一种猪源单克隆抗体、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及猪流行性腹泻（PED）的防控，特别是指一种猪源单克隆抗体、试剂盒及其应用。

背景技术

猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea, PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)引起的以呕吐、腹泻、脱水为主要特征的急性高度传染性猪肠道疾病。该病原可感染不同日龄的猪只，其中以7日龄内的哺乳仔猪最易感，病死率高达100%，是目前影响养猪业健康发展的重要疫病之一。PEDV极易发生变异，商品化弱毒疫苗的使用更是导致了流行毒与疫苗毒重组现象的发生，极大地增加了该病的防控难度。N蛋白是PEDV的结构蛋白之一，它除了参与病毒粒子的构成，还能够调控病毒的复制和翻译等，受到越来越多的关注。公开号为CN114790238A的专利提供了一种猪源性抗猪流行性腹泻病毒N蛋白的真核表达单链抗体，该单抗是通过在猪IPEC-J2细胞中表达的单链抗体，而单链抗体的稳定性弱，因此稳定性高的完整抗体具有更优的应用前景。

目前诱导保护性免疫应答的PEDV抗原结构仍然不甚清楚，因此非常有必要研制PEDV不同结构蛋白的单克隆抗体，解析PEDV的抗原结构，发现诱导中和抗体甚至广谱中和抗体应答的抗原表位，为PEDV防控产品的研发提供理论依据。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提出一种猪源单克隆抗体、试剂盒及其应用。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种猪源单克隆抗体，包括重链可变区和轻链可变区，二者之间由二硫键结合，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

上述猪源单克隆抗体可识别PEDV N蛋白的线性表位。

为了获得上述猪源单克隆抗体，本申请采用以下方案：

1、PEDV抗原纯化、标记与鉴定

用T175细胞瓶对本实验室保存的PEDV-HN2021毒株进行大量增殖，共计500 mL，去除细胞碎片后，利用蔗糖密度梯度离心法进行纯化，收集纯化后的病毒粒子进行乙酸铀负染，成功在透射电镜下观察到纯度较高的直径为100 nm左右的病毒粒子；将PEDV S1基因中和表位区S1D和 PEDV N基因，分别插入到pET-28a原核表达载体中，构建原核表达质粒pET28a-PEDV-S1D，和pET28a-PEDV-N，转化至BL21细胞进行表达，通过SDS-PAGE和Westernblot证实目的蛋白成功表达，并用镍离子亲和层析成功纯化重组蛋白。将上述纯化后的PEDV病毒粒子、PEDV S1D蛋白、PEDV N蛋白用生物素进行标记，Western blot鉴定生物素标记成功。

2、PEDV特异性B细胞的分选与猪源抗体序列的测定

利用PEDV病毒液与PEDV弱毒疫苗对试验猪进行免疫，每隔21 d免疫一次，共免疫5次，期间通过间接ELISA、病毒中和试验监测试验猪抗体应答水平。在免疫周期内，PEDV S1D蛋白ELISA血清结合效价最高可达1:6400，PEDV N蛋白ELISA血清结合效价最高可达1:12800，血清中和效价最高为1：2238。在5免后第5 d选择体液免疫应答水平较高的猪，采集静脉血，分离外周血单核细胞（Peripheralblood mononuclear cells, PBMCs），分别以生物素标记后的PEDV病毒粒子，PEDV N蛋白作为诱饵抗原，通过流式细胞术分选了36个PEDV+/IgG+，24个PEDV N+/IgG+特异性单个B细胞。利用单细胞PCR技术，从单个 B 细胞中扩增猪IgG的重链与轻链可变区基因并进行测序，最终获得了21对配对的轻重链可变区基因序列。

3、全猪源抗体的表达与鉴定

将21对抗体重链可变区基因和轻链可变区基因插入到含有猪源抗体恒定区基因的pcDNA3.4载体中，委托金唯智生物科技有限公司构建抗体表达质粒。将重链、轻链表达质粒共转染至HEK 293F细胞中进行抗体表达与纯化，通过间接 ELISA、间接免疫荧光试验（IFA）、Western blot 验证抗体的反应性，通过病毒中和试验验证抗体的中和活性。最终成功表达21株抗体，并成功筛选出了19株PEDV特异性单克隆抗体。上述抗体均为N蛋白单克隆抗体，并没有筛选到中和抗体。

4、通过Western blot试验发现有3株抗体识别PEDV N蛋白的线性表位，其他抗体可能识别N蛋白的构象表位。再进一步根据Western blot试验的结果，结合反应条带深浅，筛选反应条带较深，反应性较好的一株作为N蛋白单克隆抗体。

本申请还请求保护编码上述的猪源单克隆抗体的重组质粒。

上述重组质粒中含有编码重链可变区的基因序列、编码轻链可变区的基因序列。

上述编码重链可变区的基因序列如SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示、编码轻链可变区的基因序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示。

本申请还请求保护上述猪源单克隆抗体在制备特异性识别PEDV病毒的诊断试剂中的应用。

上述的猪源单克隆抗体在制备特异性诊断猪流行性腹泻的医疗器械中的应用

基于上述的猪源单克隆抗体制备的诊断试剂。

基于上述的猪源单克隆抗体制备的试剂盒。

基于上述的猪源单克隆抗体制备的医疗器械。

本发明具有以下有益效果：

1、本申请利用单个B细胞抗体技术筛选出了19株特异性单克隆抗体，均识别PEDVN蛋白，说明N蛋白具有很强的免疫优势性。19株N蛋白特异性抗体中有3株识别的是N蛋白的线性表位，其余抗体可能识别的是N蛋白的构象表位。同时建立了筛选制备PEDV特异性抗体的平台，为后续筛选PEDV中和抗体积累了经验，为PEDV诊断试剂盒的研发提供了抗体工具。

2、单个B细胞抗体技术原理是当机体接种疫苗或受到外源病原体刺激后，机体内就会产生大量的针对其特定抗原的抗体分泌细胞，通过B细胞表面标志分子或者生物素标记的抗原对 B 细胞进行标记，再利用流式细胞仪分离单个浆细胞或者抗原特异性记忆B淋巴细胞，扩增抗体基因片段，构建抗体基因的表达载体，最终筛选获得具有抗原特异性的抗体。该技术相较于传统的抗体制备技术保证了抗体基因的天然源性，具有筛选周期短，免疫排斥反应弱，结合活力强等优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为全病毒蔗糖密度梯度纯化结果，其中A为 SDS-PAGE结果，B为Western blot结果。

