连接有非甾体抗炎化合物的海藻酸衍生物
文献发布时间：2023-11-17 06:30:03
本发明申请是PCT专利申请PCT/JP2019/011715，申请日为2019年3月20日、发明名称为“连接有非甾体抗炎化合物的海藻酸衍生物”的发明专利申请的分案申请，母案进入中国的申请号为201980019983.4。
技术领域
本发明涉及海藻酸与非甾体抗炎化合物经由连接体以共价键连接的水溶性海藻酸衍生物等、和含有其的缓释性药物组合物。
背景技术
海藻酸是从褐藻类提取的由β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸形成的高分子多糖，其没有毒性，由于在生物体内没有特定的分解酶，因此难以分解，具有生物体适性，另外其为非免疫原性。进而还具有通过与钙等2价金属离子交联而形成凝胶这样的特性。利用这样的海藻酸的性质，可作为工业用、食品用、进而药品添加物使用。近年来，进而作为药物的主剂，提出了创伤被覆用途(日本特开2007-75425号公报(专利文献1))、软骨疾病治疗用途(国际公开第2008/102855号公报(专利文献2))、关节风湿病治疗用途(国际公开第2009/54181号公报(专利文献3))和椎间盘治疗用途(国际公开第2017/163603号公报(专利文献4))。
另一方面，作为由关节病导致的疼痛的抑制剂和缓和剂，广泛使用了非甾体性抗炎剂(以下也称为NSAIDs)。一般而言，在使用NSAIDs作为这些疼痛的抑制剂和缓和剂的情况下，可作为口服施用剂型、透皮吸收型制剂使用。然而，对于含有NSAIDs的口服施用剂型而言，为了使有效量的NSAIDs到达患部，有需要大量服用的情况，存在设想以外的可对消化器系等产生副作用这样的问题。另外，对于透皮吸收型剂型而言，由于在从与患部(关节)的接触开始起至接触结束为止被吸收的NSAIDs的量不恒定，从而有效果不稳定的情况，另外在使用含有高浓度NSAIDs的透皮吸收型制剂的情况下，存在引起设想以外的接触皮炎等副作用这样的问题。
因此，依照上述问题，例如在国际公开第2005/66214号公报(专利文献5)或BMCMusculoskelet Disord.2018；19：157.(非专利文献3)中，公开了制作在作为关节病的治疗剂的透明质酸钠中化学性导入了NSAIDs、抗风湿药(DMARDs)的新型衍生物、并通过将其注入患部，从而提供能够大大有助于关节病所伴随的疼痛的缓和、抑制和关节病的根本治疗的药剂，以及公开了具有由控制NSAIDs、DMARDs的释放所产生的持续性效果的药剂。另外，在国际公开第2015/5458号公报(专利文献6)中，记载了提供可不较大依赖药物的结构而控制药物游离速度、根据适用的疾病导入了以合适的速度游离的药物的糖胺聚糖衍生物和其制造方法。另外，在国际公开第2007/4675号公报(专利文献7)中，公开了导入了NSAIDs、DMARDs等药剂和光反应性基团的透明质酸衍生物和光交联过的透明质酸衍生物凝胶，记载了提供提高药剂缓释性的制剂。另外，在Journal of Young Pharmacists(2009)，1(4)，301-304(非专利文献1)、Pharmaceutica Acta Helvetiae(1997)，72(3)，159-164(非专利文献2)中，公开了在中性下确认双氯芬酸数小时持续释放的、将海藻酸和双氯芬酸的混合物用钙离子交联而得的珠子。另外，其他虽然没有公开NSAIDs、DMARDs，但在日本特开平08-24325号公报(专利文献8)中，记载了可仅在产生酶的病灶部位释放治疗有效量的药剂的医疗用高分子凝胶，以及提供透明性高、生物体亲和性和耐热性、稳定性优异、作为创伤被覆材料、生物体组织粘合剂、防粘连材料等各种医疗用材料的构成成分有用的水溶胀性高分子凝胶。
另外，在日本特表平08-502053号公报(专利文献9)中，公开了经由对酸不稳定的生物分解性间隔体连接的藻酸盐-生物活性剂配合体。记载了该配合体对于将生物活性剂递送至存在于低pH环境中的靶标的表面或内部中是有效的，与生物活性物质(包括药物和前药)共价连接的藻酸盐可用于控制物质的释放速度。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2007-75425号公报
专利文献2：国际公开第2008/102855号公报
专利文献3：国际公开第2009/54181号公报
专利文献4：国际公开第2017/163603号公报
专利文献5：国际公开第2005/66214号公报
专利文献6：国际公开第2015/5458号公报
专利文献7：国际公开第2007/4675号公报
专利文献8：日本特开平08-24325号公报
专利文献9：日本特表平08-502053号公报。
非专利文献
非专利文献1：Journal of Young Pharmacists(2009)，1(4)，301-304
非专利文献2：Pharmaceutica Acta Helvetiae(1997)，72(3)，159-164
非专利文献3：BMC Musculoskelet Disord.2018；19：157。
发明内容
发明要解决的课题
但是，含有以往的NSAIDs的缓释性制剂尚未达到广泛的实用化。例如，提出了使用了透明质酸作为基材的含有NSAIDs的缓释性制剂，但透明质酸通过在生物体内存在的酶(透明质酸酶)而被分解，有对NSAIDs的释放产生影响的担心。另外，对于形成可成为新的基材的选项的源于植物、褐藻类的基材的、含有NSAIDs的缓释性制剂而言，仍未实现充分的缓释本身。
基于这样的课题，本发明的目的是提供可在缓释性制剂中使用的水溶性化合物，其使用海藻酸作为可成为新基材的选项的基材，可在生物体内稳定释放一定的有效成分。
用于解决课题的方案
本发明人为了解决上述课题而进行努力研究，结果发现：具有利用特定的连接体使海藻酸或其盐与非甾体抗炎化合物共价连接的结构的海藻酸衍生物为水溶性，通过将其作为缓释性制剂使用，预料不到地能够长期、稳定地将非甾体抗炎化合物送至患部，从而完成了本发明。
即，本发明如以下这样构成：
本发明的其他方式可以是如以下〔1〕～〔14〕所述。
〔1〕水溶性海藻酸衍生物，其具有海藻酸或其盐与非甾体抗炎化合物经由连接体共价连接的结构。
〔1a〕根据前述〔1〕的水溶性海藻酸衍生物，其中，连接体为2价的连接体。
〔2〕根据前述〔1〕所述的水溶性海藻酸衍生物，其具有下述式(1)表示的结构：
(A)-L-(D) (1)
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其表示具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基，
(D)表示非甾体抗炎化合物的一个残基，
L为具有能够以酰胺键与(A)连接的官能团、且具有能够以酯键与(D)连接的官能团的连接体)。
〔3〕根据前述〔1〕所述的水溶性海藻酸衍生物，其具有下述式(2)表示的结构：
(A)-NH-(CH
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其表示具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基，
(D)表示非甾体抗炎化合物的一个残基，
X
R
Y表示环烷烃环、芳族环或杂环(前述环烷烃环、芳族环或杂环可被卤素原子或C
Z表示用于与(D)形成酯键的O或C(＝O)，
n1表示0～10的任一整数，n2～n8独立地表示0～3的任一整数，但n1～n8不全部为0)。
〔3a〕根据前述〔1〕所述的水溶性海藻酸衍生物，其由下述式(2a)表示：
[化学式1]
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的一个残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基，；
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；
X
R
Y为C
Z为氧原子或羰基；
n1或n8为0～10的任一整数；
n3、n5、或n6独立地是0、1、2、3的任一整数；
n2、n4、或n7独立地是0或1的整数；
但是，n1～n8不全部为0)。
〔4〕根据前述〔1〕～〔3〕中任一项所述的水溶性海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物具有羧基，前述羧基与连接体连接。
〔4a〕根据前述〔1a〕、〔2〕和〔3a〕中任一项所述的海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物具有羧基，该羧基与下述式(LKA-1)[式中虚线左侧除外]或式(LKA-2)[式中虚线左侧除外]表示连接体连接，
[化学式2]
(式中，-L-和(A)的定义与前述〔2a〕中的定义相同)
[化学式3]
(式中，(A)、R
〔5〕根据前述〔1〕～〔4〕中任一项所述的水溶性海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物为水杨酸系、丙酸系、或醋酸系的非甾体性抗炎药(NSAIDs)，NSAIDs的羧基与连接体连接。
〔5a〕根据前述〔1a〕、〔2〕、〔3a〕和〔4a〕中任一项所述的海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物为水杨酸系、丙酸系、或苯基醋酸系的非甾体性抗炎药(NSAIDs)，NSAIDs的羧基与前述〔4a〕中所述的式(LKA-1)或式(LKA-2)所示的连接体连接。
〔6〕根据前述〔5〕所述的水溶性海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物为醋酸系的非甾体性抗炎药(NSAIDs)。
〔6a〕根据前述〔5a〕所述的海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物为苯基醋酸系的非甾体性抗炎药(NSAIDs)。
〔6a-1〕根据前述〔5a〕所述的海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物为丙酸系的非甾体性抗炎药(NSAIDs)。
〔7〕根据前述〔6〕所述的水溶性海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物为双氯芬酸。
〔7a〕根据前述〔6a〕所述的水溶性海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物为双氯芬酸或联苯乙酸。
〔7a-1〕根据前述〔6a-1〕所述的水溶性海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物为酮洛芬或萘普生。
〔8〕根据前述〔1〕～〔7〕中任一项所述的水溶性海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物的导入率(摩尔％)为至少1.0摩尔％以上。
〔8a〕根据前述〔1a〕、〔2〕、〔3a〕、〔4a〕、〔5a〕、〔6a〕、〔6a-1〕、〔7a〕和〔7a-1〕中任一项所述的海藻酸衍生物，其中，非甾体抗炎化合物的导入率(摩尔％)为至少1.0摩尔％以上。
〔9〕海藻酸衍生物凝胶，其通过将前述〔1〕～〔8〕中任一项所述的水溶性海藻酸衍生物交联而成。
〔9a〕海藻酸衍生物凝胶，其通过将前述〔1a〕、〔2〕、〔3a〕、〔4a〕、〔5a〕、〔6a〕、〔6a-1〕、〔7a〕、〔7a-1〕和〔8a〕中任一项所述的海藻酸衍生物交联而成。
〔10〕缓释性药物组合物，其含有前述〔1〕～〔8〕中任一项所述的水溶性海藻酸衍生物、或前述〔9〕所述的海藻酸衍生物凝胶。
〔10a〕缓释性药物组合物，其含有前述〔1a〕、〔2〕、〔3a〕、〔4a〕、〔5a〕、〔6a〕、〔6a-1〕、〔7a〕、〔7a-1〕和〔8a〕中任一项所述的海藻酸衍生物、或前述〔9a〕所述的海藻酸衍生物凝胶。
〔11〕根据前述〔10〕所述的缓释性药物组合物，其用作关节炎治疗剂。
〔11a〕根据前述〔10a〕所述的缓释性药物组合物，其用作关节炎治疗剂。
〔12〕前述〔1〕～〔8〕中任一项所述的水溶性海藻酸衍生物、或前述〔9〕所述的海藻酸衍生物凝胶用于使非甾体抗炎化合物缓释的用途。
〔12a〕前述〔1a〕、〔2〕、〔3a〕、〔4a〕、〔5a〕、〔6a〕、〔6a-1〕、〔7a〕、〔7a-1〕和〔8a〕中任一项所述的海藻酸衍生物、或前述〔9a〕所述的海藻酸衍生物凝胶用于使非甾体抗炎化合物缓释的用途。
〔13〕在前述〔3a〕的式(2)的海藻酸衍生物中，作为优选的物质，选自以下列举的海藻酸衍生物。(各式中，(A)为源于海藻酸或其盐的一个残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基)
[化学式4]
〔14〕下述式(AM)所示的氨基化合物、其盐、或它们的水合物：[化学式5]
(式中，(D)、X
发明的效果
本发明可以提供能够以稳定的速度释放非甾体抗炎化合物的、可在缓释性制剂中使用的水溶性的化合物。另外，可以提供通过凝胶化，可进而提高该化合物的缓释性的水溶性的化合物。
具体实施方式
<水溶性海藻酸衍生物>
本发明涉及具有海藻酸或其盐与非甾体抗炎化合物经由连接体共价连接的结构的水溶性海藻酸衍生物。连接体优选通过共价键与海藻酸或其盐的羧基、和非甾体抗炎化合物的羧基或羟基连接。连接方式只要可实现本发明的目的就没有特别限定，但优选在水溶性海藻酸衍生物中，海藻酸与连接体的连接为酰胺键，非甾体抗炎化合物与连接体的连接为酯键。海藻酸或其盐中的、与连接体的连接部位(海藻酸或其盐的官能团)可列举羟基或羧基，但更优选为能够形成酰胺键的羧基。
因此，作为本发明的一个方式，水溶性海藻酸衍生物具有下述式(1)表示的结构：
(A)-L-(D) (1)
在式(1)中，(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其表示具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基。另外，在式(1)中，L为具有能够以酰胺键与(A)连接的官能团、且具有能够以酯键与(D)连接的官能团的连接体。另外，在式(1)中，(D)表示非甾体抗炎化合物的一个残基，该(D)的一个残基可以为羟基，也可以为羧基，优选为羧基。
另外，作为本发明的另外一个方式，水溶性海藻酸衍生物为具有下述式(1)表示的结构的海藻酸衍生物：
[化学式6]
(D)-L-(A) (1)
(在式(1)中，(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其表示具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基；
(D)表示非甾体抗炎化合物的一个残基，该(D)的一个残基为羟基或羧基，优选为羧基；
-L-为下述部分结构式(LS-1)[式中虚线外侧除外]：
[化学式7]
(式中，-L
Z为氧原子或羰基，优选为氧原子)。
进一步地，作为本发明的一个方式，水溶性海藻酸衍生物具有下述式(2)表示的结构：
(A)-NH-(CH
在式(2)中，(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其表示具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基，(D)表示非甾体抗炎化合物的一个残基，X
另外，作为本发明的另外一个方式，水溶性海藻酸衍生物为具有下述式(2a)表示的结构的水溶性海藻酸衍生物：
[化学式8]
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的一个残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基，；
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；
X
R
Y为C
Z为氧原子或羰基；
