一种检测甲型流感病毒HA特异性VHH对及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种检测甲型流感病毒HA特异性VHH对及其制备方法和应用。

背景技术

甲型流感病毒(Influenza A Virus,IAV)每年感染全球5-15％的人口，并造成多达65万人死于其导致的呼吸系统疾病；一些人畜共患毒株在对畜牧业造成恶劣影响的同时，还对人具有极高的致病性，甚至可对人造成超过50％的死亡率。因此，IAV的有效防控对于人类健康、生存乃至于社会的稳定发展都具有极其重要的意义。

病毒的分离培养是IAV检测的金标准。但这种方法对于实验条件及实验人员专业素养要求极高，并且操作繁琐、费时费力。并且对于IAV这种亚型众多的病原，分离培养的方法还需配合后续的免疫学或核酸检测方法进行基因分型。分离培养的方法无法在流感疫情出现时，快速的反馈检测结果，无法满足快节奏的病原检测需求。

现常用的IAV病原检测方法有核酸检测方法和免疫学检测方法。核酸检测方法主要包括基于核酸扩增聚合酶链式反应(PCR)的一系列检测方法，例如普通PCR、荧光定量PCR及数字PCR等。这些方法具有高度的特异性和灵敏性，且当靶基因为HA和NA基因时，结合测序技术还可在快速检测IAV的同时对流行毒株进行基因分型。然而这类基于靶核酸片段扩增的检测方法会在实验室环境中产生大量非自然的靶序列，极易造成实验室环境的气溶胶污染，造成后续检测出现假阳性的风险。此外，这类核酸检测方法还需要操作人员具备一定的分子生物学基础，以及精密的热循环设备(如PCR仪)。使得这类技术难以在一些偏远或设备落后的地区普及。

免疫学方法在病原检测方面具有众多优点。例如操作简单，相比于分离培养，不存在扩增病原而造成进一步扩散疫情的风险；并且不同于PCR等核酸检测方法，不需要精密的仪器，因而对实验条件和操作人员要求低，且操作较为简单，能够在数小时内产出检测结果。IAV的免疫学检测方法包括琼脂扩散实验、血凝-血凝抑制实验、神经氨酸酶抑制试验及酶联免疫实验(ELISA)等。其中，ELISA方法不仅操作简便、实验周期短，还具有理想的灵敏度和特异性，成为了最被普遍使用的免疫学IAV检测方法。根据检测靶标的不同，ELISA方法可满足不同目的的IAV抗原检测。其中以IAV NP蛋白为靶标的ELISA可对不同HA亚型的IAV进行交叉监测；而IAV亚型众多，且亚型间交叉保护弱，这就进一步对检测方法提出了“检测+分型”的更高要求，此时，在ELISA中应用不同亚型HA或NA特异性的单克隆抗体作为捕获抗体即可在检测IAV的同时达到IAV分型的目标。然而，受限于抗体捕获IAV抗原的能力以及信号放大的有限性，与PCR方法相比，ELISA方法的灵敏度较低，这也是现有抗原检测ELISA方法存在的主要问题。为提高ELISA检测方法的灵敏度，此前有研究将微流控技术与ELISA技术相结合，建立了数字ELISA方法用于检测IAV NP抗原。相对于传统ELISA该方法具有更高的灵敏度，最低可检测到4fM(约224pg/ml)NP抗原。然而，该方法需要荧光读取设备，牺牲了传统ELISA方法对设备要求低这一优点。要想在不增加传统ELISA实验流程复杂性的前提下提高其监测灵敏度，可从提高捕获抗体与抗原的亲和力来入手。

传统ELISA通常使用鼠源或兔源多克隆或单克隆抗体作为捕获抗体。多克隆抗体通常为分离自免疫过IAV抗原的动物血清的全长IgG，对抗原的特异性和亲和力远不及单克隆抗体。而全长的IgG单克隆抗体具有糖基化修饰，须通过真核表达系统生产，导致生产成本高；且由于IgG由轻链和重链聚合构成，导致IgG生产批次间质控难度高；此外全长IgG分子量大，结合于抗原时空间位阻也大，这降低了夹心法ELISA的检测灵敏度。改善上述IgG存在的这些问题不仅能够降低ELISA试剂盒的生产成本，还能大大提高灵敏度和特异性。