图2为纯化的PEDV毒株的透射电镜图像，其中A为高密度PEDV颗粒，B为单一PEDV颗粒。

图3为PEDV N蛋白表达及纯化结果，其中A为 SDS-PAGE结果，B为Western blot结果。

图4为抗原生物素标记检测结果，其中A为PEDV全病毒抗原检测结果，B为N蛋白检测结果。

图5为PEDV抗体水平监测结果。

图6为PEDV中和抗体水平监测结果。

图7为单个B细胞流式分选结果，其中A为靶标病毒粒子的单个B细胞分选结果，B为靶标N蛋白的单个B细胞分选结果。

图8为抗体可变区基因 PCR扩增结果，其中A为 H链可变区基因扩增结果，B为λ链可变区基因扩增结果，C为. κ链可变区基因扩增结果。

图9为抗体可变区氨基酸序列比对结果，其中A为VH链分析结果，B为Vλ链分析结果，C为 Vκ链分析结果。

图10为抗体纯化结果，其中A为还原性SDS鉴定结果，B为非还原性SDS鉴定结果。

图11为ELISA检测抗体结合活性结果，其中A为抗体对PEDV病毒粒子的结合活性，B为抗体对PEDV N蛋白的结合活性，C为抗体对PEDV S1D蛋白的结合活性。

图12 为IFA检测抗体的反应活性结果。

图13为Western blot鉴定抗体的反应性结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：PEDV抗原纯化、标记与鉴定

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞和毒株

Vero E6细胞由本实验室保存；PEDV-HN2021株由本实验室分离并保存。

1.1.2主要试剂

胎牛血清（FBS）（购于ExCell Bio公司）；DMEM (Dulbecco's Modified EagleMedium)高糖培养基、胰蛋白酶（购于Gibco公司）﹔青霉素链霉素混合液(Penicillin-Streptomycin Solution)(购于SOLARBIO公司）﹔蔗糖（购于sigma公司)﹔聚乙二醇(PEG8000)(购于Solarbio公司)；链霉亲和素（HRP标记）、生物素（EZ-Link TM Sulfo-NHS-LC-Biotin）均购自美国Thermo公司；150 kDa、250 kDa预染蛋白Marker购自雅酶生物技术有限公司；ECL发光液购于PerkinElmer公司；镍填料购于金斯瑞公司。

1.1.3 主要仪器

大容量高速低温离心机、小型台式低温离心机、超速离心机、二氧化碳细胞培养箱（购于Thermo公司)﹔生物安全柜（购于AIRTECH公司）﹔凝胶成像系统、酶标仪（购于BIO-RAD公司)﹔透射电镜（购于HITACHI 公司)﹔显微镜（购于SDP TOP公司)﹔蛋白质凝胶电泳槽系统、紫外分光光度计（购于Invitrogen公司）。

1.2 方法

1.2.1 PEDV全病毒抗原的纯化

(1) PEDV病毒液的制备

用含有I0% FBS、1%青霉素链霉素的DMEM高糖细胞培养基将Vero E6细胞置于37℃，5% CO2条件下的细胞培养箱中培养。待细胞生长密度达到70%-80%时，弃去培养液，用无菌PBS清洗3次后，按照1：100的比例接种PEDV-HN2021毒株。待病毒吸附1 h后，弃去病毒液，用不含血清，含有1%青霉素链霉素的DMEM高糖细胞培养基维持细胞状态，接毒后观察细胞病变效应（CPE），当细胞出现明显病变时（出现合胞体，细胞脱落），收取细胞和上清培养液于-80℃冰箱反复冻融3次，最终得到500 mL PEDV病毒液；

（2）沉淀病毒

将500 mL病毒液8000 r/min离心30 min去除细胞碎片，将上清置于超速离心管中30000r/min离心3 h，弃去上清，用纸巾擦去离心管侧壁残留液体，用无菌PBS重悬病毒沉淀，4℃静置过夜；

（3）过30%蔗糖垫

在超速离心管中加入30%的蔗糖，之后在蔗糖液面上缓慢加入病毒悬液，30000 r/min超速离心3 h，弃去上清，擦去管壁残留液体，用无菌PBS重悬病毒沉淀；

（4）蔗糖密度梯度的制备

在超速离心管中依次加入60%、40%、30%、20%的蔗糖溶液各2 mL，可以看到明显分层现象，4℃静置过夜；

（5）蔗糖密度梯度低温超速离心

将PBS重悬后的病毒悬液缓慢加入提前制备好的蔗糖密度梯度中，30000 r/min超速离心3 h，离心结束后，超速离心管从上到下500 μL取样并标记，直至取完；

（6）病毒粒子所在层级检测

上述各组分各取15 μL，加入5×SDS 蛋白上样Buffer 5 μL，混匀后100℃金属浴加热10 min。将12%的预制蛋白胶安装在蛋白电泳槽，加入1×MOPS电泳液，120 V恒压进行电泳，电泳结束后，一组蛋白胶进行考马斯亮蓝染色，染色1 h后进行脱色，脱色过夜后观察结果；另一组蛋白胶采用湿转方法将蛋白转印至0.45 μm PVDF膜上，200 mA转印2 h，用5%的脱脂奶封闭2 h后，用PEDV猪阳性血清（1：500稀释）为一抗4℃过夜孵育，二抗用山羊抗猪HRP（1：5000稀释）室温孵育1.5 h，用1×TBST溶液清洗3次，每次10 min。按照1:1的比例加入ECL化学发光剂的A液、B液于离心管中，上下颠倒混匀后，浸泡PVDF膜，蛋白曝光仪进行成像。部分结果如图1所示，图1A为SDS-PAGE结果，图1-1B为Western blot结果。可以清晰的在58 kDa左右的位置看到条带，此条带为PEDV N蛋白的条带，PEDV其他病毒蛋白条带没有显现，可能是由于其他病毒蛋白数量太少。

