基因工程菌的冻干保藏方法

技术领域

本发明涉及菌种保藏技术领域，尤其涉及一种基因工程菌的冻干保藏方法。

背景技术

在当前技术中，工程菌是指利用合成生物学手段，通过导入重组质粒，使得原有菌种具备并有能力形式特定的功能，以满足生产生活需要。日前，大多数工程菌的应用场景需要在常温环境下行使其功能，而最广泛的菌种保藏方案并不能满足这一需求，需要探求常温保藏的手段。实现常温保藏需要改变菌种的存在形式，即将最为广泛的以甘油与细菌混合液进行超低温冷藏所形成的冻存态转变为干粉形式。制成干粉需要利用冻干技术。但是，对于仍有应用需求的工程菌而言，冻干流程的环境条件极端，单独依靠菌种自身很难在冻干中存活，因而会使存活率大幅下降，则下一步需要工程菌应用之时的效果也会随之受到影响。因此，本发明旨在通过冻干实现常温保藏的同时，通过基因工程的手段提高菌种对于冻干的抗逆性。

目前常规的菌种保藏方法主要是超低温保藏法。作为各个实验室普遍选用的方法，超低温保藏法需要用到甘油和-80℃冰箱，而这两者在普通用户家庭中是不具备的，因此该方法不可行。

根据申请专利公布号CN101264062A的技术方案，该项专利里选择常见的脱脂牛奶和海藻糖等作为冻干过程的保护剂，实现了工程菌感受态细胞在-20℃-4℃的低温保存，但并未实现室温储存，且所选用的冻干保护剂仍存在冷冻过程形成冰晶破坏细胞膜的风险。

根据申请专利公布号CN109055227A的技术方案，该项专利在一定程度上维持了大肠杆菌BL21(DE3)细胞在冻干后的存活率，但是所选用的保护剂是由菌种发酵物、人血清白蛋白等物质混合而成的，并不适宜量产，成本较高。

目前工程菌在冻干后的存活率基本维持在10％左右，处于较低水平，不利于现有工程菌投入实际应用。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本发明的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

发明内容

基于上述原因，本申请人提出了一种基因工程菌的冻干保藏方法，旨在解决上述问题的至少一项。

为了满足上述要求，本发明的目的在于提供一种基因工程菌的冻干保藏方法，包括以下步骤：

将水熊虫TDP蛋白的基因序列构建到pET-28a表达载体上，获得已导入编码水熊虫TDP蛋白的序列的重组质粒；

将所述重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞中，获得已转化的菌液，将所述菌液涂布在LB培养基上；

挑取前一日培养的单克隆菌落，将所述单克隆菌落接种至液体培养基中进行扩大培养，检测所述液体培养基中的菌液的吸光值，获取600nm波长处的吸光值在0.4-0.6之间的待操作菌液；

根据所述待操作菌液的吸光值，取每毫升10^9个细胞的所述待操作菌液进行离心，离心完成后清除上清液，取葡萄糖溶液对菌体沉淀进行吹息，获得混合液；

将所述混合液转移至试管内，将所述试管放入冻干机，依次进行冷冻、真空抽干，从而完成冻干保藏。

在本发明的一些实施方式中，所述大肠杆菌感受态细胞的种类为BL21(DE3)。

在本发明的一些实施方式中，所述检测所述液体培养基中的菌液的吸光值的步骤包括，间隔一段时间多次对所述液体培养基中的菌液的吸光值进行测量。

在本发明的一些实施方式中，所述取每毫升10^9个细胞的所述待操作菌液进行离心的步骤包括，以4000rpm/min的速度进行离心3-6分钟。

在本发明的一些实施方式中，所述取葡萄糖溶液对菌体沉淀进行吹息的步骤包括，取100微升0.3％葡萄糖溶液。

在本发明的一些实施方式中，所述试管为15ml试管。

在本发明的一些实施方式中，所述依次进行冷冻、真空抽干的步骤包括，在-50℃至-90℃条件下冷冻1-3小时。

在本发明的一些实施方式中，所述依次进行冷冻、真空抽干的步骤还包括，在1Pa压强条件下真空抽干6-12小时。

在本发明的一些实施方式中，方法还包括，在完成冻干保藏的样品中加入无菌水将底部固体溶解以完成复苏。

在本发明的一些实施方式中，所述无菌水的体积为0.5-1.5ml。

相比于现有技术,本发明的有益效果在于：采用本申请提出的方案，利用水熊虫内在无序蛋白(TDPs)能够在冻干条件下保护不同的大肠杆菌菌株，并允许细菌随后在室温下保存。

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。

附图说明

图1是本发明基因工程菌的冻干保藏方法的流程示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不应理解为必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例进行接合和组合。

实施例

如图1所示：

步骤S101：将水熊虫TDP蛋白的基因序列构建到pET-28a表达载体上，之后将该重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)细胞中，在LB培养基上取转化的菌液进行涂布。

在某些实施例中，本步骤的水熊虫TDP蛋白的基因序列可采用CAHS 106094蛋白替换，利用CAHS 106094蛋白进行的冻干过程中的活力丧失表现出最显着的保护作用，并且它可以与SAHS 33020蛋白共表达以进一步提高细菌的存活率。

步骤S102.挑取前一日培养的单克隆菌落，将单克隆菌落接种到液体培养基中进行扩大培养，间隔一段时间进行吸光值的测量，取600nm波长处的吸光值处于0.4-0.6范围内的菌液进行后续操作。

步骤S103：根据菌液在600nm波长处的吸光值的数值进行换算，取每毫升10^9个细胞的菌液进行4000rpm/min离心5分钟，离心完成之后，倒掉上清液，取100微升0.3％葡萄糖溶液对菌体沉淀进行吹息，将混合液移至15mL管内。

步骤S104：将上述样品放入冻干机中，在-70℃条件下冷冻2小时，之后在1Pa条件下真空抽干6-12小时。

步骤S105：加入1mL无菌水将底部固体溶解，冻干后的样品完成复苏。

对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其他各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变应该属于本发明权利要求的保护范围之内。