1993年Hamers-Casterman等人报道了存在于骆驼血液中由重链二聚体构成的重链单域抗体。VHH为重链单域抗体的可变区，分子量较小，约15kDa，具有稳定性强、免疫原性低、识别抗原表位时位阻小等优点，被特称为纳米抗体。VHH结构相对简单且无糖基化，可利用大肠杆菌进行高效表达和制备，生产成本低廉。纳米抗体天然缺失轻链，在抗原表面形成的“足迹”往往比IgG更小，相比于全长IgG，VHH的互补决定域(Complementaritydetermining regions，CDRs)在构象上通常更加向外突出，加之更小的分子量，使得VHH能更容易地结合于一些IgG难以接触的表位，使得VHH可识别的抗原表位比IgG更加丰富，VHH与抗原结合时受到的空间位阻也更小。上述优点使VHH在被用于建立夹心法ELISA检测方法时具备先天优势。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种检测甲型流感病毒HA特异性VHH对及其制备方法和应用。

第一方面，本发明提供了一种检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，所述检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，所述检测甲型流感病毒HA特异性VHH对为VHHA1011和VHHB0972；

所述VHHA1011的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述VHHB0972的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

第二方面，本发明提供了第一方面任一项所述的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

通过昆虫细胞表达系统制备H1 HA可溶性抗原，记为rHA1ecto；

将所述rHA1ecto基因序列克隆至pFastBac-1载体，记为rpFastBac-rHA1ecto；

提取所述rpFastBac-rHA1ecto并转化DH10Bac感受态细胞，得到携带rHA1ecto基因的重组质粒rBacmid-rHA1ecto；

提取rBacmid-rHA1ecto并通过脂质体转染Sf9昆虫细胞，后收取出现病变的细胞上清液，记为第一代重组杆状病毒P1；重复感染接种传至第三代重组杆状病毒P3，并使用使用P3感染对数期Sf9昆虫细胞，纯化得到rHA1ecto重组蛋白；

将所述rHA1ecto重组蛋白加不完全弗氏佐剂对羊驼进行肌肉注射免疫，免疫后取外周血，并分离得到外周血淋巴细胞和血清；

通过TRIzol法提取外周血淋巴细胞总RNA，并反转录为cDNA；以cDNA为模板，通过巢式PCR扩增VHH基因片段；随后将VHH连接至pMES4噬菌体质粒的PstI-Eco91I位点之间，并电击转化TG1感受态细胞，得到免疫文库；

使用辅助噬菌体VSCM13侵染所述免疫文库中的TG1细胞，通过噬菌体展示系统进行筛选，获得了所述检测甲型流感病毒HA特异性VHH对。

进一步地，在HA膜外域基因3’端依次添加了柔性肽序列、三聚体基序GCN4pII及6×His标签，其基因序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，以cDNA为模板，通过巢式PCR扩增VHH基因片段的引物序列如SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示。

第三方面，本发明提供了第一方面任一项所述的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，和/或，采用第二方面任一项所述的制备方法所得的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对在制备检测甲型流感病毒产品，和/或，检测甲型流感病毒中的应用。

第四方面，本发明提供了一种基于甲型流感病毒HA特异性VHH对的ELISA抗原检测试剂盒，所述ELISA抗原检测试剂盒包括第一方面任一项所述的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，和/或，采用第二方面任一项所述的制备方法所得的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对。

第五方面，本发明提供了一种基于甲型流感病毒HA特异性VHH对的ELISA抗原检测方法，所述ELISA抗原检测方法包括第一方面任一项所述的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，和/或，采用第二方面任一项所述的制备方法所得的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对。