（7）病毒粒子的置换

经SDS-PAGE和Western blot检测后，将病毒粒子所在的组分放入到透析袋中，置于含有100倍透析袋体积的PBS中，4℃进行透析，每隔4 h换一次PBS，共换4次。透析结束后将透析袋置于50%的PEG8000液体中进行浓缩。浓缩结束后，吸出至DNase/RNasefree的EP管中备用。

（8）透射电镜观察

取出载膜铜网放于紫外灯下照射2 h进行处理，将浓缩后的病毒粒子液体吸出4 μL轻轻滴在铜网正面(覆盖全部铜网)，静置2 min后用吸水纸轻轻擦去多余液体，干燥后·，将负染液（2%的双氧乙酸铀）滴3滴于事先准备好的封口膜上，采用三穿法对铜网进行染色:将铜网正面置于染料中来回穿梭，共计40 s。染色结束后用吸水纸吸去多余染料，在通风橱中干燥30 min后进行电镜观察。结果如图2所示，在2.5万倍电镜视野下，可以清晰的观察到具有完整形态的PEDV病毒粒子，病毒粒子的形状呈球形，直径大约为100 nm左右，大小不一。大多数的病毒粒子直径约在120 nm，也有少数病毒粒子大小在95 nm左右。可见病毒囊膜和少量刺突（大多数刺突可能由于操作过程中反复冻融而脱落），没有观察到其他病毒颗粒。

1.2.2 pET28a-PEDV-N蛋白的原核表达及纯化

（1）质粒构建

利用SnapGene 软件将PEDV-HN2021毒株的N蛋白基因序列通过BamHI和Xho I两个酶切位点插入到 pET-28a的质粒图谱上，后面带有6个组氨酸标签，便于后续的蛋白纯化。经密码子优化后交于金唯智公司进行质粒合成。

（2）重组质粒pET28a-PEDV-N的诱导表达

将合成的pET28a-PEDV-N重组质粒转入大肠杆菌中进行原核表达，具体操作如下：

1、取30 μL BL21 (DE3）感受态加入EP管中，后加入1 μL重组质粒pET28a-PEDV-N，轻轻吹打混匀，放置于冰上，静置30 min。

2、水浴锅中 42℃放置90 s，后置于冰上静置5 min，加入500 μL无抗生素的LB液体培养基，置于摇床中220 rpm、37℃培养1 h，5000 rpm室温离心5 min，移液枪移弃300 μL液体LB，将沉淀轻轻吹打混匀，取100 μL加入含有Kana抗性的平板LB培养基中，将菌液铺匀后倒置于37℃温箱培养过夜。

3、将卡那霉素以1:2000加入100 mLLB培养基中，吸取5 mL 至 20 mL摇菌管中，从温箱中取出平板，挑取单一圆滑菌种接种至20 mL摇菌管中，置于摇床中37℃、220 rpm培养14~16 h。

4、在500 mL锥型瓶中加入100 mL液体LB培养基，高压灭菌后放至室温，将培养至浑浊的菌液按1:100比例加入到锥形瓶中，按1:2000加入50 μL卡那霉素，置于摇床中 37℃、220 rpm培养约4 h，用分光光度计测得菌液OD 600 nm值为0.6~0.8左右，按照右每100mL 菌液加入100 μL 1 mmol/L的IPTG诱导剂，置于37℃、220 rpm温箱培养6 h。

5、将经IPTG诱导过后的菌液置于50 mL离心管中，8000 rpm/min，离心10 min，弃掉上清，保留菌体沉淀。

6、洗涤菌体，加入5 mL PBS至离心管中，利用涡旋振荡器使菌体沉淀重新悬浮，再次置于离心机中离心8000 rpm，离心5 min，重复3次，弃上清，保留菌体沉淀。

7、超声破碎细胞，加入10 mL PBS重悬菌体，之后放至冰上进行超声破碎，超声破碎仪功率为150 W、超声开时间为3.0 S，超声关时间为5.0 s，总工作时间为30 min左右，以菌液无絮状物，菌体变澄清，沉淀无焦状物为益。

8、超声破碎完成后，置于离心机4℃，12000 rpm离心10 min，将上清液移至50 mL离心管中，4℃保存。

9、清洗包涵体，将包涵体用5 mL PBS重新悬浮，12000 rpm离心10 min，移液器吸弃上清，沉淀用PBS重悬，重复3次，弃上清后-40℃冻存。

（3）表达产物的可溶性分析

1、制备样品：将超声破碎细胞后的包涵体用PBS重悬，分别将重悬后的包涵体以及超声破碎后的上清各取20 μL作为SDS-PAGE样品。

2、处理样品：将样品加入5 μL 4×还原性 Buffer，混匀后100℃金属浴加热10min。

3、上样与电泳：将12%的预制蛋白胶安装在蛋白电泳槽，加入1×MOPS电泳液，每孔加入20 μL煮沸好的样品，120 V恒压电泳2 h。

4、染色：电泳结束后，将多余的胶切去，加入考马斯亮蓝染色，室温摇床染色1 h。

5、洗脱：染色完成后，回收考马斯亮蓝，用脱色液脱色2 h，后更换脱色液于摇床上进行过夜脱色。

6、观察结果:扫描仪观察结果。

（4）pET28a-PEDV-N蛋白的纯化及验证

重组蛋白中带有His标签的包涵体蛋白，His标签能结合二价镍离子，所以选用Ni柱纯化重组蛋白，咪唑能与蛋白竞争性结合层析填料中的镍离子，在洗脱缓冲液中加入咪唑来进行蛋白纯化，具体操作如下：

1、在AKTA机器上，用5倍柱体积的ddH20、蛋白结合Buffer平衡镍柱。流速调整至1mL/min，将蛋白用品用0.45 μm孔径滤器去除杂质后开始上样。

2、UV曲线开始下降时，停止接取流传液，流速调为4 mL/min，用10倍柱体积的蛋白结合Buffer冲洗镍柱，以洗脱杂蛋白。

3、用250 mM咪唑的蛋白洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，用15 mL离心管接取洗脱蛋白。

