一种用于捕获mRNA的层析介质及其制备方法

技术领域

本发明涉及层析介质及其制备方法，特别涉及一种用于捕获mRNA的层析介质及其制备方法。

背景技术

早在上世纪90年代，科学家就将体外合成的mRNA注射入小鼠体内，发现其能够在小鼠体内被翻译成相关的活性蛋白，并产生了免疫应答，可以发挥疫苗的作用，这便是mRNA疫苗的雏形。但由于技术所限，mRNA在稳定性、安全性以及药物呈递方面存在诸多瓶颈。经过30年的发展，mRNA的合成、修饰、递送技术有了长足的进步，特别是新冠病毒的大流行，促使人类历史上第一款mRNA疫苗被批准用于疾病预防，在有效性方面mRNA疫苗明显高于传统技术疫苗，这直接促进了mRNA预防和治疗产品的快速发展。

传统的mRNA生产制备方法需要很多纯化步骤，使用大量的有害试剂，因此对于大规模生产的下游纯化阶段是一个非常不利的因素。目前业内常用的mRNA纯化方法包括反相、亲和、离子交换及分子筛等，反向色谱是使用较为广泛的方法，但该方法的载量较低，并需要使用易燃、有毒有害的溶剂。而离子交换层析和分子筛纯化应用却受限于较差的选择性和较低的载量。

根据目前相关技术的发展，大多数mRNA产品在修饰过程中都会有一个PolyA尾巴，长度可达250nt，这为后续纯化带来了很大的便利。将一定长度的碱基T作为配基键合至固相载体上，可通过T和A之间的碱基配对作用捕获mRNA，这不仅可以去除绝大多数的工艺相关杂质，如DNA模板、RNA聚合酶等，还可以去除产品相关杂质，如没有PolyA尾巴的mRNA。当配基为单链多聚胸腺嘧啶时，其与mRNA的Poly(A) 尾巴结合过强，不容易洗脱，因此可以采用结合能力较弱的单链多聚脱氧胸腺嘧啶作为配基，相关产品包括键合有Oligo dT的磁珠、纤维素、聚乙烯-二乙烯基苯微球等。在这些产品中，磁珠由于原理所限，只能用于实验室研究，提纯少量mRNA；纤维素由于基质太软，不利于mRNA产品下游大规模纯化；而聚乙烯-二乙烯基苯微球刚性好，可用于mRNA产品的工业纯化，但由于其表面疏水性较强，其它杂质可通过疏水作用结合到微球上，在后续的洗脱步骤混入mRNA产品中，杂质去除效果不理想。随着生物制药技术的发展，层析技术已经被广泛用于生物大分子药物下游的大规模纯化，因此，有必要开发一种刚性好、表面亲水性好、载量高、易使用的Oligo dT亲和层析介质，专门用于mRNA预防和治疗生物制品的下游纯化。

发明内容

发明目的：本发明目的是提供偶联效率高的用于捕获mRNA的层析介质。

本发明另一目的是提供所述偶联效率高的用于捕获mRNA的层析介质的制备方法。

技术方案：本发明提供一种用于捕获mRNA的层析介质，结构如下：

SP-R-Oligo dT

其中，SP为基础介质，Oligo dT为亲和配基，R为基础介质偶联Oligo dT的间隔臂。在这一结构中，基础介质作为Oligo dT配基的固体支撑物，具有合适的孔结构，可以提供足够大的比表面积，用于提高mRNA的结合载量，此外，基础介质表面还具有极好的亲水层，尽可能降低杂质的非特异性结合。Oligo dT为单链多聚脱氧胸腺嘧啶，用于结合具有PolyA尾巴的mRNA。间隔臂R的作用为将Oligo dT配基偶联至固体支撑物上，在结合-洗脱模式的纯化步骤中尽可能避免配基混入产品中，同时，间隔臂R选用亲水性好的试剂，降低杂质的非特异性结合。

