一种低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物及其应用

技术领域

本发明涉及抑菌剂领域，特别涉及一种低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物及其应用。

背景技术

植物病害是造成农作物损失的重要原因之一，而真菌是引起各类植物病害的重要病原物之一。近年来，直接应用天然产物或结构修饰已成为发现和创造新农药的有效途径。壳聚糖是一种天然的高分子多糖，具有生物相容性、安全无毒、抗氧化及抗菌等特点，使得壳聚糖广泛应用于食品、医药、化妆品等领域，但其生物活性较弱，作为抑菌剂效果较差。

发明内容

本发明的目的在于提供一种低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物及其应用，将具有抑菌活性的烟酸(VPP)、2-氯烟酸(2-CNA)和2-氨基烟酸(2-ANA)等烟酸类化合物接枝到低分子量壳聚糖上，制得新型低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物；采用菌丝生长速率法，测定了衍生物对辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、甘薯间座核菌和番茄早疫病菌的抑制效果，结果表明，本发明衍生物的抑真菌效果均明显高于壳聚糖原料。

为解决上述问题，本发明采用如下技术方案：

根据本发明的第一方面，本发明提供了一种低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物，所述低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物的结构通式如式I所示：

其中，n为选自13-23的整数，R为以下结构式中的任意一种：

进一步的，上述低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物的制备方法为：由烟酸类化合物上的羧基与低分子量壳聚糖C

进一步的，上述低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物的制备方法包括如下步骤：将烟酸类化合物溶于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺搅拌活化；接着加入低分子量壳聚糖搅拌反应，低分子量壳聚糖氨基与烟酸类化合物羧基反应形成酰胺；之后用透析袋在蒸馏水中透析，最后将透析袋内的溶液浓缩、冷冻干燥制得低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物。本发明中采用蒸馏水透析的目的是让小分子杂质去除的更加彻底；采用浓缩工艺可以除去多余的水分，缩小体积；因为本发明获得的化合物高温易分解，所以通过低温冷冻干燥彻底除去水分，液态变固态粉末，就是成品。

进一步的，所述烟酸类化合物为烟酸、2-氯烟酸、2-氨基烟酸中的任一一种。

进一步的，壳聚糖溶于pH<6.5的稀酸，不溶于水和碱溶液；因此，优选的本发明所用2-吗啉乙磺酸缓冲溶液的pH＝5.5-6.5，浓度为0.1mol/L。

进一步的，烟酸类化合物：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐：N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:3:3为实验的理论投料比，而实际过程中需要略高于理论值，但是为了防止浪费，最高值一般为1:5:5；因此，优选的烟酸类化合物：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐：N-羟基丁二酰亚胺的摩尔比为1:3:3-1:5:5。

进一步的，所用低分子量壳聚糖的分子量为n＝13-23，低分子量壳聚糖的氨基与烟酸类化合物的羧基的摩尔比略小于1:1，使反应体系中羧基略微过量；有利于低分子壳聚糖氨基充分发生酰胺反应。

进一步的，所用透析袋的截留分子量为1500Da，用于除去未参与反应的部分烟酸类化合物、EDC·HCl和NHS，低分子量壳聚糖本身属于大分子，Mn>2000Da，反应后目标低分子量壳聚糖衍生物分子量只会增大不会减少。

根据本发明的第二方面，本发明提供了一种上述低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物的应用，用作辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、甘薯间座核菌、番茄早疫病菌的抑菌剂。

根据本发明的第三方面，本发明提供了一种上述低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物的应用，用作圣女果保鲜。

本发明部分工艺原理的补充说明如下：

本发明中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐，简称EDC·HCl，是水溶性碳二亚胺，分子呈线性结构，用于羧基与伯胺的缩合反应。EDC·HCl通过与氨基反应形成可与氨基反应的O-酰基脲中间体。如果该中间体不与氨基反应，则会很快水解并重新释放出羧基基团。在N-羟基丁二酰亚胺(NHS)存在的情况下，EDC·HCl可以将羧基转变为氨基反应活性的NHS酯。这步反应通过将EDC·HCl、含羧基的分子以及NHS混合即可实现。EDC·HCl在本发明中作为缩合剂，可实现快速脱水缩合。

N-羟基丁二酰亚胺，简称NHS，存在EDC的条件下在羧酸中通过脱水反应合成NHS酯。NHS的存在使EDC介导偶联的效率提高，可以使用任何含羧基的分子制备胺反应性NHS酯。本发明中NHS可控制与壳寡糖氨基偶联的羧酸盐活化的碳二亚胺交联反应。