n1为0～5的任一整数；
n8为0～10的任一整数；
n3、n5、或n6独立地为0、1、2、3的任一整数；
n2、n4、或n7独立地为0或1的整数；
n1～n8不全部为0；n3、n5、n6和n8总计优选为1～12，更优选为2～10)。
进一步地，作为本发明的另外一个方式，水溶性海藻酸衍生物为具有下述式(2a)表示的结构的水溶性海藻酸衍生物：
[化学式9]
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基；
(D)为选自双氯芬酸、酮洛芬、萘普生、和联苯乙酸中的非甾体抗炎化合物的一个残基；
X
R
Y为苯环或哌啶环；
Z为氧原子；
n1为0～2的任一整数；
n8为0～6的任一整数；
n3、n5、或n6独立地为0或1的整数；
n2、n4、或n7独立地为0或1的整数；
n1～n8不全部为0；n3、n5、n6和n8总计优选为1～12，更优选为2～10)。
在式(2)中，优选的水溶性海藻酸衍生物具有下述式(3)～(6)表示的结构：
(A)-NH-(CH
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其表示具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基，
(D)表示非甾体抗炎化合物的一个残基，
对于R
Z表示用于与(D)形成酯键的O，
n1、n3和n5总计表示1～4的任一整数)。
(A)-NH-(CH
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其表示具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基，
(D)表示非甾体抗炎化合物的一个残基，
X1表示O或NH，
对于R1和R
X1为O的情况下，R1优选为氢，R
X1为NH的情况下，R1优选为氢，R
对于R3和R
Z表示用于与(D)形成酯键的O，
n1表示1～3的任一整数，n3、n6和n8总计表示1～3的任一整数)。
(A)-NH-(CH
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其表示具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基，
(D)表示非甾体抗炎化合物的一个残基，
Y表示芳族环，
Z表示用于与(D)形成酯键的O，
n1和n5总计表示1～4的任一整数)。
(A)-NH-(CH
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其表示具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基，
(D)表示非甾体抗炎化合物的一个残基，
对于R
对于R
Z表示用于与(D)形成酯键的O，
n1、n3、n5、n6和n8总计表示1～4的任一整数)。
另外，在式(2a)中，优选的水溶性海藻酸衍生物是具有下述式(3a)表示的结构的水溶性海藻酸衍生物：
[化学式10]
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基；
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；优选为双氯芬酸的一个残基；
R
Z为氧原子；
n1、n3和n5总计为1～4的任一整数)。
另外，作为式(3a)的具体的化合物，例如为选自下述式中的水溶性海藻酸衍生物：
[化学式11]
(各式中，(A)为源于海藻酸或其盐的一个残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基)。
另外，在式(2a)中，优选的水溶性海藻酸衍生物是具有下述式(4a)表示的结构的水溶性海藻酸衍生物，
[化学式12]
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基；
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；优选为双氯芬酸的一个残基；
X
R
Z表示氧原子，
n1表示1～3的任一整数，n3、n6和n8总计为1～3的任一整数)。
另外，作为式(4a)的具体物质，例如是选自下述式中的海藻酸衍生物：
[化学式13]
(各式中，(A)为源于海藻酸或其盐的一个残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基)。
另外，在式(2a)中，优选的水溶性海藻酸衍生物是具有下述式(5a)表示的结构的水溶性海藻酸衍生物，
[化学式14]
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基；
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；优选为双氯芬酸的一个残基；
Y为C
Z为氧原子；
n1和n5总计为1～4的任一整数)。
另外，作为式(5a)的具体物质，例如是选自下述式中的水溶性海藻酸衍生物：
[化学式15]
(各式中，(A)为源于海藻酸或其盐的一个残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基)。
或者在式(2a)中，优选的水溶性海藻酸衍生物是具有下述式(6a)表示的结构的水溶性海藻酸衍生物，
[化学式16]
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基；
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；优选为双氯芬酸的一个残基；
R
R
R
Z为氧原子；
n1、n3、n5、n6和n8总计为1～4的任一整数)。
另外，作为式(6a)的具体物质，例如是选自下述式中的水溶性海藻酸衍生物：
[化学式17]
(各式中，(A)为源于海藻酸或其盐的一个残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基)。
另外，在式(2a)中，优选的水溶性海藻酸衍生物是具有下述式(7a)表示的结构的海藻酸衍生物，
[化学式18]
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基；
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；优选为选自双氯芬酸、酮洛芬、萘普生、和联苯乙酸中的非甾体抗炎化合物的一个残基；
R
R
X
Z为氧原子；
n1、n3、和n8总计为1～10的任一整数)。
另外，作为式(7a)的具体物质，例如是选自下述式中的水溶性海藻酸衍生物：
[化学式19]
(各式中，(A)为源于海藻酸或其盐的一个残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基)。
另外，在式(2a)中，优选的水溶性海藻酸衍生物是具有下述式(8a)表示的结构的海藻酸衍生物，
[化学式20]
(式中，
(A)为源于海藻酸或其盐的残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基；
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；优选为双氯芬酸的一个残基；
R
R
Y为杂环；优选为哌啶环；
Z为氧原子；、
n1、n3、和n8总计为1～5的任一整数)。
另外，作为式(8a)的、具体的化合物，例如有选自下述式中的水溶性海藻酸衍生物：
[化学式21]
(各式中，(A)为源于海藻酸或其盐的一个残基，其为具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸中的任一单糖的C(＝O)-基的一个残基)。应予说明，对于本发明的水溶性海藻酸衍生物的连接体结构，在<<连接体>>项中如下所述。
另外，在本发明的水溶性海藻酸衍生物中，优选为能够以在体内难以产生副作用、可适当地使例如关节炎缓和、镇痛的浓度使非甾体抗炎化合物持续释放的非甾体抗炎化合物的导入率。例如导入率(摩尔％)优选为1.0摩尔％以上。更优选为2.0摩尔％以上，进一步优选为4.0％以上。此处，本发明中的导入率(摩尔％)是指例如在经由连接体对构成海藻酸的L-古洛糖醛酸或D-甘露糖醛酸的羧基导入非甾体抗炎化合物的情况下，导入率10摩尔％表示将构成海藻酸的L-古洛糖醛酸或D-甘露糖醛酸的单糖作为1个单位(个)，在100个单糖中以10个的比例导入非甾体抗炎化合物。因此，在相邻的单糖的各羧基上也可将各非甾体抗炎化合物经由连接体导入。
连接体的种类和非甾体抗炎化合物的导入率可以考虑下述的含有该化合物的药物组合物的最终给予形式(凝胶状、溶胶状、微珠状等)、或给予生物体时的非甾体抗炎化合物在患部的需要量或缓释效率等来适当调整。
此处，本发明的水溶性海藻酸衍生物为含有非甾体抗炎化合物的高分子化合物，但在水溶性方面具有特征。即，即便一般已知为疏水性的非甾体抗炎化合物在水溶性海藻酸衍生物中的导入率高的情况下，例如即便为10摩尔％以上，也可溶解于水中。例如，在水100质量份中，添加水溶性海藻酸衍生物0.1质量份，在室温(例如20℃)进行振荡或搅拌的情况下，显示在24小时以内不形成凝胶状而溶解。即，本发明的水溶性海藻酸衍生物显示以0.1％以上的浓度在水性溶剂中溶解。应予说明，在本说明书中，只要没有特别说明，“室温”表示通常约0℃至约35℃的温度。
另外，本发明中的水溶性海藻酸衍生物的水溶性与例如海藻酸钠盐的水溶性同等程度，具有根据下述用途的凝胶化或溶胶化的操作容易这样的优点。因此，本发明的水溶性海藻酸衍生物的溶液可进行过滤器过滤，可通过过滤器过滤而除尘、除菌、灭菌。即，使其通过5μ m～0.45μ m的过滤器，由此可进行除尘、除菌，进一步期望使其通过0.22μ m的过滤器，由此还可进行灭菌。
应予说明，本发明的水溶性海藻酸衍生物可溶解于包含水、药学上可接受的金属盐或者pH调节剂等的水溶液、缓冲液等水性溶剂中。具体地，可溶解于注射用水、磷酸缓冲生理盐水、生理盐水等中。
另外，本发明的水溶性海藻酸衍生物单独并不会带来非甾体抗炎化合物具有的抗炎症效果，但例如在将其给予生物体内的情况下，根据生物体内的状况，非甾体抗炎化合物从连接体上适当地被切断，由此释放非甾体抗炎化合物，发挥效果。由于非甾体抗炎化合物仅以对于抑制患部的炎症、进行镇痛所需要的量持续释放，因此作为结果，在一定期间、稳定地集中于患部，可带来抗炎症效果和镇痛效果。水溶性海藻酸衍生物根据作为其构成成分的连接体的结构，可将非甾体抗炎化合物的缓释速度调节为期望的方式，因此根据要求的效果，通过将非甾体抗炎化合物的导入率和连接体的种类的组合最佳化，在注射到生物体内的情况下、例如进行关节腔内注射的情况下、特别是进行膝关节腔内注射的情况下，能够带来可长期持续的镇痛作用、抗炎症作用。
另外，海藻酸由于不会被生物体内的酶分解，因此对于本发明的水溶性海藻酸衍生物而言，非甾体抗炎化合物的释放速度难以受到连接体部位的切断以外的因素的影响，能够稳定地释放一定的有效成分。
在本发明的水溶性海藻酸衍生物中，通过改变海藻酸或其盐与连接体的连接方式和非甾体抗炎化合物与连接体的连接方式，可以改变生物体内的分解性、分解顺序，其结果是也可控制非甾体抗炎化合物的游离率、游离速度。具体地，已知在生物体内中，与酰胺键相比，酯键易于受到水解。对于本发明的水溶性海藻酸衍生物来说，只要最终非甾体抗炎化合物可游离，不问其分解顺序，但是优选非甾体抗炎化合物与连接体的连接先受到水解，非甾体抗炎化合物游离。具体地，海藻酸或其盐与连接体以酰胺键连接，非甾体抗炎化合物与连接体以酯键连接，由此酯键先受到水解，非甾体抗炎化合物先从连接体上游离。
另外，海藻酸由于对适用的生物体不会产生不良影响、在生物体内没有鉴定出与海藻酸结合的特定受体，因此，释放出非甾体抗炎化合物后的海藻酸或其盐在体内被分解而不会带来毒性。
本发明的水溶性海藻酸衍生物在期待弱酸性的条件下长期缓释的局面下，优选可非常缓慢地游离。例如，将本发明的水溶性海藻酸衍生物制备成0.1质量％浓度水溶液，在37℃孵育7天的情况下，优选非甾体抗炎化合物在pH5.3表现以1.0％以下的游离率释放的行为。另外，在期待中性条件下短期的缓释的局面下，优选可缓慢地游离。例如，优选在上述的条件下(pH7.0)表现以大于0％且为50％以下的游离率释放的行为，更优选表现以0.04～45％的游离率释放的行为，更优选表现以1～40％的游离率释放的行为，进一步优选表现以1.5％～30％的游离率释放的行为。
可以与这样使用的环境相对应，通过在各pH下的游离率分别使用本发明的各水溶性海藻酸衍生物。另外，通过利用交联剂使本发明的水溶性海藻酸衍生物凝胶化，也可以进一步强化缓释效果。
例如，使用本发明的水溶性海藻酸衍生物作为膝关节腔内给予用的关节炎治疗剂时，在引起炎症的患部的pH表现弱酸性的行为的情况下，在患部利用注射等给予时，可期待7天以上、优选15天以上、更优选30天以上、稳定地使非甾体抗炎化合物持续缓释。此处，游离率表示相对于在水溶性海藻酸衍生物中所含的非甾体抗炎化合物总量，释放出的非甾体抗炎化合物量的比率。
通过使用本发明的水溶性海藻酸衍生物，与药剂的单独给予相比，在给予膝关节腔内等患部或其生物分类相近的部位的情况下，可有效率地在患部保持有效的药剂量，即使是比口服给予的情况少的药剂量，也可期待强效的治疗效果。另外，通过缓释性和持续性的调节，也可以与临床上给予次数的减少等相关联。
以下，为了说明本发明的水溶性海藻酸衍生物的构成，对于作为各构成成分的、海藻酸、连接体和非甾体抗炎化合物进行说明后，对于水溶性海藻酸衍生物凝胶、它们的用途等进行详述。
<<海藻酸或其盐>>
在本发明中，作为海藻酸或其盐，优选是“海藻酸的1价金属盐”、即通过将海藻酸的D-甘露糖醛酸或L-古洛糖醛酸的羧酸的氢原子与Na
海藻酸是从褐藻类的海藻中提取、纯化而制造的天然多糖类的一种。另外，海藻酸是D-甘露糖醛酸(M)与L-古洛糖醛酸(G)聚合而得的聚合物。海藻酸的D-甘露糖醛酸与L-古洛糖醛酸的构成比(M/G比)主要根据海藻等作为来源的生物的种类而不同，另外，受到由该生物的繁殖场所、季节所带来的影响，遍及从M/G比为约0.4的高G型至M/G比为约5的高M型的宽范围。根据海藻酸的M/G比、M与G的排列的方式等，存在海藻酸的物理化学性质不同、另外优选的用途不同的情况。在海藻酸的工业上的制造方法中，有酸法和钙法等，在本发明中，可以使用任意的制法制造的海藻酸。优选是通过纯化，利用HPLC法的定量值包含在80～120质量％的范围的海藻酸，更优选是包含在90～110质量％的范围的海藻酸，进一步优选是包含在95～105质量％的范围的海藻酸。在本发明中，将利用HPLC法的定量值包含在前述范围的海藻酸称为高纯度的海藻酸。本发明中使用的海藻酸或其盐优选为高纯度海藻酸。作为市售品，例如作为キミカアルギン系列，可以购买、使用由(株)キミカ售卖的商品，优选购买、使用高纯度食品/药品用级别的商品。也可将市售品进一步适当纯化来使用。例如，优选进行低内毒素处理。纯化法、低内毒素处理方法可以采用例如日本特开2007-75425(专利文献1)中记载的方法。
作为本发明中使用的海藻酸或其盐，可根据其最终使用用途，使用适当的重均分子量的。例如，在用作关节腔内给予用的关节炎治疗剂的情况下，优选使用重均分子量为1万～1000万的，更优选为10万以上500万以下，进一步优选为20万以上300万以下。更具体地，优选使用例如具有下述表1所示的物性的海藻酸或其盐、即A1～A4中的任一者。
[表1]
。
另外，作为海藻酸盐，还可以使用下述所示的作为市售品的海藻酸钠(销售商持田制药株式会社)。此处，在下述的实施例12～22中，海藻酸钠使用下表中记载的A-1、A-2、A-3和B-2的海藻酸钠。各海藻酸钠的1w/w％的水溶液的粘度、重均分子量和M/G比示于表2。
[表2]
前述海藻酸钠A-1、A-2、A-3、B-1、B-2、和B-3的各物性值利用下述的方法测定。测定方法不限定于该方法，但根据测定方法，各物性值有时与上述的值不同。
[海藻酸钠的粘度测定]