4、取45 μL 纯化后的蛋白，加入15 μL 4×还原性 Buffer，混匀后100℃金属浴加热10 min。将12%的预制蛋白胶安装在蛋白电泳槽，加入1×MOPS电泳液，每孔加10 μL煮沸好的样品，80 V恒压电泳30 min，之后调整电压至120 V电泳1.5 h。将电泳后的蛋白胶分为两组，一组用于考马斯亮蓝染色，脱色后观察结果；一组用于Western blot验证，一抗采用抗His-HRP荧光抗体，孵育2 h进行曝光。结果如图3所示，其中图3A为SDS-PAGE结果，图3B为Western blot结果。可以清晰的在58 kDa左右的位置看到N蛋白目的条带，表明成功表达并纯化出PEDVN蛋白。

（5）pET28a-PEDV-N蛋白的置换

由于洗脱后的蛋白溶液中含有咪唑，对后续的试验有影响，需要去除蛋白溶液中的咪唑，所以采用透析的方法将蛋白置换到PBS缓冲液中，具体操作如下：将透析袋浸泡于去离子中并清洗，之后将蛋白溶液装入到透析袋中并置于100倍透析袋体积的PBS中，加入磁力转4℃进行透析，每隔4 h进行换液，共计换液4次，后用50%的PEG8000对其进行浓缩，-80℃保存备用。

1.2.3 PEDV病毒粒子、N蛋白的生物素标记及鉴定

吸取180 μL无酶水（DNase/RNase free water ）加入到1mg长链生物素中，溶解长链生物素使其终浓度为至10 mM。用PBS将PEDV病毒粒子、N蛋白稀释至1 mg/ mL，各取1 mL分别加入50 μL生物素，置于冰上标记4-6 h。标记结束后采用透析的方法去除游离的生物素，最后用50%的PEG8000对其进行浓缩。按照1:1的比例加入50%的甘油（已高压），分装后冻存于-80℃进行备用。Western blot检测其是否标记成功，具体操作如下：

（1）生物素标记的抗原与未标记的抗原，各取15 μL，分别加入5 μL 4xSDS蛋白上样Buffer。l00℃加热10 min；

（2）12%的聚丙烯酰胺凝胶安装在蛋白电泳槽中，每孔上样20 μL，80 V电泳30 min后调整电压至120 V电泳1.5 h；

（3）电泳结束后，湿转法转至甲醇处理后的PVDF膜上，200 mA恒流转膜2 h；

（4）转膜结束后，用5%的脱脂奶粉（TBST 配制），室温条件下封闭2 h；

（5）TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min，后加入HRP标记的链酶亲和素抗体（1:40000用配制的5%脱脂奶粉稀释），室温条件下，置于摇床上孵育1.5 h；

（6）TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 min，加入ECL化学发光底物，进行曝光成像。

结果如图4所示，PEDV病毒粒子，PEDV N蛋白，PEDV S1D蛋白都在相应的位置出现目的条带，而未标记的对照样品则无条带，证明生物素成功标记。

猪流行性腹泻是由PEDV引起的猪肠道传染病，是危害养猪业发展的重大疾病之一,其对仔猪的威胁最大，一周龄内的仔猪感染后致死率高达100%。N蛋白主要与病毒的RNA结合，形成螺旋核衣壳结构，参与病毒的复制和转录，从而调控宿主细胞周期，此外，N蛋白高度保守，常用来作为PEDV检测的重要靶标抗原。

在本试验中，我们首先纯化出了完整的PEDV病毒粒子，PEDV的纯化主要包括两个步骤：浓缩和提纯。通过超速离心法将PEDV病毒液浓缩在一起，然后将浓缩后的病毒液置于20%、30%、40%、60%的蔗糖梯度上，通过超速离心获得高纯度的病毒粒子，在透射电镜下观察到了其完整形态，直径在100nm左右，并无其他病毒粒子出现。其次，为了筛选出蛋白特异性单克隆抗体，我们利用大肠杆菌表达系统表达出了PEDV N蛋白，主要为可溶性表达。因为重组蛋白的C端带有组氨酸标签，我们利用组氨酸标签与镍离子的螯合作用，成功得到了高纯度的目的蛋白。最后，为了后续试验中筛选抗原特异性单个B细胞，我们利用生物素对上述纯化的抗原进行标记并利用透析的方法去除未结合的游离生物素，通过Western blot试验验证其成功标记。

综上所述，本试验利用蔗糖密度梯度离心法成功纯化出了PEDV病毒粒子，同时利用大肠杆菌原核表达并纯化出了PEDV N蛋白，利用生物素成功对上述抗原进行了标记，为后续通过流式细胞术筛选出PEDV特异性单个B淋巴细胞提供了生物材料，同时也为PEDV诊断试剂盒和亚单位疫苗的研发提供了新思路。

实施例2：PEDV特异性B细胞的分选与猪源抗体序列的测定

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物

4头28日龄左右的健康长白仔猪购于附近养殖场，饲养在密闭环境下的普通动物房中。本研究中所涉及的动物试验，均经过中国农业科学院兰州兽医研究所动物伦理委员会批准，按照国家有关动物伦理规程和准则进行。

1.1.2 主要试剂

PEDV/TGEV二联灭活苗、弱毒苗购于中牧实业股份有限公司；淋巴细胞分离液（density : 1.077 g/ mL)）购于西格玛公司；BSA购于西格玛公司；抗猪IgGFITC标记的荧光抗体购于AbD 公司；抗生物素APC标记的荧光抗体购于Miltenyi Biotec公司；96孔PCR板购于BRAND公司；反转录混合液购于Invitrogen 公司； PCR扩增试剂盒购于Vazyme公司；单个细胞裂解试剂盒购于Ambion公司)；鞘液购于BD公司。

1.1.3主要仪器设备

FACS AriaⅡ流式细胞仪购自美国BD公司；PCR仪购于杭州博日科技有限公司；96孔板离心机购于Eppendorf 公司。

1.2 方法

1.2.1 1.2 方法

1.2.1 动物免疫

4头长白猪标号分别为1、2、3、4，采用PEDV-HN2021株、PEDV二联灭活苗、弱毒苗，多次对试验猪只进行免疫，以期诱导产生高水平的中和抗体，具体免疫程序见下表。

表1 试验动物免疫程序

1.2.2静脉采血

猪免疫前和免疫后每两周进行前腔静脉采血，加入到不含抗凝剂的真空采血管中，37℃温箱放置2 h，之后置于4℃过夜，3000 r/min离心20 min分离血清，分装后-20℃冻存备用。