本发明的有益效果在于：本发明提供了一种低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物及其应用，本发明将具有抑菌活性的烟酸(VPP)、2-氯烟酸(2-CNA)、2-氨基烟酸(2-ANA)等烟酸类化合物接枝到低分子量壳聚糖上，生成新型低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物；采用菌丝生长速率法，测定了衍生物对辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、甘薯间座核菌和番茄早疫病菌的抑制效果，结果表明，本发明衍生物的抑真菌效果均明显高于壳聚糖原料。此外，本发明测定了几种衍生物的细胞毒性，结果表明衍生物具有良好的细胞相容性。最后将制备的化合物应用到圣女果保鲜上，研究表明经过壳聚糖烟酰胺类衍生物处理后，可以显著降低圣女果的失重率，延缓VC含量和可滴定酸含量的下降，可以有效延长圣女果的货架期。

附图说明

图1是本发明低分子量壳聚糖烟酰胺类衍生物的结构式。

图2是现有低分子量壳聚糖(n＝13-23)的红外光谱图。

图3是本发明实施例1低分子量壳聚糖(n＝13-23)与烟酸反应所得吡啶-3-甲酰基壳聚糖的红外光谱图。

图4是本发明实施例2低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氯烟酸反应所得2-氯吡啶-3-甲酰基壳聚糖的红外光谱图。

图5是本发明实施例3低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氨基烟酸反应所得2-氨基吡啶-3-甲酰基壳聚糖的红外光谱图。

图6是本发明低分子量壳聚糖(n＝13-23)与烟酸反应所得吡啶-3-甲酰基壳聚糖的

图7是本发明低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氯烟酸反应所得2-氯吡啶-3-甲酰基壳聚糖的

图8是本发明低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氨基烟酸反应所得2-氨基吡啶-3-甲酰基壳聚糖的

图9是本发明低分子量壳聚糖(n＝13-23)与烟酸反应制备吡啶-3-甲酰基壳聚糖的反应式。

图10是本发明低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氯烟酸反应制备2-氯吡啶-3-甲酰基壳聚糖的反应式。

图11是本发明低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氨基烟酸反应制备2-氨基吡啶-3-甲酰基壳聚糖的反应式。

图12是本发明不同浓度的壳聚糖及壳聚糖衍生物对辣椒疫霉病菌的抑菌活性统计图。

图13是本发明不同浓度的壳聚糖及壳聚糖衍生物对小麦赤霉病菌的抑菌活性统计图。。

图14是本发明不同浓度的壳聚糖及壳聚糖衍生物对甘薯间座核菌的抑菌活性统计图。。

图15是本发明不同浓度的壳聚糖及壳聚糖衍生物对番茄早疫病菌的抑菌活性统计图。。

图16是本发明不同浓度的壳聚糖及壳聚糖衍生物对L929细胞的细胞毒性统计图。

图17是本发明不同浓度的壳聚糖及壳聚糖衍生物处理对圣女果失重率的影响统计图。。

图18是本发明不同浓度的壳聚糖及壳聚糖衍生物处理对圣女果VC含量的影响统计图。

图19是本发明不同浓度的壳聚糖及壳聚糖衍生物处理对圣女果可滴定酸含量的影响统计图。

具体实施方式

为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面将结合具体的实施例对本发明作进一步的详细介绍，以下所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制；实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

一种低分子壳聚糖(n＝13-23)与烟酸反应制备吡啶-3-甲酰基壳聚糖的方法，包括如下步骤：

步骤一，烟酸羧基活化。将烟酸溶于2-吗啉乙磺酸缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至全部溶解，继续搅拌3h对羧基进行活化。所用2-吗啉乙磺酸缓冲溶液的pH＝5.5-6.5，浓度为0.1mol/L，用量为100mL；其它试剂用量(摩尔比)，烟酸：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐：N-羟基丁二酰亚胺＝1:3:3-1:5:5。

步骤二，低分子壳聚糖与活化后的烟酸进行酰胺反应。向步骤一中加入1.0g低分子壳聚糖(n＝13-23)，继续在室温下搅拌反应24h，使得壳聚糖氨基与烟酸羧基反应形成酰胺；烟酸与壳聚糖(n＝13-23)的反应摩尔比为13:1-23:1。

步骤三，目标化合物分离提纯。将步骤二反应后的产物用透析袋在蒸馏水中透析4天，之后将透析袋内的溶液浓缩至30mL左右，接着冷冻干燥48h，制得吡啶-3-甲酰基壳聚糖。所用透析袋的截留分子量为1500Da。

