一种无重金属参与的引发聚合技术制备多肽或蛋白质-高分子偶联物的方法

技术领域

本发明涉及一种在溶液中含有乙烯砜(VS)基团的化合物对含有巯基位点的多肽或蛋白质特异性高效修饰，并在另一端乙烯砜(VS)基团引发聚合成为高分子链的方法。

技术背景

近年来生物技术药行业发展迅速，治疗性蛋白质药物(生物技术药)与传统的化学小分子药物相比，在治疗上更具优势，比如更高的靶标特异性和药理效力等，但是普通蛋白质药物存在半衰期短、清除率高、分子量大、透过能力差、易受体内酶、细菌以及体液的破坏、非注射给药方法生物利用率低等问题。为了解决这些问题，人们提出了蛋白质药物长效化这一概念，即增加蛋白质药物的半衰期，使其发挥更长的药效，而长效化的方法一直都是研究的热门。

蛋白质药物长效化的化学方法一般是将大分子和蛋白质药物用化学手段偶联。偶联的方法分为非定点偶联和定点偶联，非定点偶联即非特异性修饰随机位点，定点偶联即特异性修饰某个位点。目前蛋白质药物和高分子偶联的大多数的方法均是非定点偶联，但是采用随机位点修饰不仅无法得到均一产物，后期的分离提纯困难，所得产率较低，而且随机位点修饰也可能对蛋白质药物的活性位点造成遮蔽，影响偶联药物的生物活性，因此，非定点偶联的方法缺点明显。为了解决上述的问题，定点偶联方法应运而生，但目前这些定点偶联的方法不够完善，如传统的ATRP(自由基聚合)的定点偶联方法，一般都会引入大量Cu+，而这些铜离子难以清除，铜作为一种重金属元素，不仅对人体健康有一定的危害，还会影响进一步操作。而且这些方法大都成本较高，广普性差，得到产物的结构不稳定，高分子容易脱落，影响偶联药物的生物活性的问题等。目前急需一种操作简单，成本低，环境友好，广普性强，偶联药物结构稳定的定点偶联方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明以多肽或蛋白质为模型化合物，旨在提供一种在无重金属参与的引发聚合技术制备多肽或蛋白质-高分子偶联物的方法，是一种新型的聚合方法，在多肽的特点位点“长”出高分子链，该方法特异性强，绿色环保，无Cu

一种在无重金属参与的引发聚合技术制备多肽或蛋白质-高分子偶联物的方法，所述的方法包括如下步骤：

第一步：将含有巯基的多肽或蛋白质溶于体积分数为20～80％的乙醇或乙腈溶液中，加入含有乙烯砜基团(VS)的化合物，于常温下反应1～12h，之后萃取分层提纯，得到上清液；

第二步：在有机碱的引发下，调节步骤(1)所得上清液的pH值至7～10，两性离子单体发生阴离子聚合，在-20～50℃反应1～24h，生成两性离子高分子链；由此实现对巯基的定点偶联，并得到稳定的多肽-高分子偶联物。

含有乙烯砜基团的化合物选自二乙烯基砜(如下结构式I)和双乙酰基磺基甲烷(如下结构式II)

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的含有巯基的多肽，可以是谷胱甘肽(GSH)等，含有巯基的蛋白质为C端或N端含有巯基的蛋白质，如干扰素α2b。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述有机碱为含有咪唑基团的有机物，如咪唑、1-乙烯基咪唑、1-甲基咪唑等，优选1-甲基咪唑。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的两性离子单体选自甲基丙烯酸磺酸甜菜碱(SBMA)、甲基丙烯酸羧酸甜菜碱(CBMA)。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的第一步反应无需调pH，第二步反应调pH＝7～10，优选pH＝7～8。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的第一步中双端含有乙烯砜基团的化合物与含有巯基的多肽或蛋白质的摩尔比为1∶5～1∶100，优选为1∶10～1∶40；第二步中上一步产物与两性离子单体的摩尔比为1∶10～1∶100，优选为1∶40～1∶60。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述有机碱的用量为第一步产物的摩尔浓度的1％～5％。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的第二步反应的温度为20℃～40℃。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，所述的第一步反应的时间为3-6h；第二步反应的时间为3-6h。

对于上文所述的技术方案中，优选的情况下，第一步中萃取分层提纯的具体操作为：旋蒸除去多余的乙醇或乙腈，再加入二氯甲烷进行萃取，静置分层后取上清液。

有益效果：

本发明所述的多肽或蛋白质两性离子修饰法，相对于传统方法有以下优势：

(1)底物适用性广，对于多种含有巯基的多肽或含有巯基的蛋白质均适用；

(2)广普性强，可以修饰各种两性离子聚合物；

(3)反应条件温和，没有高温、低温、强酸、强碱等环境；

(4)特异性强，符合原子经济学，绿色环保，无Cu+等金属离子参与；

(5)稳定性好，生成的多肽或蛋白质-高分子联物不易分解脱落。

综上所述，该方法是一种操作简单，成本低，绿色环保，广普性强，偶联药物结构稳定的定点偶联方法。

附图说明

图1：核磁氢谱表征GSH-VS。

图2：不同pH条件下，核磁氢谱表征GSH-VS-PSBMA。

图3：不同温度条件下，核磁氢谱表征GSH-VS-PSBMA。

图4：不同反应时间条件下，核磁氢谱表征GSH-VS-PSBMA。

图5：核磁氢谱表征GSH-BVS-PSBMA。

图6：核磁氢谱表征干扰素α2b-VS-PSBMA。

图中：ppm＝4.7为氘水的特征峰，ppm＝5.4为二氯甲烷的特征峰。

具体实施方式

本发明提供了一种在溶液中对含有巯基位点的多肽特异性高效修饰方法，所述的方法是将含有巯基的多肽或蛋白质溶于50％