一种猪口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法

技术领域

本发明涉及单克隆抗体制备技术领域，特别涉及一种猪口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法。

背景技术

猪口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)属于RNA病毒科(Picornaviridae)，猪口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，是偶蹄类动物高度传染性病原。病毒外壳为对称的20面体，具有4种结构蛋白：VP4(1A)、VP2(1B)、VP3(1C)和VP1(1D)，VP1由1D基因编码，大部分暴露在病毒表面，是决定其抗原性的主要组分。O型FMDV存在5个抗原位点，其中最主要的抗原位点是位于VP1上的134～161位氨基酸残基处的G-H环，据报道，针对该原位点诱导豚鼠产生的中和抗体，能抵制该毒株的感染。

猪口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMDV引起的一种急性、烈性、接触性传染病，发病动物表现为发热，跛行，舌、蹄部、鼻、乳房等部位出现水泡，可以感染猪、牛、山羊、绵羊等家畜以及鹿、羚羊等70多种野生动物。FMD能引起动物肉质下降、生长速度降低、产奶量减少、种用价值丧失、役用性能降低、甚至幼畜死亡等。猪口蹄疫广泛存在于亚洲和非洲的部分地区，并在一些欧洲国家零星发生。鉴于该病对世界经济和社会安全等产生的严重影响，OIE和FAO将其列为A类家畜传染病之首，是必须通报的传染病。我国也将其列为一类动物传染病。目前防治FMD最有效的手段是疫苗接种，已报道FMDV有A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3共7个血清型，同一血清型还具备不同的亚型，各型或亚型之间交叉免疫保护力弱。我国主要流行的有O型、A型和Asia1型，其中危害我国猪群最为严重的是O型，针对O型FMDV的VP1的抗体在疫情爆发时紧急治疗中具有重大的使用价值。如何快速实现猪口蹄疫抗体的量产，保障该单抗在检测或疫情防控上的快速使用是重要的研究课题。

单克隆抗体(简称“单抗”)制备技术成熟，传统方法制备多采用设计引物，构建表达载体，诱导蛋白表达，蛋白经过超滤、层析等纯化方法进行纯化，纯化的蛋白配合佐剂制备免疫原，多次皮下免疫动物，通过检测免疫动物血清抗体效价，适时终止免疫并筛出杂交瘤细胞株，以实现单抗的量产。但该方法存在免疫原用量大、纯度低；免疫原的制备难度大、周期长、成本高的问题，并且小鼠皮下注射引起的免疫反应弱，免疫次数多，免疫周期长。因此，现有的单克隆抗体制备方法存在抗原制备难度高、抗原用量大、制备周期长等和免疫次数多等问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种猪口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法，用于解决现有的单克隆抗体制备方法存在抗原制备难度高、抗原用量大、制备周期长和免疫次数多等问题。

为实现上述目的，本发明提出一种猪口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法，该方法具体包括如下步骤：

S10、对O型猪口蹄疫病毒VP1蛋白的氨基酸序列进行序列比对、抗原表位预测及分析，筛选制备抗体的目的抗原表位；

S20、确定多肽的序列，将多肽的序列提交生物公司进行合成，得到多肽，所述多肽的序列包含目的抗原表位的重复序列与信号肽序列，所述信号肽为免疫细胞识别的信号肽；

S30、将所述多肽溶解，用弗式佐剂进行乳化，制备成免疫原；

S40、对小鼠注射所述免疫原，所述免疫方式为足垫免疫；

S50、对免疫鼠血清的抗体进行效价检测，将抗体效价满足要求的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞株，从所述杂交瘤细胞株筛选出能分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株；

