抗艾滋病毒P24抗原的纳米抗体及其应用和产品

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种抗艾滋病毒P24抗原的纳米抗体及其应用和产品。

背景技术

由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiencyvirus，HIV)引起的获得性免疫缺陷综合征，简称艾滋病。人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV-1)的p24抗原是HIV感染者体内最早出现的病毒蛋白之一，可作为诊断标志物将检测“窗口期”缩短至14天左右，在HIV感染的早期诊断、抗病毒治疗监测等过程中至关重要。HIV-1p24抗原是目前研究最多、最成熟的抗原之一，由于出现较早，且血清中含量较高，成为重要的HIV感染早期诊断标志。

对HIV感染的检测方法包括抗体检测、P24抗原检测、核酸检测以及CD4+T淋巴细胞水平检测等。机体感染HIV后，P24抗原是较早能从血清中检出的病原学标志，感染后约2～3周即可检出，1～2个月左右进入抗原高峰，然后随着机体抗体的逐渐产生，由于抗体的中和作用，形成抗原抗体复合物，而游离性抗原很少，甚至会低于监测水平，机体进入无症状感染期。疾病后期，随着病毒的复制增强，免疫系统逐渐破坏，P24抗原水平会再次提高作为HIV活动性感染的标志。而HIV抗体的检测存在一个窗口期，一般平均为2～3个月，但95％以上HIV-1感染者产生抗体的时间是在感染后6个月以内。P24抗原在血清抗体阳转前2d～18d即可检测到，因此HIV-1P24抗原检测可作为HIV抗体检测窗口期的辅助诊断，也可检测疾病进展、进行药物疗效评估等。

P24抗原是HIV的主要结构蛋白，在病毒的包装和成熟过程中起重要作用，缺失P24病毒将无法正常组装。P24蛋白是gag基因编码55kD的前体蛋白经pol基因编码的蛋白酶的加工后产生的，总共232氨基酸，大小约26KDa。因此P24蛋白氨基酸顺序在HIV各病毒株之间高度保守，使P24在HIV-1感染的检测中有一定的实用价值。为了解决基层及现场大规模应用的问题，免疫学法由于其检测速度快，成本低，通量高，不需要额外设备等优点，倍受重视。其中ELISA和胶体金免疫层析技术是最常用的免疫学检测方法，虽然存在一定的假阳率，但灵敏度高，操作简单。尤其是胶体金试纸条，因其使用方便快速，成本低，不需要特殊仪器，便于基层使用和现场使用，使用无公害等优点越来越受到临床检测的青睐。因此，开发出优良的诊断用的P24抗体，成为了决定免疫学法应用前景的关键。

纳米抗体分子量仅为传统完整抗体的1/10(约15kD)，单域抗体通过重链上的一个可变区(VHH)结合抗原，该可变区可以单独稳定地在体外存在，具有完整的抗原识别能力，一般通过噬菌体筛选得到完整抗体序列。纳米抗体为驼类(骆驼、羊驼)和软骨鱼类(鲨鱼)中天然存在的仅由两条重链组成的特殊抗体，只包含一个重链可变区(VHH,VariableDomain of Heavy Chain Antibody)和两个常规的CH2与CH3区。但却不像人工改造的单链抗体片段(scFv)那样容易相互沾粘，甚至聚集成块，更重要的是单独克隆并表达出来的VHH结构具有与原重链抗体相当的结构稳定性以及与抗原的结合活性，是目前已知的可结合目标抗原的最小单位。与普通抗体相比，纳米抗体拥有多个优势。首先，它们的大小不到常规抗体的十分之一；机构稳定性强。可溶性好，组织穿透力强。亲和力高。对人体的免疫原性弱。易于表达纯化和改造，更易于大规模生产且具有成本效益。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种抗艾滋病毒P24抗原的纳米抗体，以解决上述问题。

本发明的第二目的在于提供一种核苷酸。

本发明的第三目的在于提供一种载体。

本发明的第四目的在于提供一种细胞。

本发明的第五目的在于提供上述纳米抗体在制备艾滋病毒检测产品中的应用。

本发明的第六目的在于提供一种艾滋病毒标记物。

本发明的第七目的在于提供一种用于艾滋病毒检测的试剂盒。

为了实现以上目的，特采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种抗艾滋病毒P24抗原的纳米抗体，所述纳米抗体的重链可变区VHH包括：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VHH、具有如SEQID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VHH、具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VHH。

作为进一步技术方案，所述重链可变区VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

第二方面，本发明提供了一种核苷酸，所述核苷酸包括编码上述纳米抗体的核苷酸序列。

第三方面，本发明提供了一种载体，所述载体携带上述核苷酸。

第四方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞携带上述核苷酸，或者含有上述载体，或者表达上述纳米抗体。