实施例1制得的吡啶-3-甲酰基壳聚糖，其结构式参见图1，其中，R＝

采用红外光谱分析如下：如图2所示，是现有低分子壳聚糖(n＝13-23)的红外光谱图，其特征红外(cm

采用核磁共振碳谱分析如下：如图6所示，是低分子壳聚糖(n＝13-23)与烟酸反应所得吡啶-3-甲酰基壳聚糖的

分析表明：174.69ppm为酰胺键的C＝O碳的化学位移；101.35-98.37(C1)，76.90(C4)，74.86(C5)，72.64-69.65(C3)，61.85(C6)，55.38-52.17(C2)ppm为低分子壳聚糖糖环的化学位移；160.62，150.30，148.96，143.00，137.96，124.56ppm为烟酸碳链的化学位移。由以上结果可以证明目标化合物的形成。

实施例2

一种低分子壳聚糖(n＝13-23)与2-氯烟酸反应制备2-氯吡啶-3-甲酰基壳聚糖的方法，制备过程与实施例1相同，用2-氯烟酸替代烟酸即可。

实施例2制得的2-氯吡啶-3-甲酰基壳聚糖，其结构式参见图1，其中R＝

采用红外光谱分析如下：如图4所示，是实施例2低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氯烟酸反应所得2-氯吡啶-3-甲酰基壳聚糖的红外光谱图；其特征红外(cm

采用核磁共振碳谱分析如下：如图7所示，是低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氯烟酸反应所得2-氯吡啶-3-甲酰基壳聚糖的

分析表明：174.68ppm为酰胺键的C＝O碳的化学位移；102.50-98.84(C1)，76.41(C4)，74.43(C5)，72.86-69.61(C3)，61.86(C6)，55.76(C2)ppm为低分子壳聚糖糖环的化学位移；159.82，150.74，148.79，145.47，137.68，135.55，123.62ppm为2-氯烟酸碳链的化学位移。由以上结果可以证明目标化合物的形成。

实施例3

一种低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氨基烟酸反应制备2-氨基吡啶-3-甲酰基壳聚糖的方法，制备过程与实施例1相同，用2-氨基烟酸替代烟酸即可。

实施例3制得的2-氨基吡啶-3-甲酰基壳聚糖，其结构式参见图1，其中R＝

采用红外光谱分析如下：如图5所示，是实施例3低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氨基烟酸反应所得2-氨基吡啶-3-甲酰基壳聚糖的红外光谱图；其特征红外(cm

采用核磁共振碳谱分析如下：如图11所示，是低分子量壳聚糖(n＝13-23)与2-氨基烟酸反应所得2-氨基吡啶-3-甲酰基壳聚糖的

分析表明：174.74ppm为酰胺键的C＝O碳的化学位移；101.37-98.93(C1)，76.91(C4)，74.87(C5)，69.67(C3)，61.83(C6)，55.40(C2)ppm为低分子壳聚糖糖环的化学位移；160.03，144.57，116.04，113.41ppm为2-氨基烟酸碳链的化学位移。由以上结果可以证明目标化合物的形成。

进一步的，本发明采用菌丝生长速率法，测定了上述衍生物对辣椒疫霉病菌、小麦赤霉病菌、甘薯间座核菌和番茄早疫病菌的抑制效果，具体如下。

菌丝生长速率法：在无菌工作台中，将样品溶于无菌水中得到初始浓度为10.0mg/mL的样品溶液，用0.22μm的无菌过滤器过滤样品溶液(用于除去样品中存在的杂质)，将过滤后的样品溶液稀释成一系列浓度。在超净工作台中，取4.5mL样品溶液，加入40.5mL融化好的液体PDA培养基，使供试样品的最终浓度为1、0.5、0.25、0.125、0.0625mg/mL，充分混匀后，均匀倒入3个培养皿中，置于超净工作台中待其冷却凝固。以无菌水作为对照。在凝固好的培养基中心接种上待测菌株以后，倒置于霉菌培养箱中25℃下培养，48小时后采用十字交叉法测量菌落生长直径。抑菌率由下式计算：

