一种高选择性的细菌印迹聚合物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种高选择性的细菌印迹聚合物及其制备方法与其在电厂换流站循环水中吸附并去除细菌的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

电厂循环水的处理原理是将用于冷却发电设备的水进行循环利用，以减少水资源的消耗。在换流站循环冷却水系统中，循环水的温度、pH和营养成分为细菌的生长增殖提供了适宜环境，细菌的大量滋生不仅会沉积到各种设备的表面以及内部，造成设备的换热效率下降、冷却塔局部堵塞和传热阻力增加而导致设备损坏等一系列问题；而且细菌可以通过冷却水系统中产生的气溶胶传播到环境中，造成传染性的疾病。因此对于电厂换流站循环水系统中细菌的去除至关重要。

各种杀菌剂例如：次氯酸盐、二氧化氯、溴和臭氧等的使用可以缓解电厂换流站循环水系统中细菌产生的生物污染。但是包含氯的杀菌剂的废水排放会影响到自然环境中的水质，例如氯在自然环境中与有机物质接触时会形成致癌化合物，如氯甲烷等；同时此类氧化杀菌剂会使得细菌发生裂解，而裂解之后的物质会促进细菌的生长并限制了氧化杀菌剂的杀菌效果，因此种种原因制约了此类氧化杀菌剂用于电厂换流站循环水系统中细菌的去除。

细菌印迹聚合物(Bacterial Imprinting Polymer，BIP)是为模板(细菌细胞)量身定做的吸附材料。在制备细菌印迹聚合物时，首先由功能单体与模板通过共价或非共价的方式形成复合物，然后加入交联剂，引发聚合形成高分子吸附剂。这种吸附剂能够特异性的吸附模板及其类似物，而不管基质成分如何复杂。因此以目标细菌为模板，制备出细菌印迹聚合物，可以快速识别细菌并进行吸附分离。但是现有技术中均只采用单一细菌为模板，只能消灭其中一种细菌，且选择和吸附的效果差，对于电厂换流站循环水系统中复杂的细菌去除效果不理想，同时不能保证吸附的细菌全部被杀灭。

发明内容

为了克服上述问题，本发明提供了一种高选择性的细菌印迹聚合物及其制备方法与应用，本发明中以多种细菌为模板合成细菌印迹聚合物的前体物，经过筛选可以获得高选择性的细菌印迹聚合物，可以同时识别和吸附去除多种细菌，且交联剂中的四氧化三铁纳米颗粒可以作为光热敏感剂，在激光的照射下具有良好的光热效果，进而可以杀灭吸附的细菌。

为实现上述技术目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供了一种高选择性的细菌印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用仿生矿化技术以混合细菌细胞为模板制备细菌印迹聚合物材料的前体物；

(2)分别利用磷酸盐缓冲液以及Tris缓冲液清洗混合细菌细胞，将清洗后的混合细菌细胞以1×10

其中混合细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌。

在一种或多种实施方式中，所述步骤(1)以及步骤(2)中混合细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌。

在一种或多种实施方式中，所述步骤(1)中细菌印迹聚合物材料的前体物的制备方法包括以下步骤：

S1、将四氧化三铁纳米颗粒与水混匀后，依次加入氯化钙和磷酸氢二钠，混合均匀后，得到磷酸钙混合四氧化三铁纳米颗粒复合物；

S2、向混合细菌细胞的离心沉淀物中加入海藻酸钠溶液，后加入S1中磷酸钙混合四氧化三铁纳米颗粒复合物，再加入交联剂，静置，用磁铁分离得到细菌印迹聚合物材料的前体物。

优选的，所述步骤S1中反应装置置于超声机中，超声频率为40～80Hz，优选为60Hz。

优选的，所述步骤S1中四氧化三铁纳米颗粒、水、氯化钙和磷酸氢二钠的质量比为0.8～1.1:2000:1.4～1.5:3.5～3.7，优选为1:2000:1.47:3.58。