第五方面，本发明提供了上述纳米抗体在制备艾滋病毒检测产品中的应用。

第六方面，本发明提供了一种艾滋病毒标记物，包括上述纳米抗体和标记物；

所述纳米抗体和标记物偶联。

作为进一步技术方案，所述标记物包括酶、荧光分子标记、荧光微球、彩色微球、胶体金、生物素或链霉亲或素。

第七方面，本发明提供了一种用于艾滋病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述纳米抗体或者上述艾滋病毒标记物。

作为进一步技术方案，所述试剂盒包括免疫层析检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、免疫磁微粒检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒或免疫印记检测试剂盒。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明运用原核表达的艾滋病毒P24抗原蛋白免疫羊驼，通过羊驼外周血单个核细胞(PBMC)的分离，再经反转录cDNA构建纳米抗体噬菌体文库，通过抗体库筛选，抗体表达与功能验证，获得高纯度、高灵敏度和高特异性的抗艾滋病毒P24抗原的纳米抗体，为开发检测艾滋病毒P24免疫试纸条提供了所需的原料。本发明的抗艾滋病毒P24抗原的纳米抗体Anti-P24-VHH-1，可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测，所获抗体经验证具有良好的特异性结合能力。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明P24纳米抗体-mFc融合蛋白的SDS PAGE结果。

具体实施方式

下面将结合实施方式和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施方式和实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

抗体的“可变区(variable region)”或“可变结构域”是指抗体的重链或轻链的氨基端识别并结合抗原的结构域，该区段氨基酸的组成和排列决定了抗体识别抗原的特异性。纳米抗体的重链可变区可以被称为“VHH”。重链可变区通过4个框架(frameworkregion，FR)连接的3个互补性决定区(complementarity-determining region，CDR)(也被称作高变区)组成。CDR通过FR保持紧密靠在一起构成可变区，重链可变区VHH可由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。

术语“载体”是指，可将核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。

所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(IRES)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚U序列等)。

第一方面，本发明提供了一种抗艾滋病毒P24抗原的纳米抗体，所述纳米抗体的重链可变区VHH包括：具有如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的互补决定区CDR1-VHH、具有如SEQID NO.2所示氨基酸序列的互补决定区CDR2-VHH、具有如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的互补决定区CDR3-VHH。

SEQ ID NO.1-3的氨基酸序列如表1所示。

表1

在一些可选的实施方式中，所述重链可变区VHH的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

VQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVAPGNTFSQATIGWYRQAPGKQREV VAVVSISGSTVYNDPVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCK VPGIPWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO.4)。

在一些可选的实施方式中，所述重链可变区VHH的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示：

GTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCTCCTGGAAACACCTTCAGTCAGGCTACCATTGGTTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAAGTGGTCGCAGTTGTTAGTATCAGTGGTAGTACAGTCTATAACGACCCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTAAAGTCCCCGGGATCCCTTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.5)。

第二方面，本发明提供了一种核苷酸，所述核苷酸包括编码上述纳米抗体的核苷酸序列。

该核酸能够表达本发明的纳米抗体。

第三方面，本发明提供了一种载体，所述载体携带上述核苷酸。

该载体携带有本发明纳米抗体的基因，能够表达本发明的纳米抗体。

第四方面，本发明提供了一种细胞，所述细胞携带上述核苷酸，或者含有上述载体，或者表达上述纳米抗体。

该细胞能够表达本发明的纳米抗体，能够用于该纳米抗体的制备。

第五方面，本发明提供了上述纳米抗体在制备艾滋病毒检测产品中的应用。

本发明提供的纳米抗体能够特异性识别艾滋病毒，因此能够用于艾滋病毒的检测。

第六方面，本发明提供了一种艾滋病毒标记物，包括上述纳米抗体和标记物；

所述纳米抗体和标记物偶联。

该标记物能够用于艾滋病毒的特异性标记。

在一些可选的实施方式中，所述标记物包括但不限于酶、荧光分子标记、荧光微球、彩色微球、胶体金、生物素或链霉亲或素。

第七方面，本发明提供了一种用于艾滋病毒检测的试剂盒，所述试剂盒包括上述纳米抗体或者上述艾滋病毒标记物。

在一些可选的实施方式中，所述试剂盒包括但不限于免疫层析检测试剂盒、ELISA检测试剂盒、免疫磁微粒检测试剂盒、免疫荧光检测试剂盒或免疫印记检测试剂盒。

下面通过具体的实施例和对比例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

实施例1、羊驼纳米抗体Anti-P24-VHH-1

一、构建重组质粒。

根据艾滋病毒P24抗原蛋白的序列(Genebank登录号:AAL98903.1)，在上海生工合成了P24的基因序列，上游加BamH I的酶切位点GGATCC，下游加EcoR I的酶切位点GAATTC。利用BamH I和EcoR I双酶切出684bp的P24片段，回收后连接到同样被BamH I和EcoR I双酶切的pGEX-6p-1载体中，得到细菌表达质粒pGEX-6p-1-P24。将测序正确的pGEX-6p-1-P24质粒转化到BL21菌株中诱导表达。

