一种碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y2及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及一种碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y2及其制备方法和应用。

背景技术

胃癌(Gastric Carcinoma，GC)是全球第五好发的恶性肿瘤，死亡率位居世界第三。由于早期疾病的细微症状和常规筛查的低比率，大多数患者被诊断为晚期，尽管可以通过手术、放疗、化疗、免疫、靶向治疗等方式进行干预治疗，但疗效欠佳，预后不良，5年生存率不足30％，因此，探索并开发新型、有效的治疗方式以提高生存率将成为必然的趋势。

放射性核素内照射治疗(Internal radiation therapy of radionuclide，IRT)是指通过各种方式，将放射性标记物质引入体内，利用放射性核素发出的α、β或俄歇电子产生辐射，通过导管内插入、间质注射、粒子植入和静脉注射趋向性药物等方式，将放射性核素转运到体内，利用核素发射的电离辐射生物学效应杀死癌细胞或引起基因变化导致癌细胞死亡，同时保护正常组织。近年来，小分子多肽及其类似物因其组织穿透性强、血液清除速度快、抗原性低、结构易修饰、稳定性好等优势成为国际研究热点，已有研究将放射性核素与多种小分子多肽进行了放射性标记，这就为癌症治疗提供了一种有效、有前景的治疗方式。例如

Caerin1.9(GLFGVLGSIAKHVLPHVVPVIAEKL-NH2)多肽是从澳大利亚树蛙皮肤分泌物中分离和鉴定的宿主防御多肽-caerin系列多肽之一，发明人团队前期研究证明Caerin1.9多肽抑杀包括肺癌、黑素瘤、宫颈癌和乳腺癌等多种肿瘤细胞，并且

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供一种小分子多肽TFMP-Y2。

本发明的第二个目的在于提供一种碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y2。

本发明的第三个目的在于提供所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y2的制备方法。

本发明的第四个目的在于提供所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y2在制备治疗肿瘤的药物中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明以Caerin1.9多肽为基础，进行修饰以增强多肽水溶性并减少其对正常细胞的增殖抑制作用，得到一条新的小分子多肽TFMP-Y2，通过体内外实验探究Caerin1.9与TFMP-Y2的极性，比较Caerin1.9与修饰多肽TFMP-Y2及其碘-131标记产物：

具体为：1.体外实验：①通过MTT实验、平板克隆实验验证Caerin1.9、TFMP-Y2多肽在体外抑制正常细胞和肿瘤细胞增殖作用、测定半抑制浓度(Median InhibitionConcentration，IC

结果显示，1.体外实验：①Caerin1.9多肽对HGC-27细胞和正常细胞增殖有明显抑制作用，且对浓度有依赖性，但TFMP-Y2多肽对胃癌HGC-27细胞和人正常胃黏膜上皮细胞GES-1均无明显抑制作用，两种多肽之间存在明显统计学差异(P<0.05)；平板克隆形成实验结果显示Caerin1.9对HGC-27细胞的抑制作用与其浓度呈正相关(与对照组相比，P<0.05)，TFMP-Y2对HGC-27细胞无明显增殖抑制作用。②氯胺-T法直接制备的

本发明研究表明：Caerin1.9修饰得到的小分子多肽TFMP-Y2具有水溶性且对正常细胞无增殖抑制作用。虽然单纯TFMP-Y2多肽对正常细胞和HGC-27增殖无明显抑制作用，但

具体地，所述小分子多肽TFMP-Y2的氨基酸序列为YGLHRVLGSAKHAEKL-NH

进一步地，所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y2，为SEQ ID No.1所示小分子多肽TFMP-Y2的氨基酸基团上结合有放射性标记碘-131。

本发明还提供所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y2的制备方法，为采用氯胺-T法，将小分子多肽TFMP-Y2溶液、Na-