本发明实施例提供的上述技术方案与现有技术相比至少具有如下优点：

本发明提供了一种检测甲型流感病毒HA特异性VHH对及其制备方法，并将其应用于基于VHH的ELISA抗原检测方法。相比于现有的ELISA方法生产成本更低，且由于VHH对IgG固有的天然优势，本VHH-ELISA方法具有更高的灵敏度(本VHH-ELISA最低可检测12pg HA，而普通ELISA通常最低可检测数百pg或ng级别)。此外，由于IAV亚型众多，且亚型间交叉保护不足，在检测的同时如果能够对IAV进行分型则对IAV的防治具有重要意义，而现有的多数IAV ELISA试剂盒多靶向NP蛋白，不具有分型的功能，而本VHH-ELISA对H1亚型HA抗原具有良好的特异性，在检测的同时还达到了分型的目的。

附图说明

此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明中Western-blot检测P3上清中rHA1ecto重组蛋白结果图。

图2为本发明中rHA1ecto重组蛋白的SDS-PAGE(A)和Wester-blot(B)鉴定结果图。

图3为本发明中三免后血清HA特异性抗体水平结果图。

图4为本发明中第一轮扩增产物检测结果图。

图5为本发明中VHH表达纯化的SDS-PAGE(A)和Western-blot(B)鉴定结果图。

图6为本发明中VHHA1011和VHHB0972对HA抗原的亲和性结果图。

图7为本发明中VHHs与不同亚型HA交叉结合结果图。

图8为本发明中VHH-ELISA方法检测HA结果图。

图9为本发明中VHHA1011量的优化结果图。

图10为本发明中VHH-ELISA灵敏度结果图。

图11为本发明中VHH-ELISA特异性结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

第一方面，本发明提供了一种检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，所述检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，所述检测甲型流感病毒HA特异性VHH对为VHHA1011和VHHB0972；

所述VHHA1011的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述VHHB0972的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

VHHA1011的氨基酸序列SEQ ID NO.1如下所示：

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVQLQESGGGLVQPGRSLRLSCAASGRVVSVHRMEWYRQAPGKQRELVATITTGGKTDYADSVKGRFAISRDNAKNTGYLQMNSLKPEDTAVYYCNLNQRTSLVGPRDDYWGQGTQVTVSSAAAYPGGGSHHHHHHDYKDDDDK；

VHHB0972的氨基酸序列如SEQ ID NO.2如下所示：

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVQLQESGGGSVQPGESLRLSCAASKSIFSIYTMGWYRQAPGKQRELVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISTDNAQNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNADFEGLRGQGYDYWGQGTQVTVSSAAAYPGGGSHHHHHHDYKDDDDK。

本发明提供了一种检测甲型流感病毒HA特异性VHH对及其制备方法，并将其应用于基于VHH的ELISA抗原检测方法。相比于现有的ELISA方法生产成本更低，且由于VHH对IgG固有的天然优势，本VHH-ELISA方法具有更高的灵敏度(本VHH-ELISA最低可检测12pg HA，而普通ELISA通常最低可检测数百pg或ng级别)。此外，由于IAV亚型众多，且亚型间交叉保护不足，在检测的同时如果能够对IAV进行分型则对IAV的防治具有重要意义，而现有的多数IAV ELISA试剂盒多靶向NP蛋白，不具有分型的功能，而本VHH-ELISA对H1亚型HA抗原具有良好的特异性，在检测的同时还达到了分型的目的。

第二方面，基于同一个发明构思，本发明提供了第一方面任一项所述的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

通过昆虫细胞表达系统制备H1 HA可溶性抗原，记为rHA1ecto；

将所述rHA1ecto基因序列克隆至pFastBac-1载体，记为rpFastBac-rHA1ecto；

提取所述rpFastBac-rHA1ecto并转化DH10Bac感受态细胞，得到携带rHA1ecto基因的重组质粒rBacmid-rHA1ecto；

提取rBacmid-rHA1ecto并通过脂质体转染Sf9昆虫细胞，后收取出现病变的细胞上清液，记为第一代重组杆状病毒P1；重复转染接种传至第三代重组杆状病毒P3，并使用使用P3感染对数期Sf9昆虫细胞，纯化得到rHA1ecto重组蛋白；