根据日本药典(第16版)的粘度测定法，使用旋转粘度计法(锥板型旋转粘度计)进行测定。具体的测定条件如以下所述。试样溶液的制备使用MilliQ水进行。测定仪器使用锥板型旋转粘度计(粘度粘弹性测定装置レオストレスRS600(Thermo Haake GmbH)传感器：35/1)。转速在1w/w％海藻酸钠溶液测定时设为1rpm。读取时间设为测定2分钟、从开始1分钟至2分钟为止的平均值。将3次测定的平均值设为测定值。测定温度设为20℃。
[海藻酸钠的重均分子量测定]
利用(1)凝胶渗透色谱法(GPC)、和(2)GPC-MALS这两种的测定方法进行测定。测定条件如以下所述。
[前处理方法]
在试样中加入洗脱液并溶解后，通过0.45μ m膜过滤器过滤，将该过滤后的溶液作为测定溶液。
(1)凝胶渗透色谱法(GPC)测定
[测定条件(相对分子量分布测定)]
柱：TSKgel GMPW-XL×2+G2500PW-XL(7.8mm I.D.×300mm×3根)
洗脱液：200mM硝酸钠水溶液
流量：1.0mL/min
浓度：0.05％
检测器：RI检测器
柱温：40℃
注入量：200μ L
分子量标准：标准支链淀粉，葡萄糖。
(2)GPC-MALS测定
[折射率增量(dn/dc)测定(测定条件)]
示差折射率计：Optilab T-rEX
测定波长：658nm
测定温度：40℃
溶剂：200mM硝酸钠水溶液
试样浓度：0.5～2.5mg/mL(5浓度)。
[测定条件(绝对分子量分布测定)]
柱：TSKgel GMPW-XL×2+G2500PW-XL(7.8mm I.D.×300mm×3根)
洗脱液：200mM硝酸钠水溶液
流量：1.0mL/min
浓度：0.05％
检测器：RI检测器、光散射检测器(MALS)
柱温：40℃
注入量：200μL。
在本说明书中，对于海藻酸、海藻酸衍生物、交联海藻酸、和交联海藻酸的分子量，有时附注Da(道尔顿)作为单位。
海藻酸类的D-甘露糖醛酸与L-古洛糖醛酸的构成比(M/G比)主要根据海藻等作为来源的生物的种类而不同，另外，受到由该生物的繁殖场所、季节带来的影响，遍及从M/G比为约0.2的高G型至M/G比为约5的高M型的宽范围。海藻酸类的凝胶化能力和生成的凝胶的性质根据M/G比而受到影响，一般而言，已知G比率高的情况下，凝胶强度变高。M/G比另外也对于凝胶的硬度、脆性、吸水性、柔软性等造成影响。所用的海藻酸类和/或其盐的M/G比通常为0.2～4.0，更优选为0.4～3.0，进一步优选为0.5～3.0。
此处，一般源于天然物质的高分子物质由于不是具有单一分子量、而是具有各种分子量的分子的集合体，因此作为具有某种一定宽度的分子量分布而测定。代表性的测定方法是凝胶过滤色谱法。作为利用凝胶过滤色谱法得到的分子量分布的代表性的信息，可以列举重均分子量(Mw)、数均分子量(Mn)、分散比(Mw/Mn)。
重均分子量强调分子量大的高分子对于平均分子量的贡献，以下述式表示。
Mw＝∑(WiMi)/W＝∑(HiMi)/∑(Hi)
数均分子量通过用高分子的总重量除以高分子的总数而算出。
Mn＝W/∑Ni＝∑(MiNi)/∑Ni＝∑(Hi)/∑(Hi/Mi)
其中，W为高分子的总重量，Wi为第i个高分子的重量，Mi为第i个洗脱时间的分子量，Ni为分子量Mi的个数，Hi为第i个洗脱时间的高度。
在源于天然物质的高分子物质的分子量测定中，已知根据测定方法，可产生数值上的不同(透明质酸的例子：Chikako YOMOTA等，Bull.Natl.Health Sci.，Vol.117，pp135-139(1999)，Chikako YOMOTA等，Bull.Natl.Inst.Health Sci.，Vol.121，pp30-33(2003))。对于海藻酸的分子量测定，存在记载有由固有粘度(Intrinsic viscosity)算出的方法、通过SEC-MALLS(Size Exclusion Chromatography with Multiple Angle Laser LightScattering Detection)算出的方法的文献(ASTM F2064-00(2006)，ASTM International发行)。应予说明，在该文献中，在利用尺寸排阻色谱法(＝凝胶过滤色谱法)测定分子量时，仅通过使用了支链淀粉作为标准物质的校正曲线来算出是不充分的，推荐并用多角度光散射检测器(MALLS)(＝利用了SEC-MALLS的测定)。另外，也有将利用SEC-MALLS得到的分子量作为海藻酸的目录上的标准值使用的例子(FMC Biopolymer公司，PRONOVATM sodiumalginates catalogue)。
应予说明，利用上述这样的方法算出通常高分子多糖类的分子量的情况下，可产生10～20％的测定误差，例如如果是40万，可在32～48万左右的范围产生值的变动，如果是100万，可在80～120万左右的范围产生值的变动。
在本说明书中，所用的海藻酸钠的分子量以重均分子量(GPC)计，例如优选为30万～250万的范围，更优选为30万～90万的范围，或更优选为70万～170万的范围，或更优选为140万～200万的范围。
在本说明书中，在确定海藻酸或其盐的分子量的情况下，只要没有特别的说明，是利用凝胶过滤色谱法算出的重均分子量。作为凝胶过滤色谱法的条件，例如可以采用下述的本实施例的条件。
另外，作为在本发明中使用的海藻酸或其盐，较好根据其最终使用用途，使用具有适当的粘度、适当的M/G比的。另外，本发明中使用的海藻酸或其盐优选使用使内毒素水平降低的。优选使用通过日本药典内毒素试验测定的内毒素值小于100EU/g的，更优选小于75EU/g，进一步优选小于50EU/g。在本发明中，“实质上不含内毒素”是指通过日本药典内毒素试验测定的内毒素值为上述数值范围。
<<连接体>>
本发明的水溶性海藻酸衍生物的连接体只要如上述那样具有能够与源于海藻酸或其盐的一个残基以酰胺键连接的官能团、且具有能够与非甾体抗炎化合物的一个残基以酯键连接的官能团、具有能够形成水溶性海藻酸衍生物的结构即可，没有特别限定，优选例如具有以下式(7)所示的结构。
-NH-(CH
在式(7)中，-NH表示与海藻酸或其盐的一个残基形成酰胺键的末端，[Z]-表示与非甾体抗炎化合物的一个残基形成酯键的末端。根据非甾体抗炎化合物的连接部分的结构，Z可以为O，或者也可以为C(＝O)，但优选为O。在式(7)中，X
Y表示环烷烃环、芳族环或杂环(前述环烷烃环、芳族环或杂环可被卤素原子或C
n1表示0～10的任一整数，n2～n8独立地表示0～3的任一整数。但是，n1～n8不全部为0。优选n2、n4和n7独立地为0～2，更优选独立地为0～1。另外，n3、n5、n6和n8总计优选为1～12，更优选为2～10。
进一步地，本发明的水溶性海藻酸衍生物的连接体优选例如具有以下的式(LK)[不包含式中虚线两外侧]所示的结构。
[化学式22]
式中，-NH为与海藻酸或其盐的一个残基形成酰胺键的末端；
Z-为与非甾体抗炎化合物的一个残基形成酯键的末端；根据非甾体抗炎化合物的连接部分的结构，Z为氧原子或羰基，优选为氧原子；
X
R
Y为C
n1或n8各自独立地为0～10的任一整数；
n3、n5、或n6各自独立地为0、1、2、3的任一整数；n2、n4、或n7各自独立地为0或1的整数；
但是，n1～n8不全部为0；
优选n2、n4和n7各自独立地为0～2，更优选独立地为0～1；
另外，n3、n5、和n6总计优选为1～12，更优选为2～10。
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“杂原子”，可列举例如O、S、和N或P等。
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“卤素原子”，可列举例如氟原子、氯原子、溴原子和碘原子等。
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“C
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“C
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“C
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“C
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“C
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“C
在本说明书中，只要没有特别说明，“C
在本说明书中，只要没有特别说明，“C
在本说明书中，只要没有特别说明，“C
应予说明，上述C
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“环烷烃环”，可以列举环丙烷、环丁烷、环戊烷、环己烷、环庚烷、环辛烷、环壬烷和环癸烷等。
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“芳族环”，可以列举苯环、1-萘环、2-萘环、2-、3-、4-联苯蒽酮环、菲环和苊环等。
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“C
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“C
在本说明书中，只要没有特别说明，“杂环”是指含有1～5个氮原子、硫原子或氧原子的杂原子的3～14元环的单环式或稠环式的环。
在本说明书中，只要没有特别说明，“杂环”可以列举“芳族杂环”、“部分氢化的稠环式杂环”、“非芳族杂环”。
在本说明书中，只要没有特别说明，“芳族杂环”包含环元数5～7的单环式芳族杂环，优选列举例如吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、噁唑、异噁唑、噻唑、异噻唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、1，2，3-噁二唑、1，2，4-噁二唑、1，3，4-噁二唑、呋咱(フラザ一ル)、1，2，3-噻二唑、1，2，4-噻二唑、1，3，4-噻二唑、四唑、吡啶、哒嗪、嘧啶、吡嗪、1，2，3-三嗪、1，2，4-三嗪、1，3，5-三嗪、2H-1，2，3-噻二嗪、4H-1，2，4-噻二嗪、6H-1，3，4-噻二嗪、1，4-二氮杂
在本说明书中，只要没有特别说明，在“芳族杂环”中包含环元数8～12的稠环式芳族杂环(稠环式杂环)，优选列举例如吲哚、异吲哚、苯并呋喃、异苯并呋喃、苯并噻吩、异苯并噻吩、苯并噁唑、1，2-苯并异噁唑、苯并噻唑、1，2-苯并异噻唑、1H-苯并咪唑、1H-吲唑、1H-苯并三唑、2，1，3-苯并噻二嗪、色烯、异色烯、4H-1，4-苯并噁嗪、4H-1，4-苯并噻嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、喹唑啉、喹喔啉、酞嗪、苯并氧氮杂
在本说明书中，只要没有特别说明，“部分氢化的稠环式杂环”是指在“杂环”与“C
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“部分氢化的稠环式杂环”，优选环元数8～12的环，可以列举例如吲哚满、4，5，6，7-四氢-1H-吲哚满、2，3-二氢苯并呋喃、4，5，6，7-四氢-苯并呋喃、2，3-二氢苯并[d]噁唑啉、2，3-二氢苯并[d]噻唑啉、色满、2H-色烯、4H-色烯、异色满、1H-异色烯、3，4-二氢-2H-1，4-苯并噁嗪、3，4-二氢-2H-1，4-苯并噻嗪、5，6，7，8-四氢喹啉、1，2，3，4-四氢喹啉、1，2-二氢喹啉、1，2，3，4-四氢喹唑啉、1，2-二氢喹唑啉、2，4-二氢-1H-苯并[d][1，3]噁嗪、2，4-二氢-1H-苯并[d][1，3]噻嗪、5，6，7，8-四氢异喹啉、1，2-二氢异喹啉、1，2，3，4-四氢异喹啉、1，2-二氢喹喔啉、1，4-二氢喹喔啉、1，2，3，4-四氢喹喔啉、4H-苯并[d][1，3]二噁烷、2，3-二氢苯并[b][1，4]二噁烷、1，3-苯并二氧杂戊环(1，3-ベンゾジオキソリン)、2，3，4，5-四氢苯并[b][1，4]氧氮杂
在本说明书中，只要没有特别说明，作为“非芳族杂环”，优选环元数3～14的环，可以列举例如氮丙啶、环氧乙烷、硫杂环丙烷、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、吡咯烷、四氢呋喃、四氢噻吩、吡唑啉、吡唑烷、咪唑烷、哌啶、四氢吡喃、四氢硫代吡喃、哌嗪、吗啉、硫代吗啉、二噁烷、噁唑啉、异噁唑啉、1，3-噁唑烷、异噁唑烷、噻唑啉、异噻唑啉、1，3-噻唑烷、异噻唑烷、噁二唑啉、1，3，4-噁二唑烷、奎宁环、氮杂环庚烷(アゼパン)、二氮杂
对于本发明的化合物而言，连接体与非甾体抗炎化合物的酯键被水解，非甾体抗炎化合物游离。对于酯键而言，根据周围环境，水解的速度变化。因此，也有由于酯键的形式、而得到更长期的缓释效果的情况。例如，通过在连接体Z的附近导入供电子基团、大体积的基团、或者导入取代基，也有水解的速度变慢的情况，可以列举例如烷基、特别是支链的烷基。另外，相反通过在连接体Z的附近导入吸电子基团、或者导入取代基，有水解的速度变快的情况，可以列举例如卤代烷基和卤素原子。这样，根据作为目的的水解速度、即缓释效果，可选择在连接体内的基团的导入或者在连接体上的取代基的导入。
更优选的是用以下所示的一组连接体中的任一者将海藻酸或其盐与非甾体抗炎化合物连接。应予说明，在以下的连接体中，-NH表示与海藻酸或其盐一个残基形成酰胺键的末端，-O表示与非甾体抗炎化合物的羧基形成酯键的末端。
[化学式23]
或者更优选的是海藻酸或其盐、与非甾体抗炎化合物经由选自下述式(LK-1)～(LK-17)所示的连接体(不含式中虚线的外侧)中的任一者连接。应予说明，在下述式连接体中，亚氨基(-NH)侧表示与海藻酸或其盐的一个残基形成酰胺键的末端，-O侧表示与非甾体抗炎化合物的羧基形成酯键的末端。
[化学式24]
<非甾体抗炎化合物>
作为非甾体抗炎化合物，使用具有源于非甾体性抗炎药(NSAIDs)的残基、在其化学结构中具有羧基、羟基、氨基等官能团的化合物。另外，非甾体抗炎化合物也可以是盐的形式。作为本发明中的上述NSAIDs，通常包括称为非甾体性抗炎药的全体化合物，因此没有特别限定，但其中特别期望是适用于关节炎的化合物，从与连接体的连接的观点考虑，特别优选至少具有羧基的NSAIDs。优选非甾体抗炎化合物具有羧基，前述羧基与连接体连接。作为具有羧基的NSAIDs，可以列举例如(1)水杨酸系、(2)丙酸系或(3)醋酸系(苯基醋酸系)、(4)灭酸系、(5)昔康系、(6)吡咯并吡咯衍生物、和(7)昔布(Coxib)系(COX-2抑制剂)等的非甾体性抗炎药，优选为醋酸系(苯基醋酸系)的非甾体性抗炎药(NSAIDs)，最优选非甾体抗炎化合物为双氯芬酸。前述非甾体性抗炎症性药物中，作为(1)水杨酸系非甾体性抗炎药，可以列举水杨酸、双水杨酸酯、阿司匹林、二氟尼柳、水杨酰胺等，作为(2)丙酸系非甾体性抗炎药，可以列举布洛芬、氟比洛芬、酮洛芬、萘普生、普拉洛芬、非诺洛芬、噻洛芬酸、噁丙嗪、洛索洛芬钠、阿明洛芬、扎托洛芬、噻洛芬酸等，作为(3)芳基醋酸系(苯基醋酸系)非甾体性抗炎药，可以列举联苯乙酸、双氯芬酸、甲苯酰吡酸钠、苏灵大、芬布芬、吲哚美辛、吲哚美辛法呢酯、阿西美辛、马来酸丙谷美辛、氨芬酸钠、萘丁美酮、莫苯唑酸、依托度酸、阿氯芬酸等。
在本发明的例示的实施方式的实施中，更优选作为(2)丙酸系非甾体性抗炎药的酮洛芬或萘普生、或作为(3)芳基醋酸系(苯基醋酸系)非甾体性抗炎药的联苯乙酸或双氯芬酸，特别优选双氯芬酸。
<水溶性海藻酸衍生物的合成方法>