二、制备艾滋病毒P24抗原

将含有pGEX-6p-1-P24的BL21克隆在含有50μg/mL氨苄的10mL LB+0.5％葡萄糖培养基中37℃过夜培养(37℃,200rpm)，次日1:100放大转接至500mL培养基中，37℃200rpm培养至OD600约0.6时加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃诱导16小时后收集菌体(500mL收菌瓶，4000rpm，10min，4℃)，弃上清。加入30mL PBS缓冲液，震荡悬起菌体，置冰上(之后步骤都在冰上进行)，4℃超声破碎(70w,超声90次，每次10s,10s间歇)至溶液清亮后离心去除沉淀，按照参照GE公司Glutathione Sepharose 4B使用指南过柱收集目标蛋白。

具体操作如下：

(1)样品的澄清过滤：使用50ml注射器以及0.22μm滤膜将准备好的菌体上清进行澄清；

(2)采用蛋白层析柱，在AKTA上进行捕获、纯化；

(3)进行系统冲洗，再用平衡液冲洗AKTA的A1泵，洗脱液冲洗B1泵；

(4)设置好系统流速0.1ml/min，选择相应的柱位1号位连接蛋白层析柱，用平衡液PBS对AKTA及柱子进行平衡，平衡结束后紫外调零；

(5)开始上样，将A1泵转移至上样离心管内上样；

(6)上样结束后，将A1泵转移至平衡缓冲液PBS中，冲洗平衡液至检测波长稳定后，将A1泵转移至洗脱液(1*PBS+15mM Reduced glutathione还原性谷胱甘肽,pH 8.0-9.0)中洗脱，收集洗脱液；

(7)再用平衡液A冲洗，最后冲20％的乙醇，保存。

结果，用洗脱缓冲液从柱上洗脱重组GST标记的P24抗原蛋白，用SDS-PAGE分析纯化蛋白，用考马斯亮蓝染色法观察。

用重组HRV 3C蛋白酶过夜酶切GST-P24抗原蛋白,切掉GST标签，过GE公司的凝胶过滤预装柱/Superdex 200Increase 10/300GL通过分子筛作用，分离获得高纯度的艾滋病毒P24抗原蛋白。

三、羊驼纳米抗体Anti-P24-VHH-1的制备

(1)免疫羊驼

用原核表达纯化的P24抗原蛋白，每次免疫总的抗原量保持在1mg之间，体积在2mL以下，免疫前将抗原和佐剂1：1乳化使其形成均匀混合物，使用乳化仪充分乳化。在羊驼颈部淋巴结附近分左右两侧注射免疫，之后每隔两周免疫一次(1mg蛋白)，并使用弗式不完全佐剂，一共免疫5次，最后一次免疫后采集外周血检测效价。

(2)纳米抗体文库构建

待羊驼达到一定免疫效价，对其进行最后一次冲击免疫，7天后用采血袋采集外周血20mL，进行淋巴细胞的分离。取出上述分离的淋巴细胞，按照TaKaRa的RNA提取试剂盒提取羊驼PBMC细胞的RNA。淋巴细胞的RNA提取后立即用TaKaRa逆转录试剂盒进行逆转录cDNA，随后利用巢式PCR扩增VHH基因；将扩增的VHH基因插入pCANTAB-5E噬菌体展示载体中，电转化TG1感受态细胞。取电转后的培养菌液，利用LB/AmpGLU培养基进行倍比稀释(10倍稀释)，再取10

(3)针对P24抗原纳米抗体的筛选

首先，进行辅助噬菌体的制备、浓缩以及噬菌体文库救援。辅助噬菌体的制备、浓缩过程：将噬菌体文库的菌体混匀后将数目约为10^9个细菌转移到100mL预先加入氨苄抗生素的2x YT培养液中，37℃220rpm培养直至OD600nm达到0.5。按照辅助噬菌体：细菌细胞数目为20:1的比例加入辅助噬菌体后继续37℃培养30分钟。加入终浓度为50ug/ml的卡那霉素，30℃过夜摇床培养。将过夜培养的细菌4℃13000rpm离心5分钟，将上清转移到新的离心管后加入1/4体积预冷的5X PEG8000/NaCl，在冰上孵育30分钟。4℃13000rpm离心10分钟去除上清后加入1mL PBS缓冲液溶解沉淀。再次加入250ul 5X PEG8000/NaCl后冰上孵育10分钟，4℃16000g离心15分钟后去除上清并将沉淀溶解在1mL PBS中得到噬菌体文库。