菌落生长直径＝两次直径平均值-菌饼直径

每个实验进行三次平行测试，数据表示为平均值±标准偏差(SD，n＝3)。使用单因素方差分析检验确定显著性差异。P<0.05的水平被认为具有统计学显著性。

抑菌实验结果分析如下：如图12所示，是三种低分子量壳聚糖衍生物(VPPLCS、2-CNALCS和2-ANALCS)以及低分子量壳聚糖原料(LCS)和阳性对照(武夷菌素)对辣椒疫霉病菌的抑菌活性。随着供试浓度的增大，衍生物对辣椒疫霉病菌的抑制率逐渐增加，其中VPPLCS对辣椒疫霉病菌的抑制率随浓度的变化较为显著，而2-CNALCS随浓度的变化不显著。三种衍生物对辣椒疫霉病菌的抑制率显著高于壳聚糖原料，在供试浓度为1.0mg/mL时VPPLCS、2-CNALCS、2-ANALCS、LCS和武夷菌素的抑制率分别为(84.54±2.13)％、(77.34±3.35)％、(71.93±2.5)％、(56.26±1.88)％和(93.01±2.69)％。在供试浓度为0.0625mg/mL时VPPLCS、2-CNALCS、2-ANALCS、LCS和武夷菌素的抑制率分别为(50.53±3.18)％、(68.82±2.39)％、(56.64±2.6)％、(18.2±4.87)％和(87.4±4.25)％。在0.0625mg/mL时，衍生物对辣椒疫霉病菌的抑制率显著高于壳聚糖原料。三种衍生物中2-CNALCS对辣椒疫霉病菌的抑制效果最好。

如图13所示，是三种低分子量壳聚糖衍生物(VPPLCS、2-CNALCS和2-ANALCS)以及低分子量壳聚糖原料(LCS)和阳性对照(武夷菌素)对小麦赤霉病菌的抑菌活性。随着供试浓度的增大，衍生物对小麦赤霉病菌的抑制率逐渐增加，衍生物对小麦赤霉病菌的抑制率随浓度的变化较为显著。三种衍生物对小麦赤霉病菌的抑制率显著高于壳聚糖原料，在供试浓度为0.5mg/mL时VPPLCS、2-CNALCS、2-ANALCS、LCS和武夷菌素的抑制率分别为(47.13±3.84)％、(49.96±5.44)％、(43.82±4.02)％、(22.28±1.61)％和(78.27±6.52)％。三种衍生物中VPPLCS和2-CNALCS对小麦赤霉病菌的抑制效果较好，其次是2-ANALCS。

如图14所示，是三种低分子量壳聚糖衍生物(LVPPCS、2-CNALCS和2-ANALCS)以及低分子量壳聚糖原料(LCS)和阳性对照(武夷菌素)对甘薯间座核菌的抑菌活性。随着供试浓度的增大，衍生物对甘薯间座核菌的抑制率逐渐增加，衍生物对甘薯间座核菌的抑制率随浓度的变化较为显著。三种衍生物对甘薯间座核菌的抑制率显著高于壳聚糖原料，在供试浓度为1.0mg/mL时VPPLCS、2-CNALCS、2-ANALCS、LCS和武夷菌素的抑制率分别为(73.73±3.45)％、(70.35±1.88)％、(60.45±6.02)％、(48.4±2.48)％和(84.58±4.44)％。三种衍生物中VPPLCS对甘薯间座核菌的抑制效果最好，其次是2-CNALCS。

如图15所示，是三种低分子量壳聚糖衍生物(VPPLCS、2-CNALCS和2-ANALCS)以及低分子量壳聚糖原料(LCS)和阳性对照(武夷菌素)对番茄早疫病菌的抑菌活性。随着供试浓度的增大，衍生物对番茄早疫病菌的抑制率逐渐增加，VPPLCS和2-CNALCS对番茄早疫病菌的抑制率随浓度的变化较为显著，而2-ANALCS对番茄早疫病菌的抑制率随浓度的变化不显著。三种衍生物对番茄早疫病菌的抑制率显著高于壳聚糖原料，壳聚糖原料在供试浓度为0.0625-0.25mg/mL时对番茄早疫病菌没有抑制效果，在供试浓度为0.5mg/mL时VPPLCS、2-CNALCS、2-ANALCS、LCS和武夷菌素的抑制率分别为(67.07±1.62)％、(64.11±0.78)％、(75.73±1.51)％、(25.06±3.53)％和(86.93±0.57)％。三种衍生物中2-ANALCS对番茄早疫病菌的抑制效果最好，在浓度为0.0625mg/mL时，其抑制率达(74.48±1.17)％，显著高于VPPLCS和2-CNALCS对番茄早疫病菌的抑制效果。