在水溶性海藻酸衍生物的合成中，对于非甾体抗炎化合物在连接体上的连接、和海藻酸或其盐在连接体上的连接，先进行哪一者都可以，但从难以在水溶剂中进行酯化等的原因考虑，优选先进行非甾体抗炎化合物在连接体上的连接。作为实现这样的连接的方法，可以列举使用DCC(N,N’-二环己基碳二亚胺)、EDCI(1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺)、DMT-MM(4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物)等缩合剂的方法、使用HOSu(N-羟基琥珀酰亚胺)、HOBt(1-羟基苯并三唑)等缩合助剂和前述缩合剂的缩合反应、亲核取代反应、活性酯法、酸酐法等，由于抑制副反应等的原因，优选使用缩合反应和亲核取代反应进行连接。
更具体地，例如如表示以下这样的概念的方案那样，可以通过利用缩合反应(酯化反应)的方法或利用亲核取代反应的方法进行合成。在下述的反应方案中，为了方便起见，将连接体作为“(O)-连接体-NH”解释、将AL作为源于海藻酸或其盐的残基、即构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸的任一者的单糖的C(＝O)-基解释、将Boc作为丁氧基羰基(保护基团)解释时，可理解反应的概况。应予说明，DF表示双氯芬酸的简写，但这是示例，在本发明中，并不意味着NSAIDs限定于双氯芬酸。
[化学式25]
另外，本发明的水溶性海藻酸衍生物中的非甾体抗炎化合物的导入率，可在本发明的水溶性海藻酸衍生物的合成工序中，通过改变缩合剂、缩合助剂、连接有连接体的非甾体抗炎化合物的投料量等来进行调节。应予说明，导入率可以通过使用吸光度的测定或HPLC、NMR等的方法进行测定。也可以通过连接体的结构、导入率，适当调节水溶性海藻酸衍生物的水溶性。
<与海藻酸或其盐连接时使用的氨基化合物>
在海藻酸衍生物的合成中，作为使连接体与非甾体抗炎化合物连接后、再与海藻酸或其盐连接时使用的氨基化合物，可以列举下述式(AM)所示的氨基化合物。
式(AM)：
[化学式26]
(式中，
(D)为源于非甾体抗炎化合物的一个残基；
X
R
Y为杂环(前述杂环可以被1～3个卤素原子或C
Z为氧原子；
n1或n8为0～10的任一整数；
n3、n5、或n6独立地是0、1、2、3的任一整数；
n2、n4、或n7独立地是0或1的整数；
但是，n1～n8不全部为0)所示的氨基化合物、其盐、或它们的溶剂物。
另外，在式(AM)所示的氨基化合物中，作为优选的化合物，有下述式(AM-1)所示的氨基化合物、其盐、或它们的溶剂合物：
[化学式27]
(式中，
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；优选为双氯芬酸的一个残基；
Y为C
n1a和n5a各自独立地为1～4的整数)。
另外，作为式(AM-1)的、具体的化合物，例如为选自下述式的氨基化合物、其盐、或它们的溶剂合物，
[化学式28]
另外，在式(AM)所示的氨基化合物中，作为优选的化合物，有下述式(AM-2)所示的氨基化合物、其盐、或它们的溶剂合物：
[化学式29]
(式中，
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；优选为双氯芬酸的一个残基；
R
n1a、n3a和n5a各自独立地为1～4的整数)
(但是，(αR)-3-苯甲酰基-α-甲基-苯基醋酸3-氨基-2-氟丙基酯[CASNo.1644429-26-4]、(αR)-3-苯甲酰基-α-甲基-苯基醋酸3-氨基-丙基酯[CAS No.1644429-25-3]、2-氟-α-甲基-[1，1’-联苯基]-4-醋酸3-氨基-2,2-二氟丙基酯[CAS No.1644429-24-2]、(αR)-3-苯甲酰基-α-甲基-苯基醋酸3-氨基-2,2-二氟丙基酯[CAS No.1644429-23-1]、[1，1’-联苯基]-4-醋酸3-氨基-2,2-二氟丙基酯[CAS No.1644429-21-9]、(αS)-α-甲基-4-(2-甲基丙基)-苯基醋酸3-氨基-丙基酯[CAS No.1384127-03-0]、2-[(2，6-二氯苯基)氨基]-苯基醋酸3-氨基-丙基酯[CAS No.918636-69-8]、[1，1’-联苯基]-4-醋酸3-氨基-丙基酯[CAS No.918636-66-5]、2-氟-α-甲基-[1，1’-联苯基]-4-醋酸3-氨基-丙基酯[CAS No.918636-63-2]、α-甲基-4-(2-甲基丙基)-苯基醋酸3-氨基-丙基酯[CASNo.918636-60-9]、和(αS)-6-甲氧基-α-甲基-2-萘醋酸3-氨基-丙基酯[CAS No.918636-57-4]、其盐、或它们的溶剂合物除外)。
另外，作为式(AM-2)的具体化合物，例如有下述式的氨基化合物、其盐、或它们的溶剂合物，
[化学式30]
另外，在式(AM)所示的氨基化合物中，作为优选的化合物，有下述式(AM-3)所示的氨基化合物、其盐、或它们的溶剂合物：
[化学式31]
(式中，
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；优选为双氯芬酸的一个残基；
R
n1a、n6a和n8a各自独立地为1～4的整数)。
另外，作为式(AM-3)的具体化合物，例如有下述式的氨基化合物、其盐、或它们的溶剂合物，
[化学式32]
另外，在式(AM)所示的氨基化合物中，作为优选的化合物，有下述式(AM-4)所示的氨基化合物、其盐、或它们的溶剂合物：
[化学式33]
(式中，
(D)为非甾体抗炎化合物的一个残基；优选为选自双氯芬酸、酮洛芬、萘普生和联苯乙酸的、非甾体抗炎化合物的一个残基；
R
X
n1a为1～4的任一整数；
n8a为0～8的任一整数)。
另外，作为式(AM-4)的具体化合物，例如有下述式的氨基化合物、其盐、或它们的溶剂合物，
[化学式34]
在本说明书中，由式(AM)、式(AM-1)、式(AM-2)、式(AM-3)或式(AM-4)表示的氨基化合物、或者碱性取代基取代的非甾体抗炎化合物有时形成制药学上可接受的盐(例如酸加成盐)。作为所述的盐，只要是制药学上可接受的盐即可，没有特别限定，可以列举例如与无机酸的盐、与有机酸的盐、与酸性氨基酸的盐等。作为与无机酸的盐的合适的例子，可以列举例如与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、硫酸、磷酸等的盐。作为与有机酸的盐的合适的例子，可以列举例如与甲酸、醋酸、三氟醋酸、丙酸、丁酸、戊酸、庚酸、癸酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、乳酸、山梨酸、扁桃酸等脂肪族单羧酸等的盐、与草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、苹果酸、酒石酸等脂肪族二羧酸的盐、与柠檬酸等脂肪族三羧酸的盐、与苯甲酸、水杨酸等芳族单羧酸的盐、与邻苯二甲酸等芳族二羧酸的盐、与桂皮酸、乙醇酸、丙酮酸、肉铁质酸、水杨酸、N-乙酰半胱氨酸等有机羧酸的盐、与甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸等有机磺酸的盐、与天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸类的酸加成盐。作为与酸性氨基酸的盐的合适的例子，可以列举例如与天冬氨酸、谷氨酸等的盐。其中，优选药学上可接受的盐。
前述盐可以如下述这样得到，即，按照常法，例如通过将本发明的化合物和含有适量的酸的溶液混合而形成目的的盐后，分别过滤获取，或馏去该混合溶剂而得到。作为关于盐的综述，出版了Handbook of Pharmaceutical Salts：Properties，Selection，and Use、Stahl&Wermuth(Wiley-VCH、2002)，在本书中有详细的记载。
<海藻酸衍生物凝胶>
本发明的水溶性海藻酸衍生物可以通过与一般作为海藻酸的交联剂使用的物质混合而形成海藻酸衍生物凝胶。作为这样的交联剂，只要是可以通过将海藻酸的1价金属盐的溶液交联而将其表面固定化的物质即可，没有特别限定，可以列举Ca
这里，可知在交联剂中含有钙时，钙的浓度高的情况下，凝胶化快，另外，可以形成更硬的凝胶。但是，对于钙而言，由于具有细胞毒性，因此如果浓度过于高，则也有将其给予体内时给体内(躯干部)带来不良影响的担心，可根据海藻酸的量，适量使用。
<缓释性药物组合物>
本发明的水溶性海藻酸衍生物或海藻酸衍生物凝胶由于在生物体内表现使非甾体抗炎化合物缓释的行为，因此可以作为缓释性药物组合物使用。进一步地，本发明的缓释性药物组合物可使用海藻酸或其盐作为其缓释基材。海藻酸或其盐具有对于创伤被覆、软骨疾病治疗和关节风湿病治疗的效果。例如对于膝关节变形病，可期待发挥软骨再生的效果，对于关节风湿病，可期待发挥软骨再生、关节风湿病自身的治疗效果。即，本发明的缓释性药物组合物可同时期待缓释的NSAIDs的镇痛和抗炎症的治疗效果和海藻酸的治疗效果。本发明的缓释性药物组合物的目标疾病、给予途径没有特别限定，但优选以关节病的处置、炎症的抑制或疼痛的抑制、症状的预防或缓和等作为目的，优选以向关节腔内直接注入的给予途径给予。
例如，使用本发明的缓释性药物组合物作为膝关节腔内给予用的关节炎治疗剂时，在引起炎症的患部的pH表现弱酸性的行为的情况下，在患部利用注射等给予时，可期待7天以上、优选15天以上、更优选30天以上、进一步优选100天以上、稳定地使非甾体抗炎化合物持续缓释。
另外，本发明的缓释性药物组合物的给予量根据所含的非甾体抗炎化合物的量、给予途径、给予形式、使用目的、作为给予对象的动物的具体症状、年龄、体重等，而个别确定，以最合适地发挥治疗效果，没有特别限定。例如，优选为可维持显示NSAIDs的效果的作用浓度的1/100～10倍的浓度的量。
本发明的缓释性药物组合物的适用部位只要是可通过非口服给予的部位即可，没有特别限定，其中优选为关节，特别优选为膝关节、肩关节、股关节、下颌关节等。特别期望适用于关节炎、例如变形性关节病(OA)和风湿性关节炎(RA)。进一步地，期望适用于变形性膝关节症和风湿性膝关节炎。
在本发明中，例如可将水溶性海藻酸衍生物适用于作为患部的膝关节腔内。另外，在适用后没有保持适度的粘度的情况下，可在适用的衍生物的表面适用交联剂。通过将衍生物表面凝胶化、将表面固化，可以有效地防止从膝关节腔泄露。
在先将水溶性海藻酸衍生物给予患部、之后添加交联剂的情况下，期望交联剂从适用的组合物的表面缓慢浸透到内部，推动交联。为了不使交联剂对与患部的接触部分产生强烈的影响，调节交联剂的适用量，以使其不会过量。作为2价以上的金属离子的适用量，只要是可将含有海藻酸的1价金属盐的组合物的表面固化的量即可，没有特别限定。
在将本发明的水溶性海藻酸衍生物适用于患部时，通过交联剂使表面凝胶化、或者以整体凝胶化的方式预先与交联剂混合而适用时，本发明的水溶性海藻酸衍生物在患部固化，可以在适用的患部以密合的状态局部存在。由此，在包埋细胞等时，可以使细胞等的成分在患部局部存在。
另外，在缓释性药物组合物中使用海藻酸衍生物凝胶的情况下，也可以根据时间差、温度差、或者与生物体内的钙离子的接触等的环境变化而调节推动凝胶化的交联剂的浓度，形成为例如给予前维持液体状态、在向生物体内给予后进行自凝胶化的组合物。作为这样的交联剂，可以列举葡糖酸钙、CaSO
另外，作为在含有水溶性海藻酸衍生物的药物组合物中加入2价以上的金属离子的方法，没有特别限定，可以列举例如利用注射器、喷射器(喷雾器)等，将2价以上的金属离子的溶液施加于组合物表面的方法等。在本发明的组合物的表面适用交联剂的时机可以是在患部适用本发明的组合物之后，或者也可以同时。
另外，在含有本发明的海藻酸衍生物凝胶的缓释性药物组合物中，也可以例如以具有小于500μm的平均粒径的微珠的形式含有。
实施例
接着，为了进一步详细地说明本发明，列举了实施例、试验例，但这些例子仅是实施，并不限定本发明，另外也可以在不脱离本发明范围的范围下进行变化。
在核磁共振光谱(NMR)的测定中，使用JEOL JNM-ECX400FT-NMR(日本电子)。
在
实施例中的药物(非甾体抗炎化合物)导入率(摩尔％)表示由
分子量的测定利用以下的方法进行。称量实施例中所得的本发明的水溶性海藻酸衍生物固体，加入10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.7)，在室温下进行1小时以上的搅拌、溶解后，进行稀释，制备0.05％溶液。使该溶液通过孔径0.22μm的亲水性PVDF制过滤器(MylexGV33过滤器，Merck Millipore公司)而除去不溶物后，将其200μL供于Superose6 Increase 10/300GL柱(GE Healthcare Science公司)，实施凝胶过滤。凝胶过滤通过使用AKTAExplorer10S作为色谱装置、10mmol/L磷酸缓冲液(pH 7.7)作为展开溶剂、在室温下流速0.8mL/mim的条件下实施。各试样的色谱图通过监测波长220nm的吸光度而制作。所得的色谱图利用Unicorn 5.31软件(GE Healthcare Science公司)进行解析，确定峰的洗脱范围。
本发明的水溶性海藻酸衍生物的分子量利用以下的方法求得。使用蓝色葡聚糖(分子量200万Da，SIGMA公司)、甲状腺球蛋白(分子量66.9万Da，GE Healthcare Science公司)、铁蛋白(分子量44万Da，GE Healthcare Science公司)、伴清蛋白(分子量7.5万Da，GEHealthcare Science公司)、和核糖核酸酶A(分子量1.37万Da，GE Healthcare Science公司)作为标准品，在与试样相同的条件下进行凝胶过滤，确定各成分的洗脱液量。分别将各成分的洗脱液量作为横轴、分子量的对数值作为纵轴进行绘图，进行2次回归，作成标准曲线。使用该标准曲线，计算先前所得的试样的色谱图的洗脱时间i的分子量(Mi)。接着，读取洗脱时间i的吸光度，设为Hi。由这些数据按照下式求得重均分子量(Mw)。
[数1]
原料的海藻酸或其盐的分子量利用以下的方法求得。考虑干燥减量来秤量各海藻酸，加入超纯水，制备1％水溶液。接着，利用100mmol/L磷酸缓冲液和超纯水进行稀释，以形成为终浓度10mmol/L磷酸缓冲液(pH7.7)，制备0.05％溶液。利用孔径0.22μm的亲水性PVDF制过滤器(MylexGV33过滤器，Merck Millipore公司)除去不溶物后，将200μL供于凝胶过滤，在与本发明的水溶性海藻酸衍生物同样的条件下实施凝胶过滤。检测利用示差折光计实施，用与本发明的水溶性海藻酸衍生物同样的方法求得重均分子量(Mw)。
应予说明，本实施例的方案中的“AL”是源于海藻酸或其盐的残基，其是指具有构成海藻酸的L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸的任一者的单糖的-C(＝O)基的残基。
(实施例1)双氯芬酸-(2-氨基乙醇)-海藻酸衍生物的合成
方案1
[化学式35]
<工序1>化合物3的合成
将市售的双氯芬酸钠(化合物1、1.59g)、市售的(2-溴乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物2、1.12g)、N-甲基吡咯烷酮(5.0mL)的混合物在60℃搅拌18小时。将反应溶液冷却至室温后，加入乙酸乙酯(40mL)和庚烷(20mL)，用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水(20mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。通过利用乙酸乙酯进行结晶化来纯化残留物，得到1.19g化合物3。
<工序2>化合物4的合成
将化合物3(1.1g)和4N盐酸-乙酸乙酯溶液(11mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应液在减压下馏去溶剂，得到1.0g化合物4。
<工序3-1>双氯芬酸-(2-氨基乙醇)-海藻酸衍生物(化合物5a)的合成