S60、将阳性杂交瘤细胞株注射到动物腹腔进行腹水制备，收获腹水，纯化后得到猪口蹄疫病毒单克隆抗体。

可选地，所述步骤S10中，选取VP1蛋白上的134～161位氨基酸序列作为抗体制备的目的表位。

可选地，所述步骤S20中，所述信号肽的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

可选地，在步骤S20，所述确定多肽的序列的步骤包括：

将目的抗原表位的氨基酸序列通过柔性连接进行多次重复串联，并在重复串联序列前引入信号肽，得到含有信号肽与多次重复串联的目的抗原表位的多肽的序列。

可选地，所述步骤S30中，用无菌PBS溶解所述多肽。

可选地，所述步骤S40包括：

S41、对小鼠采用所述免疫原进行足垫免疫；

S42、在一免28日后对小鼠采用所述免疫原进行二免。

可选地，所述步骤S50包括：

S51、二免后14日，从小鼠尾根部采血，利用间接ELISA法对免疫鼠血清的抗体进行效价检测；

S52、筛选抗体效价符合要求的小鼠，用不含佐剂的多肽溶液进行腹腔免疫一次，免疫后3～7天取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，获得杂交瘤细胞株；

S53、采用间接ELISA法检测筛选阳性孔，并用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直到筛选出稳定分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。

可选地，所述步骤S60包括：

S61、将阳性杂交瘤细胞株注射到10～12周龄SPF级的BALB/c鼠的腹腔进行扩增；

S62、收集免疫鼠腹水，纯化腹水，得到猪口蹄疫病毒单克隆抗体。

本发明的有益效果如下：

(1)本发明提供的猪口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法选择小鼠足垫作为免疫部位，利用小鼠足垫面积小，神经原丰富，淋巴细胞多，在抗原刺激后免疫反应强烈等特性，可减少抗原的免疫次数，并在微量抗原刺激下制备抗体，极大减少制备抗体时的抗原用量。

(2)本发明选取目前流行毒株具有抗原性的线性表位序列作为目的表位，还对目的表位的氨基酸序列进行调整优化，合成了包含目的抗原表位的重复序列与信号肽序列的多肽，其中，通过引入免疫细胞识别的信号肽，可加强免疫细胞对多肽的捕获能力，提升免疫原的免疫刺激效果，设计线性抗原表位多次重复可提升抗原的免疫原性，进一步提升免疫原的免疫刺激效果。因此，本发明通过选取目的表位、对目的表位的氨基酸序列进行调整优化和信号肽的引入，提升了免疫原的免疫刺激效果，可减少免疫次数，降低制备抗体时的抗原用量要求。

(3)使用合成的多肽作为免疫原，不需要引物设计、表达载体构建、检验验证等实验步骤，只需要选取需要合成的多肽序列，大大降低了抗原制备难度；同时还省略抗原的表达和纯化过程，缩短了抗原制备周期；另外，合成多肽的纯度高，制备的抗体的特异性强。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中小鼠固定装置图；

图2为本发明实施例1中单克隆抗体的特异性鉴定图。

附图标号说明：

100、小鼠固定装置；1、管体；2、矩形孔；3、呼吸孔；4、防刮层；5、管盖。

本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。另外，全文中出现的“和/或”的含义，包括三个并列的方案，以“A和/或B”为例，包括A方案、或B方案、或A和B同时满足的方案。此外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

猪口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV)属于RNA病毒科(Picornaviridae)，猪口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，是偶蹄类动物高度传染性病原。病毒外壳为对称的20面体，具有4种结构蛋白：VP4(1A)、VP2(1B)、VP3(1C)和VP1(1D)，VP1由1D基因编码，大部分暴露在病毒表面，是决定其抗原性的主要组分。O型FMDV存在5个抗原位点，其中最主要的抗原位点是位于VP1上的134～161位氨基酸残基处的G-H环，据报道，针对该原位点诱导豚鼠产生的中和抗体，能抵制该毒株的感染。

猪口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由FMDV引起的一种急性、烈性、接触性传染病，发病动物表现为发热，跛行，舌、蹄部、鼻、乳房等部位出现水泡，可以感染猪、牛、山羊、绵羊等家畜以及鹿、羚羊等70多种野生动物。FMD能引起动物肉质下降、生长速度降低、产奶量减少、种用价值丧失、役用性能降低、甚至幼畜死亡等。猪口蹄疫广泛存在于亚洲和非洲的部分地区，并在一些欧洲国家零星发生。鉴于该病对世界经济和社会安全等产生的严重影响，OIE和FAO将其列为A类家畜传染病之首，是必须通报的传染病。我国也将其列为一类动物传染病。目前防治FMD最有效的手段是疫苗接种，已报道FMDV有A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3共7个血清型，同一血清型还具备不同的亚型，各型或亚型之间交叉免疫保护力弱。我国主要流行的有O型、A型和Asia1型，其中危害我国猪群最为严重的是O型，针对O型FMDV的VP1的抗体在疫情爆发时紧急治疗中具有重大的使用价值。在紧急情况下，如何快速实现猪口蹄疫抗体的量产，保障该单抗在检测或疫情防控上的快速使用是重要的研究课题。