纳米抗体噬菌体文库的淘选步骤如下：①抗原包被：用PBS将P24抗原蛋白稀释后，每孔20μg(后续两轮淘选的抗原包被量分别为10μg/孔、5μg/孔)包被于96孔酶标板中，4℃过夜包被；②洗涤：过夜包被后弃去孔中的液体，每孔用200μL PBST洗涤5次；③封闭：每孔加入200μL 5％脱脂奶粉，放置于37℃封闭1h；④洗涤：弃去孔内液体，每孔用200μL PBST洗涤3次；⑤重组噬菌体的孵育：用5％脱脂奶粉稀释重组噬菌体到5×10

(4)特异性重组噬菌体富集情况的检测

抗原包被：用PBS将P24抗原蛋白稀释后，每孔400ng包被于96孔酶标板中，4℃过夜包被。洗涤：过夜包被后弃去孔中的液体，每孔用200μLPBST洗涤三次。封闭：每孔加入200μL5％脱脂奶粉，放置于37℃封闭1h。洗涤：弃去孔内液体，每孔用200μL PBST洗涤三次。重组噬菌体的孵育：稀释噬菌体浓缩液(1:10)，每孔加入100μL，37℃孵育1h。洗涤：弃去孔内液体，每孔用200μL PBST洗涤三次。二抗：HRP标记的鼠抗M13二抗1:4000稀释，100μL/孔，37℃孵育1h。洗涤：弃去孔内液体，每孔用200μL PBST洗涤三次。显色：每孔加入TMB显色液100μL，室温避光放置1015min。终止并读数：显色后每孔加入2M H

(5)特异性纳米抗体的测序分析

通过ELISA检测结果，将大于阴性值3倍以上的克隆确定为的阳性，并送菌液测序、比对分析，最终归类得到4条P24抗原纳米抗体序列。

(6)P24特异性纳米抗体的表达、纯化及与抗原的反应性

基于pcDNA3.1真核表达载体构建Nanobody-mFc融合蛋白表达平台，并分别将P24特异性纳米抗体序列克隆到pcDNA3.1-mFc载体上。将构建的表达载体利用HEK293F真核蛋白表达系统表达及纯化。

SDS-PAGE结果显示，亲和层析纯化后获得了较高纯度的Nanobody-mFc融合蛋白，条带大小均在55kDa左右(图1)。

为鉴定重组纳米抗体-mFc融合蛋白与抗原的反应性，提前将200ng/well的P24抗原蛋白包被于酶标板，4℃过夜后封闭板子，并加入不同量的重组纳米抗体(稀释量：10

表2

同时，购买了其他公司的P24抗原，包括宁波迈跃生物科技有限公司的HIV P24抗原，货号：PC010501；苏州近岸蛋白质科技股份有限公司的HIV P24抗原，货号:P12493，以本发明获得的结合力高的纳米抗体3G4-mFc对以上外购的HIV P24抗原的结合能力进行测试，将所用抗原用包被稀释液稀释到3ug/ml，每孔各加入配好的包被液100μl，纳米抗体3G4-mFc的ELISA检测数据见表3。

表3

纳米抗体3G4-mFc对其他两个公司购买的P24抗原都有很好的结合活性，将其命名为Anti-P24-VHH-1抗体，该纳米抗体Anti-P24-VHH-1可用于免疫印迹、免疫荧光等免疫学检测。

四、羊驼纳米抗体Anti-P24-VHH-1重链V区(VHH)序列分析。

设计扩增重链V区(VHH)基因的引物。

取Anti-P24-VHH-1的TG1的菌，PCR扩增后，送公司测序，然后分析VHH基因序列。

所得序列如下：

重链的可变区序列：

核苷酸序列：

GTGCAGCTCGTGGAGTCAGGGGGAGGCTTGGTGCAGGCTGGGGGGTCTCTGAGACTCTCCTGTGTAGCTCCTGGAAACACCTTCAGTCAGGCTACCATTGGTTGGTACCGCCAGGCTCCAGGGAAGCAGCGCGAAGTGGTCGCAGTTGTTAGTATCAGTGGTAGTACAGTCTATAACGACCCCGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACACGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAAACCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTAAAGTCCCCGGGATCCCTTGGGGCCAGGGGACCCAGGTCACCGTCTCCTCA(SEQ ID NO.5)。

氨基酸序列：

VQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVAPGNTFSQATIGWYRQAPGKQREV VAVVSISGSTVYNDPVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCK VPGIPWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO.4)。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。