将海藻酸钠(株式会社キミカ制，A1)200mg溶解于水(20mL)中，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(102mg)和1M碳酸氢钠水溶液(0.28mL)，滴加化合物4(70mg)的乙醇(5mL)溶液，在室温下搅拌20小时。加入乙醇(40mL)后，加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(2mL)，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(227mg)。药物导入率为10.2摩尔％。
<工序3-2>双氯芬酸-(2-氨基乙醇)-海藻酸衍生物(化合物5b)的合成
使用海藻酸钠(株式会社キミカ制，A2)200mg，进行与(实施例1)<工序3-1>同样的操作，得到作为白色固体的标记化合物(194mg)。药物导入率为13.5摩尔％。
<工序3-3>双氯芬酸-(2-氨基乙醇)-海藻酸衍生物(化合物5c)的合成
使用海藻酸钠(株式会社キミカ制，A3)200mg，进行与(实施例1)<工序3-1>同样的操作，得到作为白色固体的标记化合物(245mg)。药物导入率为13.9摩尔％。
<工序3-4>双氯芬酸-(2-氨基乙醇)-海藻酸衍生物(化合物5d)的合成
使用海藻酸钠(株式会社キミカ制，A4)200mg，进行与(实施例1)<工序3-1>同样的操作，得到作为白色固体的标记化合物(239mg)。药物导入率为9.6摩尔％。
(实施例2)双氯芬酸-(1-氨基-2-丙醇)-海藻酸衍生物的合成
方案2
[化学式36]
<工序1>化合物7的合成
将市售的双氯芬酸钠(化合物1，668mg)、市售的(2-溴丙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物6，500mg)、N-甲基吡咯烷酮(5.0mL)的混合物在60℃搅拌2天。进一步加入化合物2(500mg)，在60℃搅拌1天。将反应溶液冷却至室温后，加入乙酸乙酯(40mL)和庚烷(20mL)，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(10-15％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为无色胶状物质的化合物7(343mg)。
<工序2>化合物8的合成
将化合物7(334mg)和4N盐酸-乙酸乙酯溶液(3mL)的混合物在室温下搅拌1小时。将反应液在减压下馏去溶剂，通过将残留物从乙酸乙酯中结晶化来进行纯化，得到作为白色固体的化合物8(190mg)。
<工序3>双氯芬酸-(1-氨基-2-丙醇)-海藻酸衍生物(化合物9)的合成
在1％(w/w)海藻酸钠(株式会社キミカ制，A2)的水溶液(10g)中，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(49mg)和1M碳酸氢钠水溶液(0.13mL)，滴加化合物8(52mg)的乙醇(5mL)溶液，在室温下搅拌16小时。加入乙醇(15mL)后，加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)，搅拌30分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(111mg)。药物导入率为9.9摩尔％。
(实施例3)双氯芬酸-(2-氨基乙氧基乙醇)-海藻酸衍生物的合成
方案3
[化学式37]
<工序1>化合物12的合成
在市售的双氯芬酸(化合物10、2.0g)、市售的(2-(2-羟基乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物11、1.39g)、N,N--二甲基-4-氨基吡啶(0.17g)、二氯甲烷(7mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(1.39g)的二氯甲烷(7mL)溶液。将反应液在室温下搅拌2小时。使用乙酸乙酯(60mL)将反应液过滤后，用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水(20mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(10-50％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为无色胶状物质的化合物12(2.44g)。
<工序2>化合物13的合成
将化合物12(2.4g)和4N盐酸-乙酸乙酯溶液(24mL)的混合物在室温下搅拌1小时。将反应液在减压下馏去溶剂，通过将残留物从乙酸乙酯中结晶化来进行纯化，得到作为白色固体的化合物13(1.9g)。
<工序3>双氯芬酸-(2-氨基乙氧基乙醇)-海藻酸衍生物(化合物14)的合成
在1％(w/w)海藻酸钠(株式会社キミカ制，A2)的水溶液(10g)中，加入1M碳酸氢钠水溶液(0.13mL)、化合物13(56mg)、乙醇(5mL)、4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(37mg)，在室温下搅拌一晚。加入乙醇(15mL)后，加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(91.3mg)。药物导入率为7.0摩尔％。
(实施例4)双氯芬酸-(丝氨酸乙基酯)-海藻酸衍生物的合成方案4
[化学式38]
<工序1>化合物18的合成
在市售的(叔丁氧基羰基)-L-丝氨酸(化合物15、2.0g)的乙醇(100mL)溶液中，在室温下加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(3.74g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.12g)。将反应液在室温下搅拌3天。将反应液在减压下馏去溶剂后，溶于乙酸乙酯(100mL)中，将该溶液依次用5％柠檬酸水溶液(50mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)、饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下将溶剂馏去，得到化合物16的粗产物(1.08g)。
在化合物16的粗产物(1.08g)和市售的双氯芬酸钠(化合物1、2.95g)的N-甲基吡咯烷酮(9mL)溶液中，在室温下加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(2.66g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.11g)。将反应液在室温下搅拌2天。在反应液中加入饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水(20mL)，用乙酸乙酯(100mL)萃取。用水(20mL)洗涤萃取液，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物用硅胶柱层析(20％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到含有化合物17的级分(1.09g)。
将含有化合物17的级分(1.09g)和4N盐酸-乙酸乙酯溶液(10mL)的混合物在室温下搅拌1小时。将反应液在减压下馏去溶剂，通过将残留物从乙酸乙酯中结晶化来进行纯化，得到作为白色固体的化合物18(91mg)。
<工序2>双氯芬酸-(丝氨酸乙基酯)-海藻酸衍生物(化合物19)的合成
在1％(w/w)海藻酸钠(株式会社キミカ制，A2)的水溶液(10g)中，加入1M碳酸氢钠水溶液(84μL)、化合物18(30mg)的乙醇(5mL)溶液、4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(37mg)，在室温下搅拌3天。加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)和乙醇(15mL)后，搅拌30分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(61.9mg)。药物导入率为13.1摩尔％。
(实施例5)双氯芬酸-(苏氨酸乙基酯)-海藻酸衍生物的合成
方案5
[化学式39]
<工序1>化合物22的合成
在市售的(叔丁氧基羰基)-L-苏氨酸(化合物20，2.14g)的乙醇(100mL)溶液中，在室温下加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(3.74g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.12g)。将反应液搅拌一晚。将反应液在减压下馏去溶剂后，溶于乙酸乙酯(100mL)中，将该溶液依次用5％柠檬酸水溶液(50mL)、饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)、饱和氯化钠水溶液(50mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下将溶剂馏去，得到化合物21的粗产物(0.96g)。
在化合物21的粗产物(0.96g)、市售的双氯芬酸(化合物10，1.15g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.09g)的二氯甲烷(4mL)溶液中，滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(0.8g)的二氯甲烷(4mL)溶液。将反应液在室温下搅拌2小时。使用乙酸乙酯(60mL)将反应液过滤后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(15％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为无色油状物质的化合物22(0.96g)。
<工序2>化合物23的合成
将化合物22(0.96g)和4N盐酸-乙酸乙酯溶液(5mL)的混合物在室温下搅拌1小时。将反应液在减压下馏去溶剂，通过将残留物从乙酸乙酯中结晶化来进行纯化，得到作为白色固体的化合物23(0.41g)。
<工序3>双氯芬酸-(苏氨酸乙基酯)-海藻酸衍生物(化合物24)的合成
在1％(w/w)海藻酸钠(株式会社キミカ制，A2)的水溶液(10g)中，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(37mg)和2-吗啉代乙烷磺酸一水合物(213mg)、化合物23(31mg)的乙醇(5mL)溶液。在2小时后补加0.1M氢氧化钠水溶液(0.2mL)，在3小时后补加4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(16mg)，在4小时后和5小时后分别补加0.1M氢氧化钠水溶液(0.1mL)，在6小时后加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(23mg)和0.1M氢氧化钠水溶液(0.2mL)。在24小时后加入乙醇(15mL)和0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(111.2mg)。药物导入率为5.6摩尔％。
(实施例6)双氯芬酸-((4-(氨基甲基)苯基)甲醇)-海藻酸衍生物的合成
方案6
[化学式40]
<工序1>化合物26的合成
将市售的双氯芬酸钠(化合物1，0.48g)、市售的(4-(溴甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(化合物25、0.45g)、N-甲基吡咯烷酮(3.0mL)的混合物在40℃搅拌2小时。将反应溶液冷却至室温后，加入乙酸乙酯(40mL)和庚烷(20mL)，用水(20mL)洗涤2次，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(15％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色固体的化合物26(0.75g)。
<工序2>化合物27的合成
将化合物26(0.75g)和4N盐酸-乙酸乙酯溶液(20mL)的混合物在室温下搅拌1小时。将反应悬浮液过滤，将过滤获取的固体用乙酸乙酯清洗，得到作为白色固体的化合物27(0.36g)。
<工序3>双氯芬酸-((4-(氨基甲基)苯基)甲醇)-海藻酸衍生物(化合物28)的合成
在1％(w/w)海藻酸钠(株式会社キミカ制，A2)的水溶液(10g)中，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(49mg)、1M碳酸氢钠水溶液(0.16mL)、化合物27(60mg)的乙醇(5mL)溶液，在室温下搅拌一晚。加入乙醇(20mL)后，加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(88.8mg)。药物导入率为5.3摩尔％。
(实施例7)双氯芬酸-(酪胺)-海藻酸衍生物的合成
方案7
[化学式41]
<工序1>化合物30的合成
在市售的双氯芬酸(化合物10，0.7g)、市售的N-(叔丁氧基羰基)酪胺(化合物29，0.56g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.06g)、二氯甲烷(2.5mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(0.49g)的二氯甲烷(2.5mL)溶液。将反应液在室温下搅拌2小时。使用乙酸乙酯(50mL)将反应液过滤后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(15mL)和水(15mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。通过将残留物从乙酸乙酯中结晶化而进行纯化，得到作为白色固体的化合物30(0.64g)。
<工序2>化合物31的合成
将化合物30(0.64g)和4N盐酸-乙酸乙酯溶液(7mL)的混合物在室温下搅拌1小时。将反应液在减压下馏去溶剂，将残留物用乙酸乙酯-庚烷(2：1)清洗，得到作为白色固体的化合物31(0.56g)。
<工序3>双氯芬酸-(酪胺)-海藻酸衍生物(化合物32)的合成
在1％(w/w)海藻酸钠(株式会社キミカ制，A2)的水溶液(10g)中，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(37mg)、1M碳酸氢钠水溶液(0.11mL)、化合物31(40mg)的乙醇(5mL)溶液，在室温下搅拌一晚。加入乙醇(20mL)后，加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(81.0mg)。药物导入率为5.0摩尔％。
(实施例8)双氯芬酸-(3-氨基-2，2-二氟丙烷-1-醇)-海藻酸衍生物的合成
方案8
[化学式42]
<工序1>化合物3的合成
在市售的双氯芬酸(化合物10、0.7g)、市售的(2，2-二氟-3-羟基丙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物33，0.5g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.06g)、二氯甲烷(2.5mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(0.49g)的二氯甲烷(2.5mL)溶液。将反应液在室温下搅拌2小时。使用乙酸乙酯(50mL)将反应液过滤后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(15mL)和水(15mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(5-30％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为无色胶状物质的化合物34(1.02g)。