进一步地，所述TFMP-Y2与Na-

进一步地，所述TFMP-Y2溶液质量浓度为1mg/mL，所述Na-

本发明还提供所述碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y2在制备治疗肿瘤的药物中的应用，具体为碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y2在制备肿瘤内照射治疗药物中的应用。

优选地，所述肿瘤包括但不限于胃癌。

本发明还提供一种肿瘤治疗药物，所述药物含有碘-131标记的小分子多肽TFMP-Y2。

进一步地，所述药物还包括药学上可接受的辅料。

本发明的药物的给药剂量取决于许多因素，例如所要治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重及个体反应，给药途径及给药次数等。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三或四个剂量形式给药。剂量水平须根据具体的给药途径、所治疗病况的严重程度以及待治疗患者的病况和既往病史等来选定。但应认识到，本发明的药物的总日用量须由主诊医师在可靠的医学判断范围内作出决定。对于任何具体的患者，具体的治疗有效剂量水平须根据多种因素而定，所述因素包括所治疗的障碍和该障碍的严重程度；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；给药时间、给药途径和排泄率；治疗持续时间；与组合使用或同时使用的药物；及医疗领域公知的类似因素。例如，本领域的做法是，给药的剂量从低于为得到所需治疗效果而要求的水平开始，逐渐增加剂量，直到得到所需的效果。

本发明还提供碘-131标记的caerin1.9在制备治疗胃癌的药物中的应用，具体为碘-131标记的caerin1.9在制备胃癌内照射治疗药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明以Caerin1.9多肽为基础，进行修饰以增强多肽水溶性并减少其对正常细胞的抑制作用，得到一条新的小分子多肽TFMP-Y2，单纯TFMP-Y2多肽对正常细胞和HGC-27增殖无明显抑制作用，但

附图说明

图1为不同浓度Caerin1.9、P3多肽及TFMP-Y2多肽作用下HGC-27细胞、GES-1细胞的存活率。其中，A为不同浓度的Caerin1.9、TFMP-Y2作用下HGC-27细胞的存活率比较；B为不同浓度的Caerin1.9、P3多肽作用下HGC-27细胞的存活率比较；C为不同浓度的TFMP-Y2多肽、P3多肽作用下HGC-27细胞的存活率比较；D为Caerin1.9、P3多肽及TFMP-Y2多肽作用于HGC-27细胞的IC

图2为平板克隆实验检测不同浓度(0、2、4、6、10、15μg/mL)的Caerin1.9、TFMP-Y2多肽处理下的HGC-27细胞集落的数量。

图3为与对照组(0mg/mL)对比，不同浓度的多肽Caerin1.9、TFMP-Y2作用下HGC-27细胞克隆数目。其中，A为Caerin1.9的结果；B为多肽TFMP-Y2的结果。(ns P＞0.05；*P＜0.05；**P＜0.01；***P<0.001；****P＜0.0001)。

图4为

其中，A为

图5为在25℃及37℃温度下，单纯

图6为

图7为

图8为不同治疗组肿瘤体积、瘤体重量、裸鼠体重变化。其中，A为不同治疗组在荷瘤后不同时间点的肿瘤体积大小变化；B为不同治疗组分离的瘤体重量；C为不同治疗组在荷瘤后不同时间点的裸鼠体重变化。(ns P＞0.05；*P＜0.05；**P＜0.01；***P<0.001；****P＜0.0001)。

图9为不同治疗组分离出的肿瘤的图片。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

(1)细胞系及细胞培养

胃癌细胞(HGC-27)由来自广东药科大学附属第一医院林绍强课题组赠送提供，人胃黏膜上皮细胞(GES-1)购置于北纳创联生物科技有限公司。HGC-27的培养基中含有以下成分：89％RPMI培养基1640(GIBCO，美国)、10％热灭活胎牛血清(FBS，Corning，美国)、1％青霉素-链霉素溶液(GIBCO，美国)。在37℃，5％二氧化碳的培养箱(Thermo，美国)中培养。