单克隆抗体(简称“单抗”)制备技术成熟，传统方法制备多采用构建表达载体，诱导蛋白表达，蛋白经过超滤、层析等纯化方法进行纯化，纯化的蛋白配合佐剂制备免疫原，多次皮下注射方式免疫动物，通过检测免疫动物血清抗体效价，适时终止免疫并筛出杂交瘤细胞株，以实现单抗的量产。该方法经典，有效，能实现单抗的制备目的，但该方法存在免疫原用量大，抗体制备用高纯度免疫原的获得需经过表达载体的构建、表达及纯化等过程，导致免疫原的制备难度大、周期长、成本高；小鼠皮下注射引起的免疫反应弱，免疫次数多，免疫周期长。因此，现有的单克隆抗体制备方法存在抗原制备难度高、抗原用量大、免疫次数多和制备周期长的问题。

鉴于此，本发明提出一种猪口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法，所述猪口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：

S10、对O型猪口蹄疫病毒VP1蛋白的氨基酸序列进行序列比对、抗原表位预测及分析，筛选制备抗体的目的抗原表位；

S20、确定多肽的序列，将多肽的序列提交生物公司进行合成，得到多肽，所述多肽的序列包含目的抗原表位的重复序列与信号肽序列，所述信号肽为免疫细胞识别的信号肽；

S30、将所述多肽溶解，用弗式佐剂进行乳化，经乳化后制备成免疫原；

S40、对小鼠注射所述免疫原，所述免疫方式为足垫免疫；

S50、对免疫鼠血清的抗体进行效价检测，将抗体效价满足要求的小鼠的脾细胞和骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞株，从所述杂交瘤细胞株筛选出能分泌抗体的阳性杂交瘤细胞株；

S60、将阳性杂交瘤细胞株注射到动物腹腔进行腹水制备，收获腹水，纯化后得到猪口蹄疫病毒单克隆抗体。

本发明提供的猪口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法选择小鼠足垫作为免疫部位，利用小鼠足垫面积小，神经原丰富，淋巴细胞多，在抗原刺激后免疫反应强烈的特性，使用少量的免疫原即可满足制备抗体的需求。此外，本发明选取目前流行毒株具有抗原性的线性表位的序列作为目的表位，还对目的表位的氨基酸序列进行调整优化，合成了包含目的抗原表位的重复序列与信号肽序列的多肽来提升免疫效果，其中，通过引入免疫细胞识别的信号肽，加强免疫细胞对合成的多肽的捕获能力，从而提升免疫原的免疫刺激效果，还通过设计线性抗原表位多次重复来提升抗原的免疫原性，进一步提升免疫原的免疫刺激效果。因此，本发明的单克隆抗体的制备方法通过选取目前流行毒株的序列作为目的表位、对目的表位的氨基酸序列进行调整优化和信号肽的引入，提升了免疫原的免疫效果，减少了免疫次数，降低了制备抗体时的免疫原使用量需求。