<工序2>化合物35的合成
将化合物34(1.0g)和4N盐酸-乙酸乙酯溶液(10mL)的混合物在室温下搅拌1小时。将反应液在减压下馏去溶剂，将残留物利用乙酸乙酯-庚烷(2∶1)清洗，得到作为白色固体的化合物35(0.48g)。
<工序3>双氯芬酸-(3-氨基-2，2-二氟丙烷-1-醇)-海藻酸衍生物(化合物36)的合成
在1％(w/w)海藻酸钠(株式会社キミカ制，A2)的水溶液(10g)中，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(37mg)、1M碳酸氢钠水溶液(0.11mL)、化合物35(38mg)的乙醇(5mL)溶液，在室温下搅拌一晚。加入乙醇(20mL)后，加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(93.6mg)。药物导入率为14.9摩尔％。
(实施例9)双氯芬酸-(N-(氨基乙基)-2-羟基乙酰胺)-海藻酸衍生物的合成
方案9
[化学式43]
<工序1>化合物39的合成
在冰冷却的市售的(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物37，1.6g)、饱和碳酸氢钠水溶液(5mL)、水(20mL)、1，2-二甲氧基乙烷(20mL)的混合液中，滴加市售的2-溴乙酰氯(化合物38、1.66mL)，进一步加入饱和碳酸氢钠水溶液(25mL)，搅拌10分钟。将反应溶液用乙酸乙酯(80mL)萃取2次，将合并的萃取液用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物用庚烷-乙酸乙酯(1∶1，10mL)洗涤，得到作为白色固体的化合物39(0.62g)。
<工序2>化合物40的合成
将市售的双氯芬酸钠(化合物1，1.4g)、化合物39(0.62g)、N-甲基吡咯烷酮(4.4mL)的混合物在50℃搅拌1小时。将反应溶液冷却至室温后，加入乙酸乙酯(40mL)和庚烷(20mL)，用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水(20mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(50-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色固体的化合物40(0.87g)。
<工序3>化合物41的合成
将化合物40(0.87g)和4N盐酸-乙酸乙酯溶液(10mL)的混合物在室温下搅拌1小时。将反应悬浮液过滤，用乙酸乙酯-庚烷(2∶1)清洗过滤获取的固体，得到作为白色固体的化合物41(0.62g)。
<工序4>双氯芬酸-(N-(氨基乙基)-2-羟基乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物42)的合成
在1％(w/w)海藻酸钠(株式会社キミカ制，A2)的水溶液(10g)中，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(37mg)、1M碳酸氢钠水溶液(0.11mL)、化合物41(38mg)的乙醇(5mL)溶液，在室温下搅拌一晚。加入乙醇(20mL)后，加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(87.1mg)。药物导入率为12.3摩尔％。
(实施例10)双氯芬酸-(N-(氨基乙基)-2-羟基丙酰胺)-海藻酸衍生物的合成
方案10
[化学式44]
<工序1>化合物45的合成
在冰冷却的市售的(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物37，1.6g)、饱和碳酸氢钠水溶液(10mL)、水(20mL)、1，2-二甲氧基乙烷(30mL)的混合液中，滴加市售的2-溴丙酰溴(化合物43，2.12mL)，进一步加入饱和碳酸氢钠水溶液(25mL)，搅拌10分钟。将反应溶液用乙酸乙酯(80mL)萃取2次，将合并的萃取液用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。用庚烷-乙酸乙酯(3∶2、20mL)洗涤残留物，得到化合物44的粗产物(0.39g)。
将化合物44的粗产物(0.39g)、市售的双氯芬酸钠(化合物1，0.84g)、N-甲基吡咯烷酮(2.6mL)的混合物在50℃搅拌1小时以及在60℃搅拌3小时。将反应溶液冷却至室温后，加入乙酸乙酯(40mL)和庚烷(20mL)，用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水(20mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(30-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色固体的化合物45(0.34g)。
<工序2>化合物46的合成
将化合物45(0.34g)和4N盐酸-乙酸乙酯溶液(4mL)的混合物在室温下搅拌1小时。将反应悬浮液过滤，将过滤获取的固体用乙酸乙酯-庚烷(2∶1)和叔丁基甲基醚清洗，得到作为白色固体的化合物46(0.24g)。
<工序3>双氯芬酸-(N-(氨基乙基)-2-羟基丙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物47)的合成
在1％(w/w)海藻酸钠(株式会社キミカ制，A2)的水溶液(10g)中，加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(37mg)、1M碳酸氢钠水溶液(0.11mL)、化合物46(40mg)的乙醇(5mL)溶液，在室温下搅拌一晚。加入乙醇(20mL)后，加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(87.0mg)。药物导入率为12.5摩尔％。
(实施例11)在实施例1至实施例10中制作的化合物的释放试验
在实施例1至实施例10制作的各缀合物1mg中，添加20mM磷酸钠缓冲液(pH5.3或者7.0)或1N氢氧化钠水溶液，以使各缀合物的浓度分别成为0.1％w/w浓度，在20℃的室内环境下(空调设定温度)，使用磁力搅拌器(ASONE REMIX RS-6A，750r.p.m.)，搅拌6小时。确认没有形成为凝胶状，分配该溶液。利用LC-MS/MS测定在刚溶解后作为初始状态(保存0天)存在于各溶液中的游离双氯芬酸量。另外，对于其以外的分配液，在37℃、在孵育1、3、7天后测定游离双氯芬酸量。使用在各时刻的、与利用1N氢氧化钠水溶液中的强制分解产生的游离双氯芬酸量的比例，算出游离率(％)。
LC条件如以下所示：
温度：40℃
流速：0.7mL/min
柱：ODS-4：3μm(2.1×30mm)
溶剂：(A)0.1％甲酸水溶液、(B)100％乙腈
梯度：
MS条件如以下所述离子化模式：ESI-negative
离子源温度：300度
毛细管电压：-4000V。
pH7.0的释放试验中的游离率
[表3]
。
pH7.0的释放试验中的游离率
[表4]
。
pH7.0的释放试验中的游离率
[表5]
。
pH5.3的释放试验中的游离率
[表6]
。
pH5.3的释放试验中的游离率
[表7]
。
pH5.3的释放试验中的游离率
[表8]
(实施例12)双氯芬酸-(2-氨基乙氧基乙醇)-海藻酸衍生物的合成
[化学式45]
<工序1-1>双氯芬酸-(2-氨基乙氧基乙醇)-海藻酸衍生物(化合物14a)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-2)1g溶解于水(100mL)中，加入乙醇(30mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(456mg)。搅拌30分钟后，滴加化合物13(346mg)的乙醇(10mL)-水(5mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.82mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(5mL)和乙醇(100mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(1.06g)。药物导入率为14.0摩尔％。
<工序1-2>双氯芬酸-(2-氨基乙氧基乙醇)-海藻酸衍生物(化合物14b)的合成
使用海藻酸钠(持田制药株式会社，A-3)1g，进行与(实施例12)<工序1-1>同样的操作，得到作为白色固体的标记化合物(1.11g)。药物导入率为16.4摩尔％。
(实施例13)双氯芬酸-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物的合成
[化学式46]
<工序1>化合物50的合成
在2-氨基乙醇(2.09g)和(叔丁氧基羰基)甘氨酸(5.0g)的乙醇(30mL)混合液中，在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(11.4g)，搅拌5小时。使用乙醇将反应悬浮液过滤，在减压下浓缩滤液。在残留物中添加乙酸乙酯，将悬浮液过滤，在减压下浓缩滤液。将残留物利用硅胶柱层析(0-20％甲醇/乙酸乙酯)纯化，得到化合物50(7.3g)。
<工序2>化合物51的合成
在市售的双氯芬酸(化合物10、2.0g)、化合物50(2.2g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.17g)、二氯甲烷(7mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(1.39g)的二氯甲烷(7mL)溶液。将反应液在室温下搅拌2小时。使用乙酸乙酯(60mL)将反应液过滤后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(10-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色无定形的化合物51(2.7g)。
<工序3>化合物52的合成
将化合物51(2.7g)和4N盐酸-1，4-二噁烷溶液(27.2mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应悬浮液过滤，将过滤获取的固体用二甲氧基乙烷-乙醇(1：1)和二甲氧基乙烷清洗，得到作为白色固体的化合物52(1.73g)。
<工序4-1>双氯芬酸-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物53a)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-1)2g溶解于水(200mL)中，加入乙醇(60mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(1.3g)。搅拌30分钟后，滴加化合物52(0.85g)的乙醇(20mL)-水(10mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(1.97mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(10mL)和乙醇(200mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(1.80g)。药物导入率为19.7摩尔％。
<工序4-2>双氯芬酸-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物53b)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-2)2g溶解于水(200mL)中，加入乙醇(60mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(611mg)。搅拌30分钟后，滴加化合物52(396mg)的乙醇(20mL)-水(10mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.92mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(10mL)和乙醇(200mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(2.04g)。药物导入率为14.6摩尔％。
<工序4-3>双氯芬酸-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物53c)的合成
使用海藻酸钠(持田制药株式会社，A-3)2g，进行与(实施例13)<工序4-2>同样的操作，得到作为白色固体的标记化合物(1.99g)。药物导入率为17.0摩尔％。
<工序4-4>双氯芬酸-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物53d)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，B-2)100mg溶解于水(10mL)中，加入乙醇(3mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(46mg)。搅拌10分钟后，滴加化合物52(40mg)的乙醇(2mL)-水(1mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.09mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)和乙醇(20mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(108mg)。药物导入率为23.1摩尔％。
(实施例14)双氯芬酸-(2-氨基-1-(4-(羟基甲基)哌啶-1-基)乙烷-1-酮)-海藻酸衍生物的合成
[化学式47]
<工序1>化合物55的合成
在4-哌啶甲醇(0.79g)和(叔丁氧基羰基)甘氨酸(1g)的乙醇(10mL)混合液中，在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(1.9g)，搅拌4小时。在反应悬浮液中加入乙酸乙酯，将悬浮液过滤，在减压下浓缩滤液。将残留物利用硅胶柱层析(0-20％甲醇/乙酸乙酯)纯化，得到作为白色无定形的化合物55(1.2g)。
<工序2>化合物56的合成
在市售的双氯芬酸(化合物10，0.87g)、化合物55(1.2g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.07g)、二氯甲烷(5mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(0.61g)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应液在室温下搅拌2小时。使用乙酸乙酯(50mL)将反应液过滤后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(5-50％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色无定形的化合物56(1.4g)。
<工序3>化合物57的合成