(2)多肽Caerin1.9多肽、TFMP-Y2多肽及P3多肽的氨基酸序列组成

Caerin1.9多肽：GLFGVLGSIAKHVLPHVVPVIAEKL-NH

TFMP-Y2多肽：YGLHRVLGSAKHAEKL-NH

P3多肽：GTELPSPPSVWFEAEF-OH；

P3多肽、Caerin1.9、TFMP-Y2多肽均由中国多肽有限公司合成(上海，中国)，反相HPLC测定其纯度均为＞95％，将Caerin1.9多肽、TFMP-Y2及P3多肽用磷酸盐缓冲溶液(PBS，GIBCO，美国)溶解成不同浓度(10mg/mL、1mg/mL和0.1mg/mL)，并保存在-20℃冰箱中。

(3)裸鼠

BALB/C成年雌性裸鼠若30只，雌性，4～6周周龄，体重15～18g，购于广东省医学实验动物中心，根据无特殊病原体SPF标准饲养于动物资源中心(广东药科大学第一附属医院)，饲养所需饲料、水、垫料均经过无菌处理。在实验结束前，无动物生病或死亡。裸鼠按照中华人民共和国卫生部《动物管理办法》(中华人民共和国卫生部号文)施行颈椎脱臼安乐死。所有实验均按照广东药科大学附属第一医院动物实验伦理委员会(伦理审批号ber:FAHGPΜ20160316)的指导方针审批实施。

本发明以Caerin1.9多肽为基础，进行修饰以增强多肽水溶性并减少其对正常细胞的抑制作用，得到一条新的小分子多肽TFMP-Y2(SEQ ID No.1)，通过体内外实验探究Caerin1.9与TFMP-Y2的极性，比较Caerin1.9与修饰多肽TFMP-Y2及其碘-131标记产物：

数据分析：以下实施例所有实验至少重复3次。除两种标记产物的标记率比较使用GraphPad Prism9.0.0软件(圣地亚哥，CA，美国)进行t检验，其余所有实验数据均用此软件进行方差分析。在P<0.05时，认为差异显著。

实施例1MTT实验探究Caerin1.9、P3、TFMP-Y2多肽对HGC-27、GES-1细胞增殖抑制作用

将500mg MTT粉末(Sigma-Aldrich，美国)溶于100mLPBS中，其浓度为5mg/mL(即0.5％MTT)，避光保存于-20℃冰箱中。取对数生长期的HGC-27或GES-1细胞，用0.25％胰酶(GIBCO，美国)消化制成单细胞悬浮液，稀释细胞数至5×10

MTT实验结果如图1所示，生存百分率(S％)结果如图1A、1E所示，显示Caerin1.9多肽在小于5μg/mL时对HGC-27细胞无明显抑制作用，随Caerin1.9多肽浓度的增加其对HGC-27细胞的增殖抑制能力增强。当Caerin1.9多肽浓度高于15μg/mL时，细胞存活率明显下降，当Caerin1.9多肽浓度为40μg/mL时，生存率为(6.35±0.74)％；Caerin1.9多肽在大于10μg/mL时对GES-1细胞抑制增殖，当Caerin1.9多肽浓度为40μg/mL时，存活率仅为(13.80±0.56)％，高浓度下两种多肽对HGC-27、GES-1细胞的抑杀作用均有统计学差异(P＜0.05)。而如图1C、1G所示，TFMP-Y2多肽在较高浓度(40μg/mL)时，HGC-27、GES-1细胞仍然保持较高的存活率，存活率分别为(93.44±2.53)％、(98.10±2.61)％；如图1D、1H，Caerin1.9多肽作用于HGC-27细胞的IC