优选的，所述步骤S2中混合细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌。

优选的，所述步骤S2中混合细菌细胞的离心沉淀物的制备方法包括：取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌的混合菌液放于离心机中，在6000rpm下离心5min，并用PBS缓冲液洗涤三次以彻底去除培养基成分，最后一次离心后去除上清液，得到混合细菌细胞的离心沉淀物。

优选的，加入交联剂静置的时间为6～8h。

在一种或多种实施方式中，玻璃片的预处理的方法包括：

将玻璃片放在浓盐酸与浓硝酸的混合溶液中浸泡12～24h，后利用超纯水冲洗3～5次；后将聚乙烯亚胺溶液均匀地旋涂在玻璃片的表面，静置3～5h后用超纯水冲洗。

优选的，所述浓盐酸的溶质的质量分数为36％～38％，浓硝酸的的溶质的质量分数为65％～68％；浓盐酸与浓硝酸体积比为3:1。

优选的，所述聚乙烯亚胺溶液的溶质的质量分数为0.1～0.3％，优选为0.2％。

利用浓盐酸与浓硝酸的混合溶液浸泡可以使得玻璃片的表面更加的粗糙，进而使得细菌细胞固定在玻璃片的表面，同时将聚乙烯亚胺溶液均匀地旋涂在玻璃片的表面也是为了将细菌细胞固定在玻璃片的表面。

在一种或多种实施方式中，所述步骤(2)中静置的时间为1～2h。

细菌印迹聚合物材料的前体物上的印迹空腔来源于模板细菌细胞表面的生物信息，由于不同细菌细胞表面有一些结构相似的分子，例如蛋白质和多糖等，从而使得细菌印迹聚合物材料的前体物不能特异性识别目标细菌。因此，将细菌印迹聚合物材料的前体物中由模板细菌细胞表面结构相似的蛋白质和多糖印迹导致的非特异性识别部分细菌印迹聚合物材料的前体物中去除，可以制备对目标细菌具有高亲和力的细菌印迹材料。与传统印迹方法制备的细菌印迹材料相比，该方法制备的细菌印迹材料作为细菌矿化外壳的高亲和力片段，可以特异性地识别目标细菌。

本发明的第二个方面，提供由上述制备方法制备的高选择性的细菌印迹聚合物。

本发明的第三个方面，提供上述高选择性的细菌印迹聚合物在换流站循环冷却水系统中识别、吸附及消灭细菌中的应用。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明中以多种细菌为模板合成细菌印迹聚合物的前体物，经过筛选可以获得高选择性的细菌印迹聚合物。本发明的高选择性的细菌印迹聚合物具有高吸附性能，能够选择性的吸附目标细菌，能够实现细菌的高通量富集，同时，交联剂中的四氧化三铁纳米颗粒可以作为光热敏感剂，在激光的照射下具有良好的光热效果，在近红外光的作用下将光能转换为热能，实现目标细菌的杀灭，而且本申请在灭菌的过程中不会产生毒副产物以及新的底物，不会对环境产生危害且不会进一步促进细菌的生长与繁殖。

(2)细菌印迹聚合物材料的前体物上的印迹空腔来源于模板细菌细胞表面的生物信息，由于不同细菌细胞表面有一些结构相似的分子，例如蛋白质和多糖等，从而使得细菌印迹聚合物材料的前体物不能特异性识别目标细菌。因此，将细菌印迹聚合物材料的前体物中由模板细菌细胞表面结构相似的蛋白质和多糖印迹导致的非特异性识别部分细菌印迹聚合物材料的前体物中去除，可以制备对目标细菌具有高亲和力的细菌印迹材料。与传统印迹方法制备的细菌印迹材料相比，该方法制备的细菌印迹材料作为细菌矿化外壳的高亲和力片段，可以特异性地识别目标细菌。