将所述rHA1ecto重组蛋白加不完全弗氏佐剂对羊驼进行肌肉注射免疫，免疫后取外周血并分离，得到外周血淋巴细胞和血清；

通过TRIzol法提取外周血淋巴细胞总RNA，并反转录为cDNA；以cDNA为模板，通过巢式PCR扩增VHH基因片段；随后将VHH连接至pMES4噬菌体质粒的PstI-Eco91I位点之间，得到免疫文库；

使用辅助噬菌体VSCM13侵染所述免疫文库中的TG1细胞，通过噬菌体展示系统进行筛选，获得了所述检测甲型流感病毒HA特异性VHH对。

在一些具体实施例中，在H1 HA膜外域基因3’端依次添加了柔性肽序列、三聚体基序GCN4pII及6×His标签，其基因序列如SEQ ID NO.3所示，具体基因序列为：ATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATACATTTGCAACCGCAAATGCAGACACATTATGTATAGGTTACCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAACACACTCTGTTAATCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCCCATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTCCACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGGAGATTTTATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAGATATTCCCCAAAACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCTCATGCTGGAGCAAAAGGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCAAAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCATCCATCTACTACTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATACATATGTTTTTGTGGGGACATCAAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGGAGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAATCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATACACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCATTTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACTGGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTTGGGGCCATTGCCGGCTTCATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGGGTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACAAGATTACTAACAAAGTAAATTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAAAAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGAACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAAMTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATATGAAAAGGTAAGAAACCAGTTAAARAACAATGCCAAGGAAATTGGAAATGGCTGCTTTGAATTTTACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACTCAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAGGTGGTGGCCGTATGAAACAGATCGAAGACAAAATCGAAGAGATTCTGAGCAAAATTTACCACATCGAGAACGAAATCGCGCGTATTAAAAAACTGGTCGGCGAACGTCACCACCATCACCACCACTGA。

在一些具体实施例中，以cDNA为模板，通过巢式PCR扩增VHH基因片段的引物序列如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；分别如下所示：

CALL001:5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′；记为SEQ ID NO.4；

CALL002:5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′；记为SEQ ID NO.5；

VHH-Back:5′-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3′；记为SEQ ID NO.6；

VHH-For:5′-CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT-3′；记为SEQ ID NO.7。

第三方面，基于同一个发明构思，本发明提供了第一方面任一项所述的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，和/或，采用第二方面任一项所述的制备方法所得的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对在制备检测甲型流感病毒产品，和/或，检测甲型流感病毒中的应用。

第四方面，基于同一个发明构思，本发明提供了一种基于甲型流感病毒HA特异性VHH对的ELISA抗原检测试剂盒，所述ELISA抗原检测试剂盒包括第一方面任一项所述的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，和/或，采用第二方面任一项所述的制备方法所得的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对。

第五方面，基于同一个发明构思，本发明提供了一种基于甲型流感病毒HA特异性VHH对的ELISA抗原检测方法，所述ELISA抗原检测方法包括第一方面任一项所述的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，和/或，采用第二方面任一项所述的制备方法所得的检测甲型流感病毒HA特异性VHH对。

下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照国家标准测定。若没有相应的国家标准，则按照通用的国际标准、常规条件、或按照制造厂商所建议的条件进行。

实施例

本例提供一种检测甲型流感病毒HA特异性VHH对，并进一步将其应用于甲型流感病毒检测，建立ELISA检测方法。包括以下过程：

1、HA抗原的制备：为分离获得IAV H1亚型HA抗原的特异性VHH，首先通过昆虫细胞表达系统制备H1 HA可溶性抗原，记为rHA1ecto。为使所表达的rHA抗原能够构成三聚体并通过镍柱纯化，在HA膜外域(ecto)基因3’端依次添加了柔性肽序列、三聚体基序GCN4pII及6×His标签，具体基因序列为：