进一步地，所述基础介质为琼脂糖微球、聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球或硅胶微球中的一种。琼脂糖微球具有高交联度，有一定的机械性能，可用于工业层析纯化，其表面未经任何修饰且具有大量天然的羟基，亲水性极佳，对杂质的非特异性结合可忽略不计。聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球和硅胶微球均为单分散多孔微球，相比于琼脂糖微球，其孔道为刚性，传质快，有利于mRNA的结合，单分散微球可提高层析柱填装的可重复性，同时微球表面经过亲水性修饰，具有大量羟基，可以尽可能降低杂质的非特异性结合。

进一步地，所述琼脂糖微球表面未经任何修饰且具有天然的羟基。

进一步地，所述聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球和硅胶微球表面经过亲水性修饰，具有羟基。

进一步地，所述Oligo dT为具有10到30个碱基的多聚脱氧胸腺嘧啶，且在5’端修饰有氨基。

进一步地，所述间隔臂R的两端都具有环氧基、一端与介质偶联，另一端与OligodT 末端的氨基偶联，中间具有任意化学结构。

进一步地，所述间隔臂制备用的试剂采用亲水性好的1，2-乙二醇二缩水甘油醚、1， 4-丁二醇二缩水甘油醚、1，6-己二醇二缩水甘油醚、1，3-丙二醇二缩水甘油醚或丙三醇三缩水甘油醚中的一种或任意多种组合。

进一步地，所述基础介质粒径为5μm-150μm；粒径均一度可以为单分散、多分散；基础介质为无孔的，或者包括一个或多个孔隙，孔径为

所述的用于捕获mRNA的层析介质的制备方法，包括如下步骤：

(1)将基础介质活化，得到表面修饰有大量环氧基或醛基的活化介质；

(2)将Oligo dT偶联至活化介质上；

(3)将多余醛基或环氧基封闭处理，得到Oligo dT亲和介质。

优选方案如下：

当基础介质为琼脂糖微球时，使其表面具有大量环氧基的活化方法为：将琼脂糖微球与0.2-2mol/L氢氧化钠溶液等体积混合均匀，在搅拌条件下加入和介质等体积的间隔臂试剂，将温度升高至30-45℃，连续搅拌反应2-5h，依次用乙醇和水清洗掉多余试剂，即可得到表面修饰有大量环氧基的活化介质；而使其表面具有大量醛基的活化方法为：将琼脂糖微球与0.1-0.5mol/L高碘酸钠溶液等体积混合均匀后在室温下搅拌反应0.5-3 h，然后用水清洗掉多余试剂及副产物后即可得到表面修饰有大量醛基的活化介质，且与高碘酸钠溶液反应后形成的具有末端醛基的糖链可作为间隔臂；

当基础介质为聚甲基丙烯酸酯微球、聚乙烯-二乙烯基苯微球或硅胶微球时，使其表面具有大量环氧基的活化方法为：将基础介质与0.2-2mol/L氢氧化钠溶液等体积混合均匀，在搅拌条件下加入和介质等体积的间隔臂试剂，将温度升高至30-45℃，连续搅拌反应2-5h，依次用乙醇和水清洗掉多余试剂，即可得到表面修饰有大量环氧基的活化介质；而使其表面具有大量醛基的活化方法为：将基础介质与0.2-2mol/L氢氧化钠溶液等体积混合均匀，在搅拌条件下加入和介质等体积的间隔臂试剂，将温度升高至 30-45℃，连续搅拌反应2-5h，依次用乙醇和水清洗掉多余试剂，然后将间隔臂末端环氧基用硫酸溶液水解，方法为将介质与0.5-2mol/L硫酸溶液等体积混合，在25-50℃条件下机械搅拌反应1-5h，最后将介质与0.1-0.5mol/L高碘酸钠溶液等体积混合均匀后在室温下搅拌反应0.5-3h，然后用水清洗掉多余试剂及副产物后即可得到表面修饰有大量醛基的活化介质。

当活化介质表面修饰有大量环氧基时，偶联Oligo dT的步骤为：将Oligo dT溶解于 20-200mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9-11)中，Oligo dT的浓度为0.5-10mg/mL；将活化介质与1-3倍体积的Oligo dT溶液混合，加入硫酸钠使其浓度为0.1-2mol/L，在 25-45℃条件下搅拌反应1-15h，结束后过滤介质，并用与Oligo dT溶液等体积的20-200 mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9-11)清洗介质3次，收集反应后滤液及3次清洗滤液，测试剩余Oligo dT的质量，与投入的Oligo dT质量之差即为偶联至活化介质的Oligo dT 质量。