附图说明

图1为本发明实施例1中高选择性的细菌印迹聚合物的制备流程；

图2为本发明实施例1中高选择性的细菌印迹聚合物的扫描电镜图片；

图3为本发明实验例1中过滤细菌的装置；

图4为本发明实验例1中利用实施例1和对比例1中制备的细菌印迹聚合物处理换流站循环冷却水中细菌的效果图；

图5为本发明实验例2中利用实施例1制备的细菌印迹聚合物杀灭换流站循环冷却水中细菌的效果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的第一种典型的实施方式，提供了一种高选择性的细菌印迹聚合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用仿生矿化技术以混合细菌细胞为模板制备细菌印迹聚合物材料的前体物；

(2)分别利用磷酸盐缓冲液以及Tris缓冲液清洗混合细菌细胞，将清洗后的混合细菌细胞以1×10

在一种或多种实施方式中，所述步骤(1)以及步骤(2)中混合细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌。

在一种或多种实施方式中，所述步骤(1)中细菌印迹聚合物材料的前体物的制备方法包括以下步骤：

S1、将四氧化三铁纳米颗粒与水混匀后，依次加入氯化钙和磷酸氢二钠，混合均匀后，得到磷酸钙混合四氧化三铁纳米颗粒复合物；

S2、向混合细菌细胞的离心沉淀物中加入海藻酸钠溶液，后加入S1中磷酸钙混合四氧化三铁纳米颗粒复合物，再加入交联剂，静置，用磁铁分离得到细菌印迹聚合物材料的前体物。

优选的，所述步骤S1中反应装置置于超声机中，超声频率为40～80Hz，优选为60Hz。

优选的，所述步骤S1中四氧化三铁纳米颗粒、水、氯化钙和磷酸氢二钠的质量比为0.8～1.1:2000:1.4～1.5:3.5～3.7，优选为1:2000:1.47:3.58。

优选的，所述步骤S2中混合细菌包括金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌。

优选的，所述步骤S2中混合细菌细胞的离心沉淀物的制备方法包括：取金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌的混合菌液放于离心机中，在6000rpm下离心5min，并用PBS缓冲液洗涤三次以彻底去除培养基成分，最后一次离心后去除上清液，得到混合细菌细胞的离心沉淀物。

优选的，加入交联剂静置的时间为6～8h。

在一种或多种实施方式中，玻璃片的预处理的方法包括：

将玻璃片放在浓盐酸与浓硝酸的混合溶液中浸泡12～24h，后利用超纯水冲洗3～5次；后将聚乙烯亚胺溶液均匀地旋涂在玻璃片的表面，静置3～5h后用超纯水冲洗。

优选的，所述浓盐酸的溶质的质量分数为36％～38％，浓硝酸的的溶质的质量分数为65％～68％；浓盐酸与浓硝酸体积比为3:1。

优选的，所述聚乙烯亚胺溶液的溶质的质量分数为0.1～0.3％，优选为0.2％。

利用浓盐酸与浓硝酸的混合溶液浸泡可以使得玻璃片的表面更加的粗糙，进而使得细菌细胞固定在玻璃片的表面，同时将聚乙烯亚胺溶液均匀地旋涂在玻璃片的表面也是为了将细菌细胞固定在玻璃片的表面。

在一种或多种实施方式中，所述步骤(2)中静置的时间为1～2h。

本发明的第二种典型的实施方式，提供由上述制备方法制备的高选择性的细菌印迹聚合物。

细菌印迹聚合物材料的前体物上的印迹空腔来源于模板细菌细胞表面的生物信息，由于不同细菌细胞表面有一些结构相似的分子，例如蛋白质和多糖等，从而使得细菌印迹聚合物材料的前体物不能特异性识别目标细菌。因此，将细菌印迹聚合物材料的前体物中由模板细菌细胞表面结构相似的蛋白质和多糖印迹导致的非特异性识别部分细菌印迹聚合物材料的前体物中去除，可以制备对目标细菌具有高亲和力的细菌印迹材料。与传统印迹方法制备的细菌印迹材料相比，该方法制备的细菌印迹材料作为细菌矿化外壳的高亲和力片段，可以特异性地识别目标细菌。

本发明的第三种典型的实施方式，提供上述高选择性的细菌印迹聚合物在换流站循环冷却水系统中识别、吸附及消灭细菌中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