ATGAAGGCAATACTAGTAGTTCTGCTATATACATTTGCAACCGCAAATGCAGACACATTATGTAT

AGGTTACCATGCGAACAATTCAACAGACACTGTAGACACAGTACTAGAAAAGAATGTAACAGTAA

CACACTCTGTTAATCTTCTAGAAGACAAGCATAACGGGAAACTATGCAAACTAAGAGGGGTAGCCC

CATTGCATTTGGGTAAATGTAACATTGCTGGCTGGATCCTGGGAAATCCAGAGTGTGAATCACTCTC

CACAGCAAGCTCATGGTCCTACATTGTGGAAACATCTAGTTCAGACAATGGAACGTGTTACCCAGG

AGATTTTATCGATTATGAGGAGCTAAGAGAGCAATTGAGCTCAGTGTCATCATTTGAAAGGTTTGAG

ATATTCCCCAAAACAAGTTCATGGCCCAATCATGACTCGAACAAAGGTGTAACGGCAGCATGTCCT

CATGCTGGAGCAAAAGGCTTCTACAAAAATTTAATATGGCTAGTTAAAAAAGGAAATTCATACCCA

AAGCTCAGCAAATCCTACATTAATGATAAAGGGAAAGAAGTCCTCGTGCTATGGGGCATTCACCAT

CCATCTACTACTGCTGACCAACAAAGTCTCTATCAGAATGCAGATACATATGTTTTTGTGGGGACATC

AAGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCGGAAATAGCAATAAGACCCAAAGTGAGGGATCAAGAAGGG

AGAATGAACTATTACTGGACACTAGTAGAGCCGGGAGACAAAATAACATTCGAAGCAACTGGAAA

TCTAGTGGTACCGAGATATGCATTCGCAATGGAAAGAAATGCTGGATCTGGTATTATCATTTCAGATA

CACCAGTCCACGATTGCAATACAACTTGTCAGACACCCAAGGGTGCTATAAACACCAGCCTCCCAT

TTCAGAATATACATCCGATCACAATTGGAAAATGTCCAAAATATGTAAAAAGCACAAAATTGAGACT

GGCCACAGGATTGAGGAATGTCCCGTCTATTCAATCTAGAGGCCTATTTGGGGCCATTGCCGGCTTC

ATTGAAGGGGGGTGGACAGGGATGGTAGATGGATGGTACGGTTATCACCATCAAAATGAGCAGGG

GTCAGGATATGCAGCCGACCTGAAGAGCACACAGAATGCCATTGACAAGATTACTAACAAAGTAAA

TTCTGTTATTGAAAAGATGAATACACAGTTCACAGCAGTAGGTAAAGAGTTCAACCACCTGGAAAA

AAGAATAGAGAATTTAAATAAAAAAGTTGATGATGGTTTCCTGGACATTTGGACTTACAATGCCGA

ACTGTTGGTTCTATTGGAAAATGAAAGAAMTTTGGACTACCACGATTCAAATGTGAAGAACTTATA

TGAAAAGGTAAGAAACCAGTTAAARAACAATGCCAAGGAAATTGGAAATGGCTGCTTTGAATTTT

ACCACAAATGCGATAACACGTGCATGGAAAGTGTCAAAAATGGGACTTATGACTACCCAAAATACT

CAGAGGAAGCAAAATTAAACAGAGAAGAAATAGATGGGGTAAAGCTGGAATCAGGTGGTGGCCGT