1.2.3 ELISA检测血清抗体水平

(1）将纯化后PEDV N蛋白用抗原包被液稀释至1 μg/mL，每孔100 μL加入到96孔酶标板中，封板膜封板，4℃孵育过夜，洗液洗3次，吸水纸上拍干。

(2）每孔加入150 μL封闭液，封板膜封板，4℃孵育过夜，弃去封闭液，吸水纸上拍干，在25℃、湿度10%条件下干燥4 h，备用。

(3）用血清稀释液将待测血清1：200稀释后，吸取200 μL分别加入到第一列孔中，进行2倍梯度稀释，同时设置阴性血清对照，封板膜封板，37℃孵育1 h，PBST洗5次，吸水纸上拍干。

(4) 每孔加入100 μL用血清稀释液稀释的HRP标记的兔抗猪IgG抗体( 1∶10000稀释)，封板膜封板，37℃孵育30 min，PBST洗5次，吸水纸上拍干。

(5) 显色:每孔加入底物TMB 100 μL，37 °C孵育10 min。

(6）终止与读数:每孔加入100 μL终止液，酶标仪上读取OD450nm数值。

(7）分析数据，当阴性对照 OD450 nm≤0.2时试验成立，S/N（待检样品OD450nm/阴性样品OD450 nm)≥2.1判为阳性，S/N<2.1判为阴性，阳性孔对应的最高稀释度即判定为血清的抗体效价。试验结果如图5所示，结果显示在免疫周期内，PEDV N蛋白ELISA血清结合效价最高可达1:12800。

1.2.4病毒中和试验检测血清中和抗体水平

在试验开始前，首先将待检血清置于金属浴上，56℃ 30 min进行灭活。用PEDV-HN2021株进行病毒中和试验。具体操作如下:

(1)50 μL待检血清加在96孔细胞培养板上，用1 %青霉素和链霉素的DMEM接毒液进行倍比稀释，每个稀释度2个重复孔，每孔50 μL。

(2)病毒的稀释

用接毒液将病毒原液稀释至100TCID50/50 μL。

(3)对照组设置

病毒对照:病毒液稀释至100TCID50/50 μL、10TCID50/50μL、1TCID50/50 μL、0.1TCID50/50 μL，每个稀释度设置3个重复孔，每孔50 μL。

阴性对照:每孔加入50 μL接毒液，设置两个重复孔。

(4)中和反应

稀释至100 TCID50/50 μL的病毒液，每孔50 μL加入到血清稀释孔中以及病毒对照孔中。37℃，5%CO2细胞培养箱中静置l h。

(5)接种细胞

将上述病毒抗体混合液接种到事先铺好的Vero E6细胞上（细胞密度为80%），接种2 h后，弃去孔内液体，加入100 μL DMEM接毒液，放置37℃，5%CO2细胞培养箱中进行培养。

(6)结果判定

72 h后在显微镜下进行初步鉴定，96 h后进行最终结果的判定。根据细胞病变效应(CPE)来判定结果，各反应孔50%以上的细胞产生细胞病变时，视为阳性孔。结果如图6所示。四头猪在经过毒株和疫苗连续加强免疫后，血清中和抗体水平总体呈上升趋势，其中4号猪在第四次免疫后血清中和抗体达到最高水平，达到1：2238，在第五次免疫后中和抗体效价有所下降。在免疫周期内，1，2，3号猪抗体水平持续上升，结果表明试验猪只在经过多轮加强免疫后。均可产生较高水平的中和抗体。

1.2.5分离外周血单个核细胞

（1）5免后7 d采集20 mL体液免疫应答水平较高的猪的前腔静脉血，加入到EDTA抗凝管中，使用等体积的PBS（商品化）稀释血液。

（2）前一晚在15 mL离心管中加入7 mL淋巴细胞分离液(SIGMA)，采血前将淋巴细胞分离液转移至室温，避光回温；第一步稀释好的抗凝血沿着管壁小心加入淋巴细胞分离液液面，离心管倾斜45°，使用水平转子在常温状态下1000 g离心30min（离心机设置为升6降1）。

（3）离心结束后会出现明显分层，从上到下依次为血浆层、细胞层、分离液层、红细胞层，小心吸弃最上层血浆层（距离白色雾状层约0.5 cm即停止），将白色雾状细胞层转移至新的已提前预加5 mL细胞分选液的15 mL离心管中，用分选液补至15 mL，水平转子4℃，600 g离心10 min。

（4）弃去上清，加入2 mL红细胞裂解液（自配）重悬细胞，裂解3 min，补加细胞分选液至15 mL，终止裂解。

（5）水平转子300 g离心10 min，弃上清，加入细胞分选液洗涤一次，水平转子4℃，400 g离心5 min。

（6）弃上清，加入2 mL细胞分选液进行重悬，随后进行细胞计数。

1.2.6流式分选单个B细胞

(1) 将重悬后的细胞分装到5个流式管中，每管300 μL（约107个PBMCs），取生物素标记过的PEDV病毒粒子、PEDV S1D蛋白、PEDV N蛋白各2 μL加入其中，置于冰上反应30min，同时设置FMO对照（不加抗原，加二抗）以及阴性对照（不加抗原，不加二抗）。