需要说明的是，传统的单克隆抗体制备方法多采用设计引物，基因扩增与连接，转化，单克隆鉴定与测序；质粒提取与转化，诱导表达，纯化，定量等试验以获得免疫原，这种采用自构建载体表达免疫原方法，在所有试验步骤都一次性成功的情况下，大概需要1个月左右可获得抗原蛋白，而将多肽的序列提交生物公司进行合成，跳过了抗体制备时构建表达系统生产免疫原步骤，缩短免疫原制备周期。其次，采用传统的单克隆抗体制备方法获得的免疫原蛋白的纯度也难以比拟直接合成的高纯度，而抗原蛋白纯度与制备抗体的特异性呈正相关，生物合成的多肽的纯度更高，因此制备出的抗体特异性更强。此外，采用足垫免疫，通过优化的免疫原，经过两次免疫多可获得抗体效价符合要求的免疫鼠，而采用自构建载体表达免疫原的抗体制备，多需要免疫3次以上才能获得比较理想的抗体效价，基本需要多两月的时间。最后，在免疫原使用量上，传统的单克隆抗体制备方法按3次免疫计，每只鼠用的免疫原为1100μg，而采用足垫免疫制备抗原时，每只鼠用的免疫原仅需要230μg，可大大节省免疫原用量。因此，本发明的单克隆抗体制备方法采用足垫免疫的免疫方式，不需要构建表达载体，只需要确认合成的多肽序列，可缩短抗体制备周期，降低抗原制备难度，且制备的抗体特异性更强、抗原使用量更少。

在本发明一实施中，所述步骤S10中，选取VP1蛋白上的134～161位氨基酸序列作为抗体制备的目的表位。

在步骤S10中，首先查找国外内流行的O型FMDV的VP1蛋白的氨基酸序列，通过序列比对软件对O型猪口蹄疫病毒VP1蛋白的氨基酸序列进行序列比对，通过结构分析软件对VP1蛋白的抗原表位进行预测及分析，查找主要的抗原表位，并对可能存在的抗原表位进行筛选，从而确定选取VP1蛋白上的134～161位氨基酸序列作为抗体制备的目的表位。所选取的表位为目前流行毒株的序列，对目的表位进行了优化，从而保证制备的抗体与现行毒株能很好反应。

在本发明一实施中，所述步骤S20中，所述信号肽的氨基酸序列为SEQ IDNo.1，SEQID No.1具体如下：YGRKKRRQRRR。

在本发明一实施中，在步骤S20中，所述确定多肽的序列的步骤包括：

将目的抗原表位的氨基酸序列通过柔性连接进行多次重复串联，并在重复串联序列前引入信号肽，得到含有信号肽与多次重复串联的目的抗原表位的多肽序列。

本发明的技术方案中，优化多肽序列是以O型猪口蹄疫病毒VP1蛋白的134～161位氨基酸序列为基础，将目的抗原表位的氨基酸序列通过柔性连接进行多次重复串联，并在重复串联序列前引入信号肽序列，得到含有信号肽与多次重复串联的目的抗原表位的多肽序列。需要说明的是，设计目的抗原表位的氨基酸序列重复多次可以是重复序列两次、三次、四次或者重复序列四次以上，均属于本发明的保护范围。重复序列的次数增加，制备多肽的成本随之增加，各重复序列的结构的独立性也会受到影响，在本发明一实施中，综合考虑抗原刺激效果、结构稳定性和成本，选择将目的抗原表位的氨基酸序列重复三次，即所述多肽的序列包含信号肽序列与目的抗原表位的三次重复序列，所述多肽序列为SEQ IDNo.2，SEQ ID No.2具体如下：

YGRKKRRQRRRCKYGEAREANVRGDLQVLAQKAARTLPTGSGSGSC KYGEAREANVRGDLQVLAQKAARTLPTGSGSGSCKYGEAREANVRGDLQ VLAQKAARTLPT。

在本发明一实施中，所述步骤S30中，用无菌PBS溶解所述多肽。

在S30步骤中，采用无菌0.01mol/L PBS溶解合成肽并稀释至1mg/mL得到多肽溶液；在多肽溶液中加入等体积的弗式完全佐剂，经乳化制备成首免免疫原；同样方式取合成肽溶液与等体积的弗式不完全佐剂，经乳化制备成后续免疫原。