当活化介质表面修饰有大量醛基时，偶联Oligo dT的步骤为：将Oligo dT溶解于20-200mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为6-8.5)中，Oligo dT的浓度为0.5-10mg/mL；将活化介质与1-3倍体积的Oligo dT溶液混合，加入硫酸钠使其浓度为0.1-2mol/L，加入氰基硼氢化钠使其浓度为1-20mmol/L，在25-45℃条件下搅拌反应1-15h，结束后过滤介质，并用与Oligo dT溶液等体积的20-200mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为6-8.5)清洗介质3次，收集反应后滤液及3次清洗滤液，测试剩余Oligo dT的质量，与投入的 Oligo dT质量之差即为偶联至活化介质的Oligo dT质量。

封闭多余环氧基的步骤为：将偶联有Oligo dT的介质与等体积20-200mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9-11，包含0.05-2mol/L乙醇胺)混合均匀，在25-45℃条件下搅拌反应1-15h，结束后过滤介质，依次用10倍体积水、10倍体积1mol/L NaCl、10倍体积水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

封闭多余醛基的步骤为：将偶联有Oligo dT的介质与等体积20-200mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为6-8.5，包含0.05-2mol/L乙醇胺)混合均匀，加入氰基硼氢化钠使其浓度为1-20mmol/L，在25-45℃条件下搅拌反应1-15h，结束后过滤介质，依次用10 倍体积水、10倍体积1mol/L NaCl、10倍体积水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

有益效果：本发明介质刚性好、表面亲水性好、载量高，适用于mRNA预防和治疗生物制品的下游纯化。

具体实施方式

实施例1：

本实施例中采用的基础介质为聚甲基丙烯酸酯微球，品名为Monomix MC30-SEC-1000(货号：280130950)，规格为：粒径30m单分散，孔径

[S01]-001

用量筒取5L Monomix MC30-SEC-1000于20L反应釜中，加入5L 1mol/L氢氧化钠溶液并开启机械搅拌至50rpm，运行10min后一次性加入5L 1，4-丁二醇二缩水甘油醚，将温度升高至45℃并连续搅拌反应4h，结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，然后用5L无水乙醇清洗5次，用水清洗至滤液为中性。

[S02]-001

将清洗后的介质转移至20L反应釜中，加入10L 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 值为9.5)，含有3mg/mL Oligo dT20，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至30℃，运行10min后一次性加入硫酸钠使其浓度为0.5mol/L，然后连续反应2h。反应结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，接着用10L 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.5) 清洗介质三次，收集反应后滤液及3次清洗滤液。

[S03]-001

将偶联有Oligo dT20的介质转移至20L反应釜中，加入5L 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)，包含0.1mol/L乙醇胺，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至 30℃，然后连续反应2h。结束后用布氏漏斗过滤介质，依次用50L水、50L 1mol/L NaCl、 50L水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

本实施例中，Oligo dT20的偶联效率为40％，偶联至每L介质上的Oligo dT20质量为2.4g。

实施例2：

本实施例中采用的基础介质为聚甲基丙烯酸酯微球，品名为Monomix MC60-SEC-1000(货号：280160950)，规格为：粒径60m单分散，孔径

[S01]-002

用量筒取2.5L Monomix MC60-SEC-1000于10L反应釜中，加入2.5L 1.2mol/L氢氧化钠溶液并开启机械搅拌至50rpm，运行10min后一次性加入2.5L 1，6-己二醇二缩水甘油醚，将温度升高至35℃并连续搅拌反应3h，结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，然后用2.5L无水乙醇清洗5次，用水清洗至滤液为中性。

[S02]-002

将清洗后的介质转移至10L反应釜中，加入2.L 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)，含有4mg/mL Oligo dT30，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至30℃，运行10min后一次性加入硫酸钠使其浓度为1.3mol/L，然后连续反应10h。反应结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，接着用2.5L 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.5) 清洗介质三次，收集反应后滤液及3次清洗滤液。