将化合物56(1.4g)和4N盐酸-1，4-二噁烷溶液(12.7mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应液在减压下过滤，得到作为白色无定形的化合物57(1.3g)。
<工序4>双氯芬酸-(2-氨基-1-(4-(羟基甲基)哌啶-1-基)乙烷-1-酮)-海藻酸衍生物(化合物58)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，B-2)100mg溶解于水(20mL)中，加入乙醇(5mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(39mg)。搅拌10分钟后，滴加化合物57(45mg)的乙醇(3mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.09mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)和乙醇(20mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(108mg)。药物导入率为18.4摩尔％。
(实施例15)双氯芬酸-(2-氨基-1-(4-羟基哌啶-1-基)乙烷-1-酮)-海藻酸衍生物的合成
[化学式48]
<工序1>化合物60的合成
在4-羟基哌啶(0.69g)和(叔丁氧基羰基)甘氨酸(1.0g)的乙醇(10mL)混合液中，在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(1.9g)，搅拌4小时。在反应悬浮液中加入乙酸乙酯，将悬浮液过滤，在减压下浓缩滤液。将残留物利用硅胶柱层析(0-20％甲醇/乙酸乙酯)纯化，得到作为白色无定形的化合物60(1.0g)。
<工序2>化合物61的合成
在市售的双氯芬酸(化合物10，0.76g)、化合物60(0.99g)、N,N--二甲基-4-氨基吡啶(0.06g)、二氯甲烷(5mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(0.53g)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应液在室温下搅拌2小时。使用乙酸乙酯(50mL)将反应液过滤后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(5-50％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色无定形的化合物61(1.0g)。
<工序3>化合物62的合成
将化合物61(1.0g)和4N盐酸-1，4-二噁烷溶液(9.3mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应液在减压下过滤，得到作为白色无定形的化合物62(0.91g)。
<工序4-1>双氯芬酸-(2-氨基-1-(4-(羟基甲基)哌啶-1-基)乙烷-1-酮)-海藻酸衍生物(化合物63a)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-2)1g溶解于水(100mL)中，加入乙醇(30mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(370mg)。搅拌10分钟后，滴加化合物62(350mg)的乙醇(10mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.74mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(10mL)和乙醇(100mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(1.07g)。药物导入率为11.5摩尔％。
<工序4-2>双氯芬酸-(2-氨基-1-(4-(羟基甲基)哌啶-1-基)乙烷-1-酮)-海藻酸衍生物(化合物63b)的合成
使用海藻酸钠(持田制药株式会社，A-3)1g，进行与(实施例15)<工序4-1>同样的操作，得到作为白色固体的标记化合物(1.09g)。药物导入率为12.6摩尔％。
(实施例16)双氯芬酸-(2-氨基-N-(6-羟基己基)乙酰胺)-海藻酸衍生物的合成
[化学式49]
<工序1>化合物65的合成
在6-氨基-1-己醇(0.8g)和(叔丁氧基羰基)甘氨酸(1g)的乙醇(10mL)混合液中，在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(1.9g)，搅拌4小时。在反应悬浮液中加入乙酸乙酯，将悬浮液过滤，在减压下浓缩滤液。将残留物利用硅胶柱层析(0-20％甲醇/乙酸乙酯)纯化，得到作为白色无定形的化合物65(1.6g)。
<工序2>化合物66的合成
在市售的双氯芬酸(化合物10，1.0g)、化合物65(1.39g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.08g)、二氯甲烷(5mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(0.7g)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应液在室温下搅拌2小时。使用乙酸乙酯(50mL)将反应液过滤后，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(10-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色无定形的化合物66(1.5g)。
<工序3>化合物67的合成
将化合物66(1.5g)和4N盐酸-1，4-二噁烷溶液(13.6mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应液在减压下过滤，得到作为白色无定形的化合物67(1.3g)。
<工序4>双氯芬酸-(2-氨基-N-(6-羟基己基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物68)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，B-2)100mg溶解于水(20mL)中，加入乙醇(5mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(39mg)。搅拌10分钟后，滴加化合物67(45mg)的乙醇(3mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.09mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)和乙醇(20mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(106mg)。药物导入率为18.0摩尔％。
(实施例17)双氯芬酸-(2-氨基-N-(2-羟基丙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物的合成
[化学式50]
<工序1>化合物70的合成
在1-氨基-2-丙醇(0.38g)、(叔丁氧基羰基)甘氨酸(0.88g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.12g)、二氯甲烷(20mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(1.03g)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应液在室温下彻夜搅拌。在该反应液中滴加市售的双氯芬酸(化合物10，1.48g)和N,N′-二环己基碳二亚胺(1.03g)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应液在室温下彻夜搅拌。过滤反应液后，将滤液在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(5-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色无定形的化合物70(0.74g)。
<工序2>化合物71的合成
将化合物70(0.74g)和4N盐酸-1，4-二噁烷溶液(8mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应液在减压下过滤，得到作为白色无定形的化合物71(0.7g)。
<工序3-1>双氯芬酸-(2-氨基-N-(2-羟基丙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物72a)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-2)1g溶解于水(100mL)中，加入乙醇(30mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(305mg)。搅拌30分钟后，滴加化合物71(205mg)的乙醇(10mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.46mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(5mL)和乙醇(100mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(1.04g)。药物导入率为13.1摩尔％。
<工序3-2>双氯芬酸-(2-氨基-N-(2-羟基丙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物72b)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-3)200mg溶解于水(20mL)中，加入乙醇(6mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(62mg)。搅拌10分钟后，滴加化合物71(41mg)的乙醇(2mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.09mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(1mL)和乙醇(40mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(199mg)。药物导入率为14.5摩尔％。
(实施例18)双氯芬酸-(2-氨基-N-(3-羟基丙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物的合成
[化学式51]
<工序1>化合物74的合成
在3-氨基-1-丙醇(0.38g)、(叔丁氧基羰基)甘氨酸(0.88g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.12g)、二氯甲烷(20mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(1.03g)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应液在室温下彻夜搅拌。在该反应液中滴加市售的双氯芬酸(化合物10、1.48g)和N,N′-二环己基碳二亚胺(1.03g)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应液在室温下彻夜搅拌。过滤反应液，将滤液在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(5-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色无定形的化合物74(1.4g)。
<工序2>化合物75的合成
将化合物74(1.4g)和4N盐酸-1，4-二噁烷溶液(14mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应液在减压下过滤，得到作为白色无定形的化合物75(1.3g)。
<工序3-1>双氯芬酸-(2-氨基-N-(3-羟基丙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物76a)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-2)1g溶解于水(100mL)中，加入乙醇(30mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(305mg)。搅拌30分钟后，滴加化合物75(205mg)的乙醇(10mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.46mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(5mL)和乙醇(100mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(1.03g)。药物导入率为13.7摩尔％。
<工序3-2>双氯芬酸-(2-氨基-N-(3-羟基丙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物76b)的合成
使用海藻酸钠(持田制药株式会社，A-3)1g，进行与(实施例18)<工序3-1>同样的操作，得到作为白色固体的标记化合物(0.99g)。药物导入率为14.4摩尔％。
(实施例19)双氯芬酸-(2-氨基-N-(1-羟基丙烷-2-基)乙酰胺)-海藻酸衍生物的合成
[化学式52]
<工序1>化合物78的合成
在3-氨基-1-丙醇(0.38g)、(叔丁氧基羰基)甘氨酸(0.88g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.12g)、二氯甲烷(20mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(1.03g)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应液在室温下彻夜搅拌。在该反应液中滴加市售的双氯芬酸(化合物10，1.48g)和N，N′-二环己基碳二亚胺(1.03g)的二氯甲烷(5mL)溶液。将反应液在室温下彻夜搅拌。过滤反应液，将滤液在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(5-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为白色无定形的化合物78(1.4g)。
<工序2>化合物79的合成
将化合物78(1.4g)和4N盐酸-1，4-二噁烷溶液(14mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应液在减压下过滤，得到作为白色无定形的化合物79(1.3g)。
<工序3-1>双氯芬酸-(2-氨基-N-(1-羟基丙烷-2-基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物80a)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-2)1g溶解于水(100mL)中，加入乙醇(30mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(305mg)。搅拌30分钟后，滴加化合物79(205mg)的乙醇(10mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.46mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(5mL)和乙醇(100mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(0.97g)。药物导入率为12.2摩尔％。