参考图1，制备高选择性的细菌印迹材料。

(1)利用仿生矿化技术以混合细菌细胞为模板制备细菌印迹聚合物材料的前体物：称取100mg四氧化三铁纳米颗粒于烧杯中，加入200mL蒸馏水，超声分散30min，再向上述混合物中加入147mg CaCl

(2)用磷酸盐缓冲液清洗混合金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌细胞，再用1mM Tris缓冲液清洗多种细菌细胞，并按照等比例混合。

(3)将25×75mm的薄玻璃片放于浓盐酸与浓硝酸(体积比为3:1)的混合溶液中浸泡20h，后利用超纯水冲洗3～5次；后将溶质的质量分数为0.2％的聚乙烯亚胺溶液均匀地旋涂在玻璃片的表面，静置3～5h后用超纯水冲洗，获得预处理后的玻璃片。将清洗后的混合细菌细胞以1×10

(4)将该玻璃片浸泡在含有细菌印迹聚合物材料的前体物中，机械搅拌1～2h后取出玻璃片，用磁铁收集玻璃片表面吸附的材料，获得细菌印迹材料，并用超纯水清洗3次。

对比例1

利用仿生矿化技术以混合细菌细胞为模板制备细菌印迹聚合物材料的前体物：称取100mg四氧化三铁纳米颗粒于烧杯中，加入200mL蒸馏水，超声分散30min，再向上述混合物中加入147mg CaCl

实施例1

将实施例1中制备的高选择性的细菌印迹聚合物用于细菌分子的吸附

利用去离子水将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌以及铜绿假单胞菌的混合细胞稀释至浓度为1×10

本实验例采用如图3所示的过滤装置，过滤装置包括滤液收集杯，滤液收集杯的内部套设一个过滤杯，过滤杯的上表面要高于滤液收集杯，过滤杯的中央设置过滤层，过滤层包括均布的过滤孔的孔径为3-5μm，过滤杯和过滤层为一体成形，滤液收集杯与过滤杯可拆卸连接，过滤杯和过滤层均采用聚甲基丙烯酸甲酯制备而成。

将20mg实施例1中制备的细菌印迹材料分别装载于无纺布薄膜中，并将其放置于上述过滤装置的过滤层中，装载有细菌印迹材料无纺布薄膜刚好完全覆盖过滤层，取10mL模拟滋生了大量细菌的换流站循环冷却水加入到过滤层的上方，在室温下静置30min，取0.1mL滤液收集杯中的溶液，用平板培养法测得溶液中剩余的细菌含量。

将20mg对比例1中制备的细菌印迹材料分别装载于无纺布薄膜中，并将其放置于上述过滤装置的过滤层中，装载有细菌印迹材料无纺布薄膜刚好完全覆盖过滤层，取10mL模拟滋生了大量细菌的换流站循环冷却水加入到过滤层的上方，在室温下静置30min，取0.1mL滤液收集杯中的溶液，用平板培养法测得溶液中剩余的细菌含量。

图4为本发明实验例1中利用实施例1和对比例1中制备的细菌印迹聚合物处理换流站循环冷却水中细菌的效果图，从图4中可以看出，在基于分子印迹技术的细菌过滤装置用于冷却水细菌吸附的应用过程中，细菌印迹材料的过滤层能够吸附并去除93.20％的金黄色葡萄球菌，97.96％的大肠杆菌以及92.18％的铜绿假单胞菌，而非细菌印迹材料的过滤层只能去除50.68％的金黄色葡萄球菌，64.29％的大肠杆菌以及27.21％的铜绿假单胞菌。因此，基于细菌印迹技术的细菌过滤装置对冷却水中的细菌具有吸附和去除的效果。

实施例2

分别用镊子提取实验例1中过滤层，将其放于功率为1.5W cm

交联剂中的四氧化三铁纳米颗粒可以作为光热敏感剂，在激光的照射下具有良好的光热效果，进而可以杀灭吸附的细菌。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。