[S03]-002

将偶联有Oligo dT30的介质转移至10L反应釜中，加入2.5L 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)，包含0.5mol/L乙醇胺，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至30℃，然后连续反应2h。结束后用布氏漏斗过滤介质，依次用25L水、25L 1mol/L NaCl、25L水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

本实施例中，Oligo dT30的偶联效率为70％，偶联至每L介质上的Oligo dT30质量为2.8g。

实施例3：

本实施例中采用的基础介质为聚甲基丙烯酸酯微球，品名为Monomix MC30-SEC-1000(货号：280130950)，规格为：粒径30m单分散，孔径

[S01]-003

用量筒取500mL Monomix MC30-SEC-1000于2L反应釜中，加入500mL 0.3mol/L 氢氧化钠溶液并开启机械搅拌至50rpm，运行10min后一次性加入500mL 1，2-乙二醇二缩水甘油醚，将温度升高至37℃并连续搅拌反应5h，结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，然后用5L无水乙醇清洗5次，用水清洗至滤液为中性。

接着将清洗干净的介质转移到2L反应釜中，加入500mL 2mol/L硫酸溶液，在25℃条件下，50rpm机械搅拌反应2h，用布氏漏斗抽滤介质并用水清洗至滤液为中性。最后将介质转移到2L反应釜中，加入500mL 0.3mol/L高碘酸钠溶液，在25℃条件下， 50rpm机械搅拌反应3h，用布氏漏斗抽滤介质并用5L水清洗介质。

[S02]-003

将活化好的介质转移至2L反应釜中，加入500mL 150mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 值为8.0)，含有8mg/mL Oligo dT15，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至45℃，运行10min后加入硫酸钠使其浓度为2mol/L、加入氰基硼氢化钠使其浓度为15 mmol/L，然后连续反应10h。反应结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，接着500mL150 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为8.0)清洗介质三次，收集反应后滤液及3次清洗滤液。

[S03]-003

将偶联有Oligo dT15的介质转移至2L反应釜中，加入500mL 150mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为8.0)，包含1mol/L乙醇胺，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至 45℃，然后连续反应2h。结束后用布氏漏斗过滤介质，依次用5L水、5L 1mol/LNaCl、 5L水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

本实施例中，Oligo dT15的偶联效率为50％，偶联至每L介质上的Oligo dT15质量为4.0g。

实施例4：

本实施例中采用的基础介质为聚甲基丙烯酸酯微球，品名为Polar MC60-SEC(货号：190160800)，规格为：粒径60m多分散，孔径

[S01]-004

用量筒取1L Polar MC60-SEC于5L反应釜中，加入1L 0.6mol/L氢氧化钠溶液并开启机械搅拌至50rpm，运行10min后一次性加入1L丙三醇三缩水甘油醚，将温度升高至40℃并连续搅拌反应5h，结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，然后用1L无水乙醇清洗5次，用水清洗至滤液为中性。

接着将清洗干净的介质转移到5L反应釜中，加入1L 1.5mol/L硫酸溶液，在30℃条件下，50rpm机械搅拌反应3h，用布氏漏斗抽滤介质并用水清洗至滤液为中性。

最后将介质转移到5L反应釜中，加入5L 0.2mol/L高碘酸钠溶液，在25℃条件下，50 rpm机械搅拌反应3h，用布氏漏斗抽滤介质并用10L水清洗介质。

[S02]-004

将活化好的介质转移至5L反应釜中，加入1L 150mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.0)，含有6mg/mL Oligo dT25，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至40℃，运行10min后加入硫酸钠使其浓度为1.5mol/L、加入氰基硼氢化钠使其浓度为15mmol/L，然后连续反应10h。反应结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，接着用1L 150mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH值为7.0)清洗介质三次，收集反应后滤液及3次清洗滤液。

[S03]-004

将偶联有Oligo dT25的介质转移至5L反应釜中，加入1L 150mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.0)，包含1mol/L乙醇胺，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至40℃，然后连续反应2h。结束后用布氏漏斗过滤介质，依次用10L水、10L 1mol/L NaCl、 10L水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