ATGAAACAGATCGAAGACAAAATCGAAGAGATTCTGAGCAAAATTTACCACATCGAGAACGAAATCGCGCGTATTAAAAAACTGGTCGGCGAACGTCACCACCATCACCACCACTGA。

通过人工合成rHA1ecto基因并克隆至pFastBac-1载体，记为rpFastBac-rHA1ecto。随后，提取rpFastBac-rHA1ecto质粒并转化DH10Bac感受态细胞，具体步骤：取10μl rpFastBac-rHA1ecto质粒加至冰上融化的100μl DH10Bac感受态细胞，轻轻混匀后冰上静置30分钟，随后42℃热激60秒并迅速转移至冰上静置2分钟，加入500μl LB液体培养基于摇床复苏1小时，随后取100ul菌液涂布于蓝白斑筛选平板，隔天挑取白色菌斑进行扩大培养。rHA1ecto可通过pFastBac上的Tn7转座子整合至DH10Bac中的杆状病毒质粒Bacmid，得到携带rHA1ecto基因的重组质粒rBacmid-rHA1ecto。随后提取rBacmid-rHA1ecto，并通过脂质体转染Sf9昆虫细胞，取8μL Cellfectin II与100μL Grace’s Insect Medium培养基涡旋混合，同时，取1μg重组杆粒与100μL Grace’s Insect Medium培养基温和混匀，将这两种混合液温和混匀，室温下静置15-30分钟；将转染混合物逐滴加在六孔板中贴壁培养的Sf9细胞(接合率＞70％)，27℃培养3-5小时；将六孔板中的培养基替换为2mL新鲜Sf-900II培养基，27℃培养约72小时后可观察到细胞病变。将出现病变的细胞上清液收集，其中含有携带目的基因的重组杆状病毒，记为第一代重组杆状病毒P1；将P1代重组杆状病毒接种至对数期Sf9昆虫细胞，72小时后收取上清，记为第二代重组杆状病毒，P2；如此重复至P3，使用P3感染对数期Sf9昆虫细胞，培养72小时后通过western blot检测rHA1ecto表达情况(检测结果如图1所示)。

得到阳性结果后，收集所有培养上清，通过镍柱纯化其中的rHA1ecto重组蛋白，随后通过SDS-PAGE和western blot鉴定rHA1ecto重组蛋白(检测结果如图2所示)。

2、羊驼免疫：通过BCA法测定rHA1ecto重组蛋白浓度后，取100μg rHA1ecto重组蛋白加不完全弗氏佐剂对青年羊驼(2岁)进行肌肉注射，共免疫3次，每次免疫间隔2周，第三次免疫2周后取外周血，用于分离外周血淋巴细胞(PBMCs)和血清，血清用于检测HA特异性抗体水平，PBMCs用于提取RNA扩增VHH基因片段。为使用ELISA方法检测血清中HA特异性抗体水平，首先制备HA抗原包被板。具体步骤如下，使用50mM碳酸盐缓冲液(Ph 9.6)稀释rHA1ecto重组蛋白至1μg/ml，将稀释后的重组蛋白转移至96孔板，每孔100μl，4℃过夜。第二天弃去包被液，使用PBST洗3次，每孔加200μl 1％BSA溶液于37℃封闭1小时；随后弃去封闭液，使用PBST洗3次，得到rHA1ecto重组蛋白包被板。将血清3倍梯度稀释，将不同稀释倍数的血清依次加入96孔板的不同孔中，每个稀释倍数做3个技术重复，37℃孵育2小时；弃去孔中液体后，使用PBST洗3次，随后每孔加100μl HRP标记的anti-Alpaca IgG抗体，37℃孵育1小时；弃去二抗，使用PBST洗3次，每孔加50μl TMB底物，37℃反应15min后加终止液，于酶标仪读取OD450nm。ELISA结果显示，经三次免疫后，羊驼血清中含有高水平的HA特异性抗体(检测结果如图3所示)。

3、免疫文库的构建：首先使用TRIZol法提取PBMCs总RNA。随后使用商品化试剂盒将RNA反转录为cDNA，使用VHH特异性引物，使用Q5 High-Fidelity DNA Polymerase(NEB)通过巢式PCR扩增VHH基因片段：首先使用进行第一轮扩增，外引物序列为：