实施例2平板克隆实验

取对数生长期的HGC-27细胞，用0.25％胰酶(GIBCO，美国)消化制成单细胞悬浮液，稀释细胞数至1×10

平板克隆实验结果如图2-3所示，显微镜下观察到的细胞集落数量结果如图2所示，显示Caerin1.9多肽对HGC-27细胞增殖抑制作用具有浓度依赖性，Caerin1.9多肽浓度越大，抑制作用也越强，而TFMP-Y2多肽不具有浓度依赖性，在较高浓度时对HGC-27细胞系仍然保持较高的存活率。细胞集落的计数结果如图3所示，显示Caerin1.9多肽处理的平板实验与对照组(浓度为0μg/mL)相比，当浓度为2μg/mL、4μg/mL、6μg/mL、10μg/mL、15ug/mL时，细胞克隆数目的差异有统计学意义(P＜0.05)；而TFMP-Y2多肽处理的细胞，随多肽浓度增加，对HGC-27细胞无明显抑制作用，与MTT实验结果具有一致性。

实施例3制备

(1)准确称取10mg氯胺-T三合水粉末，置于15mL离心管中，加入10mL的PBS混匀溶解，配成1mg/mL氯胺-T溶液，室温避光保存，现配现用。

(2)向1.5mL无菌EP管(上海宏生，中国)中加入40μL的Caerin1.9多肽(1mg/mL)，随后向其中加入100μL、1mCi(3.7×10

(3)向1.5mL无菌EP管(上海宏生，中国)中加入40μL的TFMP-Y2多肽(1mg/mL)，随后向其中加入100μL、1mCi(3.7×10

(4)用生理盐水(NS，扬州中宝药业，中国)作为展开剂，通过薄层纸层析法，利用γ计数器(中佳光电公司，中国)测定其放射性，来评估

结果如图4所示，

实施例4

将单纯

结果如图5所示，

实施例5脂水分配系数测定

取两个的1.5mLEP管中，将500μL正辛醇(麦克林，中国)、500μL生理盐水和50μL的

计算脂水分配系数(Log P)。

LogP是表明标记产物在有机相或水相中溶解度的一个指标，LogP值大于0表明药物偏向于脂溶性，且LogP的数值越高，表明药物在有机相中的溶解度越高。

表1

表2

实施例6

取对数生长期的HGC-27细胞，稀释细胞数至1×10

细胞摄取实验结果如图6A所示，随着时间的延长，HGC-27细胞对

实施例7

取对数生长期的HGC-27细胞，稀释细胞数至1×10

细胞洗脱实验结果如图6B示，当

以上细胞摄取及洗脱实验显示两种放射性标记产物均可以被HGC-27细胞摄取，并较稳定滞留在细胞中。

实施例8

取对数生长期的HGC-27细胞，稀释细胞数至5×10

实验结果如图7所示，通过CCK-8实验表明随

实施例9裸鼠皮下肿瘤模型建立及体内治疗

将100μL重悬于PBS中的HGC-27细胞(3×10

为了尽量减少甲状腺对

实验结果如图8-9所示，各组裸鼠肿瘤体积大小在开始治疗时差别无统计学意义(P＞0.05)。每组裸鼠的体重较治疗前均无明显下降趋势，至安乐死前，每组裸鼠体重如下：PBS组17.73±0.76g、Caerin1.9组17.20±0.31g、TFMP-Y2组15.91±1.06g、

本发明通过MTT实验证实Caerin1.9对胃癌细胞Caerin1.9对胃癌细胞及正常胃黏膜上皮细胞均有抗肿瘤活性作用，并且有浓度依赖性，而修饰多肽TFMP-Y2对胃癌细胞及人正常胃黏膜上皮细胞生长无明显影响。平板克隆形成实验进一步证明Caerin1.9对胃癌细胞有明显抑制作用。

本发明采用氯胺-T法制备了两种多肽

在体内实验中，本发明建立了HGC-27细胞裸鼠皮下移植肿瘤模型，随着治疗次数的增加，肿瘤体积逐步减小，结果显示至治疗末，与PBS组或Na

综上所述，本发明的实验结果表明，