本实施例中，Oligo dT25的偶联效率为55％，偶联至每L介质上的Oligo dT25质量为3.3g。

实施例5：

本实施例中采用的基础介质为琼脂糖微球，品名为Agarosix-45(货号：250145990)，粒径规格为45m，由苏州赛分科技有限公司自行生产，其余原料为市售，其中Oligo dT的碱基长度为20。

[S01]-005

用量筒取200mL Agarosix-45于1L反应釜中，加入200mL 0.5mol/L高碘酸钠溶液并开启机械搅拌至50rpm，在25℃条件下连续搅拌反应1.5h，结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，然后用2L水清洗介质。

[S02]-005

将活化好的介质转移至1L反应釜中，加入200mL100mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 值为7.0)，含有3mg/mL Oligo dT20，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至40℃，运行10min后加入硫酸钠使其浓度为1.5mol/L、加入氰基硼氢化钠使其浓度为10 mmol/L，然后连续反应14h。反应结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，接着用200mL 150mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.0)清洗介质三次，收集反应后滤液及3次清洗滤液。

[S03]-005

将偶联有Oligo dT20的介质转移至1L反应釜中，加入200mL 150mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.0)，包含0.5mol/L乙醇胺，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至40℃，然后连续反应3h。结束后用布氏漏斗过滤介质，依次用2L水、2L 1mol/L NaCl、 2L水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

本实施例中，Oligo dT20的偶联效率为90％，偶联至每L介质上的Oligo dT20质量为2.7g。

实施例6：

本实施例中采用的基础介质为表面经过亲水修饰的聚乙烯-二乙烯基苯微球，品名为Proteomix 10-SEC-2000(货号：221020980)，规格为：粒径20m单分散，孔径

[S01]-006

用量筒取50mLProteomix 10-SEC-2000于200mL反应釜中，加入50mL 1mol/L 氢氧化钠溶液并开启机械搅拌至50rpm，运行10min后一次性加入50mL 1，3-丙二醇二缩水甘油醚，将温度升高至45℃并连续搅拌反应4h，结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，然后用50mL无水乙醇清洗5次，用水清洗至滤液为中性。

[S02]-006

将清洗后的介质转移至200mL反应釜中，加入100mL 100mmol/L碳酸盐缓冲液 (pH值为9.5)，含有3mg/mL Oligo dT20，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至 30℃，运行10min后一次性加入硫酸钠使其浓度为0.5mol/L，然后连续反应2h。反应结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，接着用100mL 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 值为9.5)清洗介质三次，收集反应后滤液及3次清洗滤液。

[S03]-006

将偶联有Oligo dT20的介质转移至200mL反应釜中，加入50mL 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)，包含0.1mol/L乙醇胺，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至30℃，然后连续反应2h。结束后用布氏漏斗过滤介质，依次用500mL水、500mL 1mol/LNaCl、500mL水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

本实施例中，Oligo dT20的偶联效率为55％，偶联至每L介质上的Oligo dT20质量为3.3g。

实施例7：

本实施例中采用的基础介质为聚甲基丙烯酸酯无孔微球，品名为Monomix 10NP-OH(货号：284610001)，规格为：粒径10m单分散，无孔基球，微球经过亲水性修饰，由苏州赛分科技有限公司自行生产，其余原料为市售，其中Oligo dT的碱基长度为20。

[S01]-007

用量筒取100mL Monomix 10NP-OH于500mL反应釜中，加入100mL 1mol/L氢氧化钠溶液并开启机械搅拌至50rpm，运行10min后一次性加入100mL 1，4-丁二醇二缩水甘油醚，将温度升高至45℃并连续搅拌反应4h，结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，然后用100mL无水乙醇清洗5次，用水清洗至滤液为中性。

[S02]-001

将清洗后的介质转移至500mL反应釜中，加入200mL 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)，含有0.5mg/mL Oligo dT20，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至 30℃，运行10min后一次性加入硫酸钠使其浓度为1.5mol/L，然后连续反应2h。反应结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，接着用200mL 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 值为9.5)清洗介质三次，收集反应后滤液及3次清洗滤液。

