NO:2)。

实施例2：DcR2拮抗多肽的纯度、分子量测定

本实施例还对制备得到的DcR2拮抗多肽通过HPLC检测其纯度，通过MS质谱检测其分子量。

纯度的测试结果如图3所示，从图中可知该DcR2拮抗多肽的纯度为91.59％；分子量的测试结果如图4所示，从图中可知该DcR2拮抗多肽的分子量为1398.6Da。

实施例3：DcR2拮抗多肽的亲和力测定

本实施例基于生物膜干涉技术，对实施例1筛选得到的DcR2拮抗多肽的亲和力进行测定，具体测试步骤为:

1.1生物素化DcR2：将DcR2中加入相同摩尔的生物素化试剂；将加入生物素化试剂的DcR2完全加入脱盐柱中；加入200ul 1×PBS流穿，去除多余的生物素，收集生物素化DcR2所在流穿液；取生物素化DcR2所在流穿液，稀释后进行亲和力检测；

1.2通过SSA芯片特异性捕获生物素化的DcR2，信号达7nm后，与DcR2拮抗多肽进行结合。

1.3将DcR2稀释至总体积600ul，固化600s。

1.4将DcR2拮抗多肽用PBST+5％DMSO缓冲液进行稀释，稀释至1mM。

1.5将样品加入96孔板中上机Octet R8(Startorius BioAnalytical公司)进行检测。

检测结果如图5所示，从图中可以看出BLI技术检测DcR2拮抗多肽与DcR2结合力KD值为9.76E-05(M)，说明该DcR2拮抗多肽与DcR2具有较强的亲和力。

实施例4：DcR2拮抗多肽与DcR2结合关系

本实施例通过激光共聚焦检测FITC标记的DcR2拮抗多肽与DcR2之间的共定位关系，具体步骤为：

(1)将DcR2拮抗多肽分别用0.5ml ACN:H2O混合溶液进行溶解，随后分别于0.05MCB缓冲液中透析4h；

(2)取FITC分别加入到(1)中透析的两种多肽中，继续避光透析2h，标记完成；

(3)提取小鼠原代肾小管细胞，予以高糖(30mM)刺激构建肾小管细胞衰老模型。采用FITC标记的DcR2拮抗多肽孵育高糖诱导的肾小管细胞，4％多聚甲醛固定10分钟，孵育DcR2抗体(ab108421，Abcam公司)4℃过夜，使用Cy3抗兔荧光二抗(P0183，碧云天)孵育1小时。常温孵育DAPI 10分钟，PBS清洗三次后，在Leica荧光共聚焦显微镜下观察。

结果如图6所示，结果显示FITC可与DcR2共定位在细胞胞浆或胞膜，说明DcR2拮抗多肽可与DcR2特异性结合。

实施例5：DcR2拮抗多肽对高糖环境下肾小管细胞活力的影响

本实施例通过CCK8检测DcR2拮抗多肽对细胞活力的影响，具体步骤为：

提取小鼠原代肾小管细胞，予以高糖(30mM)刺激构建肾小管细胞衰老模型，分别同时采用1uM、10uM、25uM、50uM的DcR2拮抗多肽孵育48h，按照CCK8试剂盒说明书(C0038，碧云天)检测细胞活力。

结果如图7所示，从图中可知，随着DcR2拮抗多肽浓度逐渐升高，细胞活力逐渐增强，在25uM的浓度细胞活力最强，而在50uM的浓度时细胞死亡较多。以上表明25uM的DcR2拮抗多肽可以有效增强高糖环境中肾小管细胞的增殖活力。

实施例6：DcR2拮抗多肽对肾小管细胞衰老的影响

本实施例验证了DcR2拮抗多肽对肾小管细胞衰老的影响，具体包括：

1)DcR2拮抗多肽对肾小管细胞衰老标志P21、核纤层蛋白LaminB1表达的影响；

在DcR2拮抗多肽孵育高糖诱导的肾小管细胞后，常规固定。分别孵育LaminB1(ab16048，Abcam公司)、p21(ab188224，Abcam公司)4℃过夜，使用Cy3抗兔荧光二抗(P0183，碧云天)孵育1小时。常温孵育DAPI 10分钟，PBS清洗三次后，在Leica荧光共聚焦显微镜下观察，结果如图8所示。

2)DcR2拮抗多肽对肾小管细胞衰老标志SA-β-gal的影响

细胞固定后采用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(C0602，碧云天)进行染色。

结果如图8所示，从图中可知看出，予以DcR2拮抗多肽(25uM)处理高糖诱导的肾小管细胞，可以明显抑制肾小管细胞衰老标志SA-β-gal、p21的表达，增加核纤层蛋白LaminB1的表达，表明DcR2拮抗多肽可有效抑制肾小管细胞衰老。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。