(2) 冰浴结束后，添加细胞分选液，轻弹管壁，使细胞重悬，洗涤细胞2次，400 g 4℃水平离心5 min。

(3) 加入300 μL1640培养基重悬细胞，分别加入鼠抗猪IgG FITC (1 μL)，抗生物素APC ( 2 μL)，冰浴25 min。

(4) 重复步骤(2)，洗涤细胞。

(5)吸取400 μL细胞分选液添加到管内，重悬细胞，锡纸包裹管壁进行避光，置于冰上，准备分选细胞。

(6)使用BD FACSAria ⅡI流式分选仪分选PEDV特异性单个B细胞。仪器参数设置为，喷嘴大小:85微米；分选模式:单细胞模式；分选速度:8000细胞/秒；振幅: 20 psi；震荡频率； 30 kHz。以上参数设置调节后关闭Sweat按钮，使用Accudrop、延迟微球执行液体延迟时间。96孔 PCR板中每孔加入10 μL单细胞裂解液，调整分选仓中96孔PCR板的位置，仪器调整完毕后，准备上样，先圈定淋巴细胞和单核细胞群，并依据（FSC-A)和FSC-H数值去除死细胞和粘连细胞，随后圈出IgG+细胞群，在IgG+细胞群中圈出Ag＋特异性细胞群，最后分选出PEDV特异性单个B细胞。分选结果如图7所示，图7A为PEDV病毒粒子特异性B细胞分选结果，图7B为PEDV N蛋白子特异性B细胞分选结果。本次分选，我们记录了100万个PBMCs进行分析，首先根据细胞分群情况，我们圈出来了P1细胞群（淋巴细胞），其次在P1细胞群中圈出了IgG+细胞群P2，约占淋巴细胞数量的4%，最后在P2细胞群中圈出了APC阳性细胞群，其中PEDV病毒粒子特异性B细胞含量数量为1727个，PEDV N蛋白特异性B细胞含量数量为122个，选择单细胞分选模式，分选出了36个PEDV病毒粒子特异性B细胞，24个PEDV N蛋白特异性B细胞。

1.2.7 cDNA制备及巢氏PCR扩增

(1) 分选完成后，吸取1 μL终止液至孔中，室温放置5 min，根据SuperscriptVILomix说明书，加入反转录体系，设置反转录PCR程序为25℃ 10 min，42℃ 120 min，85℃ 5min，将制得的 cDNA在-80℃条件下保存。

(2) 哺乳动物的抗体由重链和轻链构成，肽链之间以二硫键链接，轻链又分为λ(Lambda链）和κ (Kappa链）两种，使用表2所示引物对VH和VL基因进行扩增。

表2猪IgG重链、轻链可变区扩增引物序列

(3）利用巢式PCR方法进行两轮PCR扩增，第一轮以cDNA分子为扩增模板，重链可变区引物使用IgG-H-out-F/R；Lambda链可变区引物使用IgG-L-L-V3-out-F/R、IgG-L-L-V2-6-out-F/R、IgG-L-L-V8-out-F/R；Kappa链可变区引物使用IgG-L-K-V1-out-F/R，反应体系见表3。

表3第一轮PCR扩增反应体系

第一轮PCR扩增程序为：

VH: 95℃ 5 min，95℃ 30 s，56℃ 50 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 10 min

Vλ: 95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 50 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 10 min

Vκ: 95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 50 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 10 min

第二轮PCR以第一轮PCR扩增产物为扩增模板，重链可变区引物使用IgG-H-in-F/R；Lambda链可变区引物使用IgG-L-L-V2-6-in-F/R、IgG-L-L-V3-in-F/R、IgG-L-L-V8-in-F/R；

Kappa链可变区引物使用IgG-L-K-V1-in-F/R，反应体系见表4。

表4第二轮PCR扩增反应体系

第二轮PCR扩增程序为：95℃ 5 min，95℃ 30 s，60℃ 50 s，72℃ 60 s，39个循环；72℃ 10 min。

PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，取10 μL PCR产物和1 μL10×Loadingbuffer，配置1%的琼脂凝胶，随后进行凝胶电泳，将扩增成功的VH和VL样本剩余的扩增产物送华大基因公司测序，结果使用DNASTAR软件分析、比对。PCR扩增结果如图8所示，重链及轻链可变区基因目的条带在500bp左右，在60个单个B细胞中，共扩增出22个重链可变区基因，扩增阳性率为37%，共扩增出33个轻链可变区基因，扩增阳性率为55%，重链轻链配对成功21对，配对成功率为35%。抗体可变区氨基酸对比分析结果如图9所示，图A是VH链比对分析结果，图B为Vλ链比对分析结果，图C为Vκ链比对分析结果。

自Kohler等发现杂交瘤技术后，大量制备特异性单克隆抗体得以实现，此技术的问世是科研工作者的一大福音，越来越多的基础性研究和临床应用都以此为基础，极大的促进了抗体工程的发展。随着现代分子生物学的进步，如噬菌体展示技术、嵌合抗体技术、酵母展示技术和单个B细胞抗体技术等单克隆抗体制备方法相继问世，单个B细胞抗体技术作为一个新兴的制备方法备受关注，以其筛选周期短为，操作便利，筛选出的抗体特异性好等优点脱颖而出，逐渐成为现代试验室中制备单克隆抗体的热门。

机体的体液免疫是防御外来抗原侵入的重要免疫反应，它的主要执行者是B淋巴细胞，诸如病毒、蛋白、细菌等都能引起体液免疫，在体液免疫应答过程中，抗原特异性抗体起到了重要作用，其通过与抗原结合，激活补体反应，调整吞噬和ADCC，其中具有中和作用的抗体可以阻止病毒的吸附，使病毒丧失穿透细胞的能力。本试验利用PEDV活毒株以及PEDV疫苗对4头一月零左右的猪进行免疫，刺激其产生体液免疫应答，在免疫周期内，采集血清样本进行检测，结果表明免疫猪只均产生了较高的体液免疫应答，ELISA及中和试验结果显示试验猪只PEDV N蛋白ELISA血清结合效价最高可达1:12800，血清中和效价最高为1：2238。在体液免疫应答过程中，一般在加强免疫后5 d血液中B细胞含量达到峰值，因此我们选择抗体应答水平较高的4号猪，在第5次免疫后5 d采集其抗凝血，分离PBMCs，利用试验一制备出的生物素标记后的抗原为诱饵抗原对细胞进行染色，通过流式细胞术成功分选出36个PEDV病毒粒子特异性单个B细胞，24个PEDV N蛋白特异性B细胞。

分选出的单个B细胞经裂解后反转录为cDNA分子，通过巢氏PCR扩增其IgG重链、轻链可变区基因。哺乳动物的抗体是由两条相同的重链和轻链构成，它们通过形成“Y”字形结构来连接，其间通过二硫键结合。有研究表明抗体的轻链可以分为kappa链（κ链）和Lambda链（λ链）两种。不同动物种类中kappa链和Lambda链的比例并不一致，在猪的抗体轻链中，κ链和λ链的比例接近1:1，所以为了保证轻链可变区基因的扩增率，我们对κ链和λ链的可变区基因都进行了扩增，最后通过测序，成功得到了21对配对的抗体重链、轻链可变区基因，本研究为进一步解析猪抗体基因提供了参考。