<工序3-2>双氯芬酸-(2-氨基-N-(1-羟基丙烷-2-基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物80b)的合成
使用海藻酸钠(持田制药株式会社，A-3)1g，进行与(实施例19)<工序3-1>同样的操作，得到作为白色固体的标记化合物(0.99g)。药物导入率为14.4摩尔％。
(实施例20)联苯乙酸-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物的合成
[化学式53]
<工序1>化合物82的合成
在市售的联苯乙酸(化合物81，1.0g)、化合物50(1.13g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.12g)、二氯甲烷(6mL)的混合物中，在冰冷却下滴加N,N′-二环己基碳二亚胺(1.07g)的二氯甲烷(4mL)溶液。将反应液在室温下搅拌2小时。使用乙酸乙酯(50mL)将反应液过滤后，用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水(20mL)依次洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物用乙醇磨碎，得到作为白色固体的化合物82(0.80g)。
<工序2>化合物83的合成
将化合物82(0.80g)和4N盐酸-1，4-二噁烷溶液(10mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应悬浮液过滤，将过滤获取的固体用二甲氧基乙烷磨碎，得到作为白色固体的化合物83(0.56g)。
<工序3>联苯乙酸-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物84)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-2)200mg溶解于水(20mL)中，加入乙醇(8mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(46mg)。搅拌10分钟后，滴加化合物83(32mg)的乙醇(2mL)-水(1mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.09mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(2mL)和乙醇(40mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(193mg)。药物导入率为10.8摩尔％。
(实施例21)酮洛芬-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物的合成
[化学式54]
<工序1>化合物86的合成
在市售的酮洛芬(化合物85，1.0g)、化合物50(0.94g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.1g)、二氯甲烷(10mL)的混合物中，在室温下加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.83g)。将反应液在室温下搅拌3小时。用乙酸乙酯(50mL)稀释反应液，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(5-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为无色胶状物质的化合物86(1.38g)。
<工序2>化合物87的合成
将化合物86(1.38g)和4N盐酸-1，4-二噁烷溶液(15mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应液在减压下馏去溶剂，得到作为白色无定形的化合物87(1.27g)。
<工序3>酮洛芬-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物88)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-2)200mg溶解于水(20mL)中，加入乙醇(6mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(46mg)。搅拌10分钟后，滴加化合物87(36mg)的乙醇(2mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.09mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(2mL)和乙醇(40mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(201mg)。药物导入率为11.9摩尔％。
(实施例22)萘普生-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物的合成
[化学式55]
<工序1>化合物90的合成
在市售的萘普生(化合物89，1.0g)、化合物50(1.04g)、N,N-二甲基-4-氨基吡啶(0.11g)、二氯甲烷(10mL)的混合物中，在室温下加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.92g)。将反应液在室温下搅拌3小时。用乙酸乙酯(50mL)稀释反应液，依次用饱和碳酸氢钠水溶液(20mL)和水(20mL)洗涤，用无水硫酸钠干燥后，在减压下馏去溶剂。将残留物利用硅胶柱层析(5-100％乙酸乙酯/庚烷)纯化，得到作为无色胶状物质的化合物90(1.39g)。
<工序2>化合物91的合成
将化合物90(1.39g)和4N盐酸-1，4-二噁烷溶液(15mL)的混合物在室温下搅拌30分钟。将反应液在减压下馏去溶剂，得到作为白色无定形的化合物91(1.28g)。
<工序3>酮洛芬-(2-氨基-N-(2-羟基乙基)乙酰胺)-海藻酸衍生物(化合物92)的合成
将海藻酸钠(持田制药株式会社，A-2)200mg溶解于水(20mL)中，加入乙醇(6mL)，在所得溶液中在室温下加入4-(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物(46mg)。搅拌10分钟后，滴加化合物91(34mg)的乙醇(2mL)溶液和1M碳酸氢钠水溶液(0.09mL)，在室温下搅拌4小时。在反应液中加入0.1g/mL的氯化钠水溶液(2mL)和乙醇(40mL)后，搅拌10分钟。过滤获取所得的沉淀，用乙醇洗涤后，进行减压干燥，得到作为白色固体的标记化合物(196mg)。药物导入率为12.9摩尔％。
(实施例23)使用了实施例12至实施例19中制作的化合物的双氯芬酸的释放试验、使用了实施例20中制作的化合物的联苯乙酸的释放试验、使用了实施例21中制作的化合物的酮洛芬的释放试验、使用了实施例22中制作的化合物的萘普生的释放试验
与(实施例10)的方法同样地，测定pH＝5.3或pH＝7.0的磷酸钠缓冲液中的双氯芬酸联苯乙酸、酮洛芬、和萘普生的游离药物量，算出释放率。
LC条件如以下所示：
温度：40℃
流速：0.7mL/min
柱：ODS-4：3μm(2.1×30mm)
溶剂：(A)0.1％甲酸水溶液、(B)100％乙腈
梯度：
[表9]
MS条件如以下所示：
离子化模式：ESI-negative
离子源温度：300度
毛细管电压：-4000V。
pH7.0的释放试验中的游离率
[表10]
。
pH7.0的释放试验中的游离率
[表11]
。
pH7.0的释放试验中的游离率
[表12]
。
pH5.3的释放试验中的游离率[表13]
。
pH5.3的释放试验中的游离率
[表14]
。
pH5.3的释放试验中的游离率
[表15]
。
(实施例24)
针对大鼠1％硝酸银引起疼痛模型的、(实施例13)中所得的化合物53b给予关节腔内所产生的效果
(1)引起疼痛的物质的给予
作为全身麻醉剂，使用异氟烷的吸入麻醉。
对于大鼠(Crj：SD系(SPF)，雄性，6周龄)，在麻醉下，在左后脚膝关节腔内以50μL/joint的用量给予1％硝酸银溶液。
(2)受试物质的给予
准备下述的受试物质。
·载体(VH)：以10mM磷酸缓冲液(PB)作为溶剂的5％葡萄糖溶液
·0.9mg/mL双氯芬酸Na包含于载体(DF)
·0.9％海藻酸Na(持田制药株式会社，A-2)包含于载体(ALG)
·0.9mg/mL双氯芬酸Na+0.9％海藻酸Na(持田制药株式会社，A-2)包含于载体(DF&ALG)
·实施例13中所得的化合物53b的0.9％溶液(DF-ALG)(结合体)
对于模型制作第二天的步行状态，进行评分。将所得的分数基于指标进行分组，在利用了异氟烷的吸入麻醉下，将各受试物质以0.1mL/kg给予大鼠左后脚膝关节内(n＝8)。
(3)评价方法
从受试物质给予日起1天1次连续5天对于步行分数进行记分。但是，对于第1天的分数，使用给予前(分组)的分数。使用在盲法下将步行状态进行了分数化的下述疼痛分数表，肉眼观察各组的步行状态。结果示于表16。
在表16中，结果通过平均疼痛分数来表示。
0：正常
1：抬起腿，轻度的跛行
2：完全闭塞脚尖的重度的跛行
3：3腿步行
根据表16，将双氯芬酸给予组、海藻酸给予组和双氯芬酸+海藻酸给予组等进行比较，DF-ALG(化合物53b)给予组的疼痛减轻的程度(从疼痛中的恢复度)快。
[表16]
。
(实施例25)导入双氯芬酸的海藻酸在兔膝关节中的缓释性的研究
(1)受试物质的给予方法
准备下述的受试物质。
·实施例13中所得的化合物53b的0.9％溶液(溶剂：含有5％葡萄糖的10mM磷酸缓冲液)(DF-ALG-53b)
·实施例15中所得的化合物63a的0.9％溶液(溶剂：含有5％葡萄糖、3％HP-β-CD的10mM磷酸缓冲液)(DF-ALG-63a)
对于前述各受试物质，各自使用4只兔，在无麻醉下使用毛巾将全身固定，将左膝关节周边用乙醇揩净后，利用装配有26G的注射针(TERUMO制)的TERUMO 1mL注射器从兔膝外侧向关节腔内各自以0.1mL/kg的量给予上述受试物质。在从给予受试物质起3天、7天、14天、28天、56天、和84天后，实施解剖检查。
(2)关节液中的游离型双氯芬酸(DF)量的测定方法
将兔在利用了盐酸氯胺酮和塞拉嗪的肌内给予的联合麻醉下放血处死。将关节囊在膝盖骨正下方切开，露出膝关节腔，使用サーフロ一留置针20G的导管，用2mL的生理盐水将关节腔内清洗，采集混在生理盐水中的关节液。将回收的关节液中的DF量按照下述步骤测定。
在关节液(0.05mL)中加入1NHCl(0.02mL)，充分搅拌后，在室温下孵育30分钟以上。进一步地，添加0.1％甲酸水溶液0.12mL和内标溶液(Celecoxib浓度0.1μ g/mL的甲醇溶液)0.01mL，充分搅拌后，以450G离心5分钟。将全部量的该上清添加到用甲醇0.2mL和纯化水0.2mL平衡化了的Oasis(注册商标)PRiME HLB μ-Elution Plate(提取柱)上，用气泵抽吸添加样品。用0.02mL的5％甲醇水溶液洗涤提取柱，用乙腈0.025mL从提取柱上洗脱药物(反复进行2次该洗脱操作)。在回收的洗脱液中加入0.1％甲酸水溶液0.05μL，使用LC-MS/MS测定游离双氯芬酸量。(关节液中的游离型双氯芬酸量)
(3)滑膜中双氯芬酸(DF)浓度的测定方法
从回收上述(2)的关节液后的膝关节中分离、采集滑膜组织。采集的滑膜组织用生理盐水洗涤，除去附着的关节液。在去除膝盖骨后，将滑膜组织放入管中，用剪刀将组织剪成碎片。在放入了不锈钢珠的管中取入滑膜组织50mg左右，添加19倍的纯化水，使用珠式均化器进行均浆化。在均浆(0.1mL)中加入1NHCl(0.02mL)，充分搅拌后，在室温下孵育30分钟以上。进一步地，添加0.1％甲酸水溶液0.07mL和内标溶液(Celecoxib浓度0.1μg/mL的甲醇溶液)0.01mL，充分搅拌后，以450G离心5分钟。将该上清全部量添加到用甲醇0.2mL和纯化水0.2mL平衡化的Oasis(注册商标)PRiME HLB μ-Elution Plate(提取柱)中，用气泵抽吸添加样品。进行与上述(2)同样的提取操作，使用LC-MS/MS，测定游离双氯芬酸量。结果示于表17。
作为本发明物质、即(DF-ALG-53b)和(DF-ALG-63a)(结合体)作为受试物质给予的情况下，即使在给予后56～84天也确认在滑膜组织有游离双氯芬酸的存在，推测在给予部位持续地存在双氯芬酸，显示持续效果(表17：滑膜组织的DF浓度(ng/g))。
在关节产生的疼痛推测是起因于滑膜炎，另外，认为在关节腔内给予NSAIDs时，NSAIDs迅速向滑膜转移，显示镇痛/抗炎症作用。因此，认为由缓释效果带来的滑膜中的NSAIDs浓度的维持与疼痛抑制的持续性效果相关性大。
[表17]
。
根据上述表17，在给予作为DF-ALG(结合体)的(DF-ALG-53b)和(DF-ALG-63a)的情况下，在滑膜组织直至给予后84天持续地保持DF，暗示了作为DF的缓释性制剂是有效的。
特别地，与在现有技术(BMC Musculoskeletal Disorders(2018)19：P157～)中记载的DF-HA(结合体)给予时的滑膜中DF浓度(约10ng/g(day28)、<5ng/g(day35))(参考文献中Fig.7a)相比，DF-ALG(结合体)给予时的滑膜中双氯芬酸浓度即使在给予后84天仍然是高的，可期待持续长期(例如2～3个月)的疼痛抑制效果。
《分子量测定结果》
海藻酸衍生物的分子量测定结果
[表18]
原料海藻酸的分子量测定结果
[表19]
。
由上述释放试验(in vitro试验)和动物实验(in vivo试验)的结果可知，通过连接体的结构，可调节缓释速度，且通过调节连接体的种类和药物导入率，本发明的衍生物可期待可长期持续的镇痛作用、抗炎症作用。
具体地，实施例1中所得的化合物5a在pH7.0的释放试验中，在第3天可确认2.3％的游离率，而且在第7天可确认4.1％的游离率。同样地，化合物5b、化合物5c、化合物5d、化合物42和化合物47也可稳定地释放。进一步地，实施例13中所得的化合物53b在pH7.0的释放试验中，在第3天可确认3.7％的游离率，而且在第7天可确认10.0％的游离率。另外，实施例15中所得的化合物63a在pH7.0的释放试验中，在第3天可确认0.8％的游离率，而且在第7天可确认2.2％的游离率。对于任一化合物而言，天数和游离率均大致成比例，由此可以期待稳定地缓释。
另外，在炎症部位，一般成为酸性，有pH在中性至弱酸性之间变化的可能性，与之相应，有缓释速度变化的可能性，但通过调节连接体的结构，可以构成即使pH变化、也具有稳定的缓释作用的镇痛/抗炎剂。
进一步地，对于前述化合物53b和63a在兔膝关节滑膜中的双氯芬酸量进行测定，作为结果，如前述表17那样观测到第28天、第56天、第84天的滑膜中的双氯芬酸的游离体。
已知疼痛抑制效果依赖于滑膜中的双氯芬酸量，在第28天、第56天、第84天可得到化合物53b和63a这两种化合物均可维持高于表现疼痛抑制效果的最低量(5ng/g)的结果，因此，对于本发明的连接了非甾体抗炎化合物的海藻酸衍生物、尤其是连接了双氯芬酸的海藻酸衍生物而言，可期待使长期(例如2～3个月)的疼痛抑制得以持续。
应予说明，根据释放试验(in vitro试验)和动物实验(in vivo试验)的两个结果，如果释放试验中的第7天的游离率优选为2％左右，则连接了非甾体抗炎化合物的海藻酸衍生物可期待2～3个月持续的疼痛抑制。