[S03]-001

将偶联有Oligo dT20的介质转移至500mL反应釜中，加入100mL 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.5)，包含0.1mol/L乙醇胺，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至30℃，然后连续反应2h。结束后用布氏漏斗过滤介质，依次用1L水、1L 1mol/L NaCl、1L水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

本实施例中，Oligo dT20的偶联效率为35％，偶联至每L介质上的Oligo dT20质量为0.35g

实施例8：

本实施例中采用的基础介质为表面经过亲水修饰的聚乙烯-二乙烯基苯无孔微球，品名为Proteomix 5NP-OH(货号：222005001)，规格为：粒径5m单分散，无孔基球，由苏州赛分科技有限公司自行生产，其余原料为市售，其中Oligo dT的碱基长度为 25。

[S01]-008

用量筒取500mL Proteomix 5NP-OH于2L反应釜中，加入500mL 0.6mol/L氢氧化钠溶液并开启机械搅拌至50rpm，运行10min后一次性加入500mL 1，6-己二醇二缩水甘油醚，将温度升高至40℃并连续搅拌反应4h，结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，然后用500mL无水乙醇清洗5次，用水清洗至滤液为中性。

接着将清洗干净的介质转移到2L反应釜中，加入500mL 1.0mol/L硫酸溶液，在 30℃条件下，50rpm机械搅拌反应3h，用布氏漏斗抽滤介质并用水清洗至滤液为中性。最后将介质转移到2L反应釜中，加入500mL 0.3mol/L高碘酸钠溶液，在25℃条件下， 50rpm机械搅拌反应3h，用布氏漏斗抽滤介质并用5L水清洗介质。

[S02]-008

将活化好的介质转移至2L反应釜中，加入500mL 150mmol/L磷酸盐缓冲液(pH 值为7.2)，含有0.5mg/mL Oligo dT25，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至40℃，运行10min后加入硫酸钠使其浓度为1.5mol/L、加入氰基硼氢化钠使其浓度为10 mmol/L，然后连续反应8h。反应结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，接着用500mL 150mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.2)清洗介质三次，收集反应后滤液及3次清洗滤液。

[S03]-008

将偶联有Oligo dT25的介质转移至2L反应釜中，加入500mL 150mmol/L磷酸盐缓冲液(pH值为7.2)，包含1mol/L乙醇胺，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至40℃，然后连续反应2h。结束后用布氏漏斗过滤介质，依次用5L水、5L 1mol/LNaCl、5L 水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

本实施例中，Oligo dT25的偶联效率为40％，偶联至每L介质上的Oligo dT25质量为0.4g。

实施例9：

本实施例中采用的基础介质为硅胶微球，品名为HP-Diol 10-2000(货号：120410981)，规格为：粒径10m，孔径

[S01]-009

用量筒取100mL HP-Diol 10-2000于500mL反应釜中，加入100mL 0.2mol/L氢氧化钠溶液并开启机械搅拌至50rpm，运行10min后一次性加入100mL 1，2-乙二醇二缩水甘油醚，将温度升高至45℃并连续搅拌反应5h，结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，然后用100mL无水乙醇清洗5次，用水清洗至滤液为中性。

[S02]-009

将清洗后的介质转移至500mL反应釜中，加入200mL 100mmol/L碳酸盐缓冲液 (pH值为9.0)，含有2.5mg/mL Oligo dT30，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至30℃，运行10min后一次性加入硫酸钠使其浓度为1.0mol/L，然后连续反应3h。反应结束后将介质转移至布氏漏斗并抽滤，接着用200mL 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH 值为9.0)清洗介质三次，收集反应后滤液及3次清洗滤液。

[S03]-009

将偶联有Oligo dT30的介质转移至500mL反应釜中，加入100mL 100mmol/L碳酸盐缓冲液(pH值为9.0)，包含0.1mol/L乙醇胺，开启机械搅拌至50rpm并将温度升高至30℃，然后连续反应3。结束后用布氏漏斗过滤介质，依次用1L水、1L 1mol/L NaCl、1L水清洗介质，最终将介质保存在20％乙醇中，2-8℃冷藏。

本实施例中，Oligo dT30的偶联效率为40％，偶联至每L介质上的Oligo dT30质量为2.0g。