在本发明一实施中，所述步骤S40包括：

S41、对小鼠采用所述免疫原进行足垫免疫；

S42、在一免28日后对小鼠注射所述免疫原进行二免。

在步骤S40中，对小鼠足垫注射免疫原进行首次足垫免疫，在28日后采用相同方式对小鼠的另一足垫注射免疫原进行二免，后续免疫视抗体效价检测结果是否符合要求而定。

需要说明的是，所述免疫用小鼠采用6～8周龄SPF级的BALB/c鼠，并采用自制的小鼠固定装置来固定小鼠进行免疫。请参照图1，图1是本发明实施例1的小鼠固定装置图。所述小鼠固定装置100包括管体1、矩形孔2、呼吸孔3、防刮层4以及管盖5。

进一步地，所述管体1利用50mL透明离心管制备而成，选用50mL离心管可避免离心管直径太大，小鼠易折返调头，直径太小，小鼠进入拥挤的问题；所述矩形孔2设置于管体1的管壁上，设置于靠近管盖5的一端，宽度为0.4～0.7cm，长度为2.5～3.5cm，将矩形孔2的个数设置为2个，并沿管体1对称，宽度为0.4～0.7cm，可同时满足两肢的相应实验操作，设置矩形孔2的长度为2.5～3.5cm，有利于小鼠在离心管中的自由度，减少实验操作应激，可满足小鼠前肢、腹部、皮下、胸腔、尾部、耳部等多部位的实验操作；所述呼吸孔3设置于所述管体1的管壁上，设置于远离管盖5的一端，呼吸孔3的直径为0.3～0.7cm。设置呼吸孔3的直径为0.3～0.7cm，避免因为孔径太大，小鼠露齿可能会伤人，孔径太小时，空气流通不畅会引起小鼠呼吸困难的问题，所述呼吸孔3的个数可以设置两个或三个；所述防刮层4包裹于矩形孔2的边缘，通过设置防刮层4以防刮伤小鼠，该防刮层的材料不限于塑料，只要能实现防止小鼠刮伤且易于设置在矩形孔2的边缘上即可；所述管盖5旋设于管体1上，连接在管体开口处。在本发明一实施中，设置矩形孔2的宽为0.5cm，长度为3cm，呼吸孔3的个数为三个，呼吸孔3的直径为0.5cm。

需要说明的是，本发明的技术方案注射免疫原采用针头短小、壁薄的30μL微量注射器，并在使用前对微量注射器高压灭菌以降低感染。常规注射器相对小鼠足垫部位来说，针头粗，针尖长，量程大，免疫原注入量的误差大，而小鼠足垫面积小，厚度薄，免疫原的注入量少，注入深度浅。选用微量注射器，针头细不易引起免疫原的外流而损失；针尖短没入量程小，有利于免疫且对小鼠的影响小；量程小，免疫量的误差小，且免疫原损失小。采用针头短小、壁薄的30μL微量注射器有利于保障免疫操作的实施。

在本发明一实施中，所述步骤S50包括：

S51、二免后14日，从小鼠尾根部采血，利用间接ELISA法对免疫鼠血清的抗体进行效价检测；

S52、筛选抗体效价符合要求的小鼠，用不含佐剂的多肽溶液腹腔免疫一次，免疫后3～7天取免疫鼠的脾细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合，获得杂交瘤细胞株；

S53、采用间接ELISA法检测筛选阳性孔，并用有限稀释法对阳性孔进行亚克隆，直到筛选出稳定分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。

在本发明一实施中，所述步骤S60包括：

S61、将阳性杂交瘤细胞株注射到10～12周龄SPF级的BALB/c鼠的腹腔进行扩增；

S62、收集免疫鼠腹水，纯化腹水，得到猪口蹄疫病毒单克隆抗体。

以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

一种猪口蹄疫病毒单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

1、确认目的抗原表位：

查阅O型猪口蹄疫病毒的基因序列及功能蛋白研究，通过NCBI上国内外不同O型分离株的蛋白序列，借助BLAST比对各序列，结合序列分析软件PYMOL的功能预测和分析，确定选取VP1蛋白的134～161位氨基酸序列作为抗体制备的目的表位。