实施例3：猪源抗体的表达与效果评价

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞、蛋白及毒株

HEK 293F细胞，Vero E6细胞，PEDV-HN2021毒株、纯化的PEDV S1D蛋白均由本试验室提供。

1.1.2 主要试剂与耗材

无内毒素大提质粒试剂盒购于TIGEN公司；PEI转染试剂购于索莱宝公司；SMM293-TⅡ Expression Medium、SMS-293-SUPI Expression Medium Supplement 购于义翘神州公司；D-PBS购于碧云d公司；悬浮细胞培养瓶购于广州杰特公司；镍填料购于天地人和公司；Trion-X-100、兔抗猪IgG FITC购于西格玛公司；ECL发光底物购于Invitrogen公司；兔抗猪IgGHRP购于金斯瑞公司。

1.1.3 主要仪器

荧光显微镜购于EVOS公司；酶标仪购于伯乐生命医学有限公司；Tanon 5200化学发光成像系统购于北京原平皓生物技术有限公司；悬浮细胞二氧化碳培养温箱购于上海知楚仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1抗体质粒合成及提取

在扩增出的IgG抗体VH基因前加入信号肽 “MEFRLNWVVLFALLQGVQGEEKLVESGG”，Lambda轻链基因序列的前端加入信号肽“MAWTVLLIGLLAVGSGVDSQTVIQE”进行基因优化；Kappa轻链基因前端加入信号肽“MRAPMHLLGLLLL”按照中国灰仓鼠的密码子进行基因优化后，后插入到含有猪源抗体重链恒定区的pcDNA3.4载体中；委托金唯智公司进行质粒制备。抗体质粒返回后，将抗体质粒甘油菌接入到5 mL A＋LB培养基中小量培养，12 h转接到100mL A＋LB培养基中进行大量培养，培养16 h后进行质粒提取，具体操作方法如下：

(1) 使用50 mL离心管收集菌液，8000 rpm室温离心3 min，弃上清。

(2) 使用P1溶液中加入RNase A，取P1溶液9 mL至含有菌体沉淀的离心管中，利用涡旋振荡器重悬沉淀。

(3) 再加入9 mL P2溶液，缓慢混匀，颠倒8次，充分裂解菌体，室温反应5 min。

(4) 加入9 mL P4溶液，缓慢混匀，颠倒8次，室温放置10 min，之后12000 rpm室温离心10 min，将上清倒入CS1滤器中进行过滤，收集至50 mL离心管中。

(5) CP6 吸附柱加入BL平衡液，8000rpm离心 1 min，平衡柱子。

(6) 加入0.3倍体积的异丙醇，缓慢混匀，颠倒8次，分批加入吸附柱，8000 rpm离心2 min，弃滤液。

(7) PW中加入乙醇，向吸附柱中加入10 mL PW，8000 rpm离心2 min，重复两次。

(8) 吸附柱中加入3 mL无水乙醇，8000 rpm离心2 min，弃滤液，空离2min，开盖室温放置5 min。

(9) 吸附柱中加入800 μL无酶水，更换收集管，室温放置5 min，8000 rpm离心2min。

(10) 抽取洗脱液重新加入到吸附柱上，12000 rpm离心2 min，将收集管中洗脱质粒加入到1.5 mL EP管中，测浓度后-40℃保存备用。将24头2周龄健康仔猪随机分成5组，试验具体分组和接种情况见表4。接种途径为背部皮下分点注射，免疫后每天观察并记录仔猪临床反应情况。免疫前和免疫后每周对仔猪进行耳静脉采血，至第4周，分离血清，-20℃保存备用。

1.2.2 抗体表达

利用293F真核表达系统，将抗体重链轻链质粒转染至293F细胞中进行抗体表达，具体操作方式如下：

(1) 将液氮罐中的HEK 293F细胞取出复苏，连续传3代后进行细胞转染。

(2) 转染前1 d，将细胞密度调整至1×10

(3) 制备转染混合物：取15 mL离心管，离心管中加入6 mL D-PBS，之后吸取 80 μg重链质粒，120 μg轻链质粒加入其中，上下颠倒混匀；另取15毫升离心管加入6 mL D-PBS，加入300 μg PEI转染试剂，上下颠倒混匀，将上述PEI预混物缓慢加入到质粒预混物中，上下颠倒混匀后室温放置10-15min。

(4) 将制备好的转染混合物加入细胞中，边摇边加，之后至于悬浮细胞培养箱中进行培养，培养条件为：37℃，8%CO2，125 rpm/mim，80%湿度。转染后每个样品每隔48 h加入3 mL SMS-293-SUPI Expression Medium Supplement。

(5) 培养7 d后测取细胞活率，当细胞活率降至60%后停止培养，将细胞液转移至50 mL离心管中，4℃离心30 min，收集上清，-40℃冻存备用。

1.2.3 抗体纯化

纯化前使用0.45 μm滤器将293F细胞表达的上清过滤，去除杂质，纯化步骤如下:

(1) 将20%酒精保存的镍填料加入到纯化柱中，用无菌水冲洗5个柱体积，之后用LE Buffer冲洗5个柱体积。

(2) 抗体结合：取45 mL的抗体表达液加入50 mL离心管中，加入2 mL镍填料，充分颠倒混匀后置于摇床中4℃过夜，使其充分结合。

(3) 将上述抗体混合物缓慢加入至纯化柱中，同时接取流传液。

(4) 用LE Buffer冲洗5个柱体积，之后加入10 mL的洗涤缓冲液进行洗杂，最后加入10 mL的洗脱缓冲液进行洗脱，全程冰上操作，防止蛋白降解。

(5) 将洗脱后的蛋白加入到透析袋中（透析袋提前煮沸处理），置于PBS中4℃进行透析，以去除咪唑，之后将透析袋置于50% PEG800溶液中进行浓缩，将浓缩后的抗体分装置EP管中，每株抗体取20 μL进行凝胶电泳，部分结果如图10所示，根据结果显示，成功表达出了特异性单克隆抗体，IgG抗体主要由两条相同的重链及轻链组成，还原性SDS-PAGE可使抗体重链轻链之间的二硫键断裂成，形成两条单链，重链大小约为50 kDa，轻链大小约为25kDa，如图10A所示；经过非还原性SDS-PAGE后，抗体重链轻链之间的二硫键未全部断裂，大多数呈现完整的抗体分子，其大小约为150 kDa，如图10B所示，由于处理样品时抗体部分轻重链之间的二硫键断裂，或者是不完全组装，在单链的位置上也出现了条带。