CALL001:5′-GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3′；

CALL002:5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′；

扩增完成后，通过电泳可观察到700和1000bp两条条带，分别对应重链单域抗体和IgG的可变区(检测结果如图4所示)。

随后，对VHH片段切胶回收，纯化DNA后取3μl作为模板，通过VHH特异性引物：VHH-Back:5′-GATGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGRGGAGG-3′和VHH-For:5′-CTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT-3′扩增获得大量VHH片段。随后取至少500ng经胶回收纯化后的VHH片段连接至2.4μg pMES4噬菌体质粒的PstI-Eco91I位点之间，连接产物使用使用QIAquick PCRpurification kit进行纯化，最后使用30μl EB洗脱。将30μl纯化连接产物等分为5×6μl，分别电转化25μl TG1细胞，随后用1ml预热的复苏培养基(37℃)悬浮转化产物，并将5个电转槽中悬浮液收集于一个50ml离心管，37℃，170rpm培养1h；加入LB定容至8ml；取100μl电转后的细胞进行10倍梯度稀释，取10

4、VHH的筛选：通过使用辅助噬菌体VSCM13侵染免疫文库中的TG1细胞可拯救出表面携带VHH的重组噬菌体。将6OD

20000g，4℃离心15min，弃上清，噬菌体沉淀使用1ml冰上预冷的PBS重悬，20000g，4℃离心1min，再次沉淀残余细菌；上清转移至新的离心管中，液体中含有表达VHH的重组噬菌体，用于后续筛选。

筛选前，使用4μg rHA1ecto重组蛋白过夜包被免疫试管，随后用1％ BSA封闭，经PBST洗涤3次后将重组噬菌体加入免疫试管孵育2小时，使噬菌体表面的VHH与rHA1ecto抗原充分结合，随后弃去液体，使用PBST洗15-20次，随后使用500μl酸性buffer(pH 2.1)洗脱重组噬菌体，将液体转移至新的ep管，并加入等体积的碱性buffer(pH 9.0)进行中和，得到第一轮筛选的VHH重组噬菌体；将重组噬菌体与3ml处于指数生长期的TG1细胞混合，37℃静置孵育30分钟。随后添加7ml的LB培养基，并补充100μg/ml的氨苄西林和2％(重量/体积比)的葡萄糖；在37℃摇转过夜培养。将1ml的样本作为甘油库(20％(体积/体积比))分装在-80℃保存以备后用。如此记为第一轮筛选免疫文库。重复上述步骤直至第五轮。取100μl第五轮文库稀释1000倍进行涂板，挑取约100个单克隆培养至对数期，使用辅助噬菌体拯救携带VHH的重组噬菌体，并在rHA1ecto包被的96孔板上进行ELISA试验以评价各VHH与HA的亲和性，该ELISA实验中使用HRP标记的anti-gp8(GE)作为二抗。最终挑选了两条对HA具有高亲和力的重组噬菌体进行测序，获得VHH序列(VHHA1011和VHHB0972)。

5、VHH和表达、纯化及鉴定：获得VHHA1011和VHHB0972基因序列后，在3’端依次添加柔性肽、6×His标签及Flag标签，氨基酸序列如下：

VHHA1011：

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVQLQESGGGLVQPGRSLRLSCAASGRVVSVHRMEWYRQAP GKQRELVATITTGGKTDYADSVKGRFAISRDNAKNTGYLQMNSLKPEDTAVYYCNLNQRTSLVGPRDD YWGQGTQVTVSSAAAYPGGGSHHHHHHDYKDDDDK；

VHHB0972：

MKYLLPTAAAGLLLLAAQPAMAQVQLQESGGGSVQPGESLRLSCAASKSIFSIYTMGWYRQAPG KQRELVAAITSGGSTNYADSVKGRFTISTDNAQNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCNADFEGLRGQGYDY WGQGTQVTVSSAAAYPGGGSHHHHHHDYKDDDDK。