2、确认多肽的序列以及合成多肽：

(1)通过BLAST比对、PYMOL的功能预测和分析国内外猪口蹄疫病毒的O型株的134～161位氨基酸序列，以国内流行广泛，致病力强，出现时间较晚的O型FMDV的VP1蛋白的134～161位氨基酸序列为基础，在134位氨基酸前引入免疫细胞识别信号肽，在161位氨基酸后引入GSGSG的柔性连接，再重复134～161位氨基酸序列2次，并通过柔性连接将各重复序列进行串联，得到优化后的多肽序列。优化后的多肽序列包含O型猪口蹄疫病毒的VP1蛋白的134～161位氨基酸的三次重复序列和免疫细胞识别信号肽，优化后的多肽序列如SEQ IDNo.2所示。

(2)利用alphafold软件的结构预测功能来指导优化多肽的氨基酸序列，确认各重复序列保持各自的结构，以维持各自功能。在确认优化后的多肽序列后，将优化后的多肽序列发送至生物合成公司进行多肽的合成，得到多肽。

3、免疫原制备：

(1)小鼠适应性饲养，6～8周龄SPF级的BALB/c鼠4只，接种前3天饲养于IVC系统。

(2)将多肽用离心机瞬离5秒，在超净台内，用无菌0.01mol/L PBS溶解多肽，稀释至1mg/mL得到多肽溶液，取200μL多肽溶液加入等体积的弗式完全佐剂，经乳化制备成首免免疫原，其它多肽置于-40℃冻存。

4、小鼠足垫免疫：

(1)将针头短小、壁薄的30μL微量注射器提前于高压灭菌。

(2)将小鼠头部朝管底装入如图1的小鼠固定装置100后置于水平桌面上，将左后腿沿矩形孔2露出来。取灭菌的微量注射器吸取免疫原，排空气后注射器里的免疫原不低于20μL；用生理盐水清洗鼠小腿，碘酒消毒，75％酒精脱碘；平压鼠脚趾，使整个鼠足垫水平摊开朝上展示，从鼠足根与鼠掌呈约30°下针，针尖部没入足垫深约1mm时，进针改成水平向足趾分叉部推进至离足趾分叉处约1mm处，开始注入免疫原；缓慢推送免疫原进脚垫，约按2μL/秒的注入速度注入免疫原，注入的同时，视注入量缓慢向后退针，直至针尖斜角远尖端约离足根部1mm前将免疫原推送完成；免疫原注入完成后，静置5秒后，针头旋转180°拨出，并按住针孔1分钟。按此方式完成剩余小鼠的足垫免疫。

(3)首免28日后，将-40℃冻存的多肽融化，取200μL多肽溶液加入等体积的弗式不完全佐剂，经乳化制备成二免免疫原；小鼠按首免疫相同方式对小鼠的右后脚垫进行二免。

5、阳性杂交瘤细胞株筛选：

(1)抗体效价检测：将-40℃冻存的多肽融化，按4μg/mL包被Elisa检测板；二免后14日，从小鼠尾根部采血，利用间接ELISA法检测小鼠免疫血清的抗体效价。筛选抗体效价不低于1:6400的免疫鼠，用不含佐剂的多肽溶液0.5ml腹腔加强免疫一次。

(2)阳性杂交瘤细胞株筛选：腹腔免疫后5天，将免疫鼠采用颈椎脱位法处死，浸泡于75％酒精，在超净台内取小鼠的脾脏，经处理后获得的脾脏细胞与鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合；经HAT选择性培养基培养，以步骤(1)包被的ELISA板检测筛选阳性孔，再通过有限稀释法进行亚克隆，直到筛选出能稳定分泌猪口蹄疫病毒单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。

6、抗体量产：

(1)对筛选出能稳定分泌猪口蹄疫病毒单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株进行放大培养，收集细胞腹腔免疫10～12周龄SPF级的BALB/c鼠10只，适时收集免疫鼠腹水共计14.4mL，通过辛酸-饱和硫酸铵沉淀法获得纯化后的单抗溶液13mL。

(2)采用SDS-PAGE凝胶电泳法测所得单克隆抗体的纯度满足要求；采用BCA法测定所得单克隆抗体的浓度为5.2mg/mL；采用MAb分型试剂盒鉴定所得单克隆抗体的亚类亚型为IgG1，轻链为κ链；采用间接ELISA法测定所得单克隆抗体的效价为1:10

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。