1.2.4间接ELISA检测抗体结合活性

以纯化后的PEDV病毒粒子、PEDV S1D蛋白、PEDV N蛋白作为包被抗原，用筛选到的mAb抗体作为一抗，检测所得抗体的反应性，具体操作如下：

(1)使用抗体包被液将PEDV病毒粒子、PEDV S1D蛋白、PEDV N蛋白稀释至1μg/mL，每孔100 μL加入到酶标板中，4℃包被过夜。

(2)包被完毕后将包被液弃去，用PBST清洗4次，于吸水纸上拍干，每孔加入封闭液（5%的蔗糖＋1%的BSA，PBS稀释）200 μL，37℃封闭2 h。

(3)弃去封闭液，用PBST清洗4次，拍干，于风机下吹1-1.5 h。将待检mAb在稀释板中用PBS进行2倍系列稀释（抗体起始浓度为40 μg/mL），每孔100 μL加入到酶标板中，37℃孵育1 h，同时设置PBS阴性对照。PBST清洗5次后拍干。

(4)取兔抗猪IgG-HRP (用血清稀释液1：4000稀释）每孔100 μL加入到酶标板中，37℃孵育30 min，PBST清洗5次后拍干。

(5)提前将TMB显色液置于室温下平衡，将显色液每孔100 μL加入到酶标板中，37℃显色10 min。每孔加入100 μL终止液终止显色，用酶标仪测取OD450nm值。结果如图11所示，图11A图为抗体对PEDV病毒粒子的结合活性；图11B图为抗体对PEDV N蛋白的结合活性；图11C图为抗体对PEDV S1D蛋白的结合活性；结果显示，筛选出的21株抗体有20株抗体对PEDV病毒粒子具有结合活性，有19株抗体对PEDV N蛋白具有结合活性，没有一株抗体显现出对S1D蛋白的结合活性。我们依据cut-off值对应的抗体浓度作为判定数值，分别划分为0-0.05μg/mL、0.05-0.1 μg/mL、0.1-1μg/mL、1-5μg/mL、>5μg/mL档次，反应强度分别标记为++++、+++、++、+、-。根据划分标准，对21株抗体的结合活性进行总结，结果见表5。

表5抗体结合活性总结

1.2.5间接免疫荧光检测抗体反应性

为了检测筛选出的mAb与PEDV毒株的反应性，将纯化后的抗体进行间接免疫荧光检测，具体步骤如下：

(1) 将正常传代的细胞铺成24孔板，待细胞密度达到80%后接种PEDV毒株，待病毒吸附 2h弃去上清，加入新鲜的不含血清的DMEM培养基。

(2) 待细胞出现病变时弃去上清培养液，每孔加入1 mLPBS进行清洗，弃去PBS后，每孔加入500 μL的固定液室温固定10 min，吸弃固定液，PBS清洗3次，加入0.1-0.5%的0.1-0.5% Triton X-100渗透样品10 min；

(3) 吸弃Triton X-100，PBS清洗3次，加入1%BSA封闭液，37℃封闭2 h；

(4) 弃去封闭液，PBS清洗3次，将筛选得到的mAb用PBS稀释至5 μg/mL，每孔加入400 μL，4℃过夜孵育；

(5) 吸弃一抗，PBS清洗3次，每孔加入200 μL Anti-pig-IgG-FITC（1：200稀释），37℃孵育2 h；

(6) 吸弃二抗，PBS清洗3次后置于荧光显微镜下观察。结果如图12所示，试验结果表明共有7株抗体孵育过的细胞显示出特异性绿色荧光，而其他抗体孵育过的细胞均没有绿色荧光出现。结果表明，在间接免疫荧光试验中，共有7株抗体显现出反应活性，其他抗体均无反应活性。

1.2.6 Western blot鉴定抗体识别的抗原蛋白

(1)纯化后的PEDV病毒粒子、PEDV S1D蛋白、PEDV N蛋白各取150 μL加入到1.5 mL离心管中，加入50 μL的4×Loding Buffer涡旋混匀，置于100℃金属浴中加热10 min。

(2)将处理好的样品每孔10 μL加入到12%的预制胶中进行电泳，电泳结束后，将胶块转印至PVDF膜上（提前用甲醇处理），转印条件为200 mA 2 h。

(3)转印结束后，将PVDF膜浸泡于5%的脱脂牛奶中封闭2 h，取出PVDF膜，TBST清洗3次，将筛选出的mAb（用一抗稀释液稀释至5 μg/ mL）作为一抗4℃孵育过夜。

(4)取出PVDF膜，TBST清洗3次后，用兔抗猪IgG HRP（5%的脱脂牛奶稀释至1：5000）作为二抗，摇床上孵育2 h，TBST清洗3次。

(5)将ECL发光液A液与B液按1:1比例混匀后，将PVDF膜浸入其中，使用Tanon 5200化学发光成像系统进行曝光。结果如图13所示，只有3株抗体出现了特异性条带，无其他杂带，这三株抗体与PEDV病毒粒子，PEDV N蛋白反应后，在58 kDa处都出现了特异性单一条带，没有一株抗体与S1D蛋白结合，结果表明，19株N蛋白特异性抗体中有3株识别的是N蛋白的线性表位，其余抗体可能识别的是N蛋白的构象表位。

PEDV是一种带有囊膜的RNA病毒，目前在我国广泛流行的是GII型毒株，具有极强的变异性，在免疫压力下，免疫突变株频频出现，大大降低了疫苗的免疫效果，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。如何诱导机体产生高效、广谱的中和抗体，一直是免疫学研究中的重要内容。广谱中和抗体对于解析保守抗原表位非常重要，通过探究其产生机制与识别的抗原结构特征，继而为广谱高效的新型疫苗研发提供思路。随着单个B细胞抗体技术的兴起，更大范围的筛选广谱中和抗体得以实现，为深入研究其抗原结构提供了良好的技术平台。同时，通过单个B细胞技术获得的抗体具有其d然的属源性，有效避免了在研究过中因属源差异而可能带来的试验误差。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。