进一步的，本发明还研究了壳聚糖及其衍生物对L929细胞活性的影响；壳聚糖衍生物的细胞毒性如图16所示，三种衍生物的细胞活力均大于90％，且2-CNALCS的细胞活性明显高于2-CNA，在2mg/mL时，三种衍生物的细胞活性均高于100％，表明样品对细胞的生长无抑制作用，说明衍生物具有良好的生物相容性。从图中还可以发现，衍生物的细胞活力总体上大于原料的细胞活力，说明壳聚糖降低了烟酸类化合物的毒性，使得到的衍生物具有良好的生物相容性。此外，壳聚糖与烟酸类化合物的结合可以降低烟酸类化合物的毒性，扩大其应用范围。

进一步的，本发明还研究了衍生物对圣女果的保鲜作用，具体如下。

挑选无病虫害、无机械损伤、成熟度基本一致、大小相近、色泽均匀的新鲜圣女果。将圣女果用蒸馏水清洗干净，并在室温下自然干燥。测试组每组分别含有27个樱桃番茄。将圣女果果实浸入待测药品溶液(0、0.5、1.0、1.5、2.0g/L)中3min，将涂层果实在室温下自然晾干。分装于厚度为0.1mm的普通PE薄膜保鲜袋置于25℃人工气候箱中贮藏。将来自每组的樱桃番茄在25℃储存0、4、8、12、16、20、24、28和32天。在贮藏期间的第0、4、8、12、16、20、24、28和32天，从每组中随机选择3个樱桃番茄进行测定。每个处理重复三次。

失重率测定：采用称重法测定圣女果的失重率，每组3个果实，重复3次，按照下式计算：

式中：m

失重率是影响果蔬商品价值的一个重要因素。果蔬采摘以后，果实仍要进行蒸腾作用和呼吸作用，这导致果实的水分散失和营养物质的消耗，从而直接影响果实的品质。圣女果在贮藏期间的重量损失变化如图17所示，图中展示了不同浓度的壳聚糖及其衍生物处理对圣女果失重率的影响，图中a-e不同的字母表示差异显著(p＜0.05)。随着贮藏时间的延长，各组样品的失重率均逐渐增加，空白处理的圣女果的失重率显著高于样品处理。在贮藏的第32天，2g/LVPPLCS处理的圣女果的失重率为(4.0±0.52)％，其显著低于壳聚糖原料的(5.5±1.33)％和空白处理的(5.94±1.02)％，说明衍生物的处理在圣女果的表面形成了一层保护膜，防止氧气渗透到外部环境中，从而减弱了其蒸腾作用和呼吸作用，有效缓解了水分散失，缓解了圣女果失重率的下降。

进一步的，本发明还研究了衍生物对圣女果保鲜过程中VC含量变化的影响。

首先准确称取V

V

式中：μ为从标准曲线上查得的VC含量(μg)，V

圣女果中VC含量比较高，但是在贮藏的过程中，VC的含量容易因氧化而降低。图18为不同浓度的壳聚糖及其衍生物处理对圣女果V

进一步的，本发明还研究了衍生物对圣女果保鲜过程中可滴定酸含量的变化。

首先将10.0g圣女果样品于研钵中磨碎，转移到100mL的容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀。于室温下静置提取30min，过滤，吸取20mL滤液，滴加两滴酚酞指示剂，用标定过的NaOH溶液进行滴定试验。滴定至溶液变为粉红色并保持30s不褪色即为滴定终点，记录此时所消耗的NaOH溶液的体积，重复测定三次取平均值。再以蒸馏水代替滤液进行滴定，作为空白对照。

可滴定酸的含量计算公式如下：

式中：V

图19展示了本发明不同浓度的壳聚糖及其衍生物处理对圣女果可滴定酸含量的影响，a-e不同的字母表示差异显著(p＜0.05)。

图中显示了圣女果在贮藏期间可滴定酸含量的变化。随着贮藏时间的延长，各组的可滴定酸含量逐渐减低，其中对照组的下降幅度最为明显。三种衍生物处理后的圣女果可滴定酸含量显著高于空白对照组(p＜0.05)，在处理的第32天，1g/L的LCS、VPPLCS、2-CNALCS和2-ANALCS处理的圣女果可滴定酸含量分别为(0.30±0.02)％、(0.38±0.02)％、(0.31±0.02)％和(0.35±0.03)％，而空白对照组的可滴定酸含量为(0.25±0.03)％。结果表明，在圣女果贮藏期间，壳聚糖衍生物的使用可以缓解可滴定酸含量的下降。

上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化。而由此所引申出的显而易见的变化都属于本发明的保护范围。最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。