合成对应基因序列后克隆至原核表达载体pET28a，热激转化至BL21感受态细胞进行原核表达；随后通过镍柱对VHHA1011和VHHB0972进行纯化，随后进行SDS-PAGE和western-blot进行鉴定(检测结果如图5所示)。

随后通过BCA法测定VHH浓度，取500ng VHH进行3倍梯度稀释，在rHA1ecto重组蛋白包被的96孔中进行ELISA试验(100ng/孔)，以验证纯化的VHH对HA抗原的亲和性；其中，为检验两VHH是否为rHA1ecto重组蛋白上His标签抗体，以携带His标签的不相关蛋白RBD为对照(Ctrl)，不包被任何抗原的孔为阴性对照(NC)。结果显示，VHHA1011和VHHB0972对HA均具有较高的亲和性，即使在最高稀释倍数(2187倍)，产生的OD值也高于两倍NC，且NC组和Ctrl组结果间无显著差异；表明,两VHH不与His标签结合，为HA特异性抗体(检测结果如图6所示)。

此外，为保证后续建立的HA抗原ELISA检测方法对H1亚型HA具有特异性，我们使用H1、H2、H3、H5及H7亚型的HA抗原制备抗原包被板，对两VHH的交叉结合能力进行了检验。结果显示，VHHB0972仅对H1亚型HA有反应，而VHHA1011则对H1、H2及H5亚型HA具有交叉结合能力(检测结果如图7所示)。

为保证后续开发的IAV ELISA抗原检测方法具有H1亚型特异性，我们将无Flag标签的VHHB0972作为捕获抗体包被于96孔板(100ng)；VHHA1011作为检测抗体(2.5μg)，并在其羧基端添加Flag标签用以与HRP标记的anti-Flag抗体相结合。结果显示，通过这种方法建立的ELISA方法能够对H1亚型HA(1ng)产生反应(检测结果如图8所示)。

后我们优化了检测抗体VHHA1011的量，将VHHA1011进行5倍梯度稀释，结果显示，随着VHHA1011浓度降低，尽管检测信号衰减，但NC值也更低(检测结果如图9所示)。综合考虑试剂盒的生产成本，确定了VHHA1011最佳用量为100ng。

随后，使用3倍梯度稀释的HA抗原检验了该VHH-ELISA方法的灵敏度。结果显示，NC的平均值为0.1，以2倍NC的OD450为临界值。因此，当OD450大于0.2时判定为阳性。本VHH-ELISA方法最低可检测12pg HA抗原(检测结果如图10所示)。

随后，我们进一步验证了VHH-ELISA方法对H1亚型HA抗原的特异性。结果显示，所建立的VHH-ELISA方法对IAV的H2、H3、H5、H7亚型HA、乙型流感病毒(IBV)的V系和Y系HA抗原、呼吸道合胞体病毒(RSV)以及SARS-CoV-2的RBD抗原均不产生反应(检测结果如图11所示)，表明该VHH-ELISA方法特异性优异。

综上所述，本发明提供了一种检测甲型流感病毒HA特异性VHH对及其制备方法和应用，IAV的早期诊断对于疫情的防控及治疗具有重要意义。本专利提供了一种基于VHH的ELISA抗原检测方法。相比于现有的ELISA方法生产成本更低，且由于VHH对IgG固有的天然优势(详见前文)，本VHH-ELISA方法具有更高的灵敏度(本VHH-ELISA最低可检测12pg HA，而普通ELISA通常最低可检测数百pg或ng级别)。此外，由于IAV亚型众多，且亚型间交叉保护不足，在检测的同时如果能够对IAV进行分型则对IAV的防治具有重要意义，而现有的多数IAV ELISA试剂盒多靶向NP蛋白，不具有分型的功能，而本VHH-ELISA对H1亚型HA抗原具有良好的特异性，在检测的同时还达到了分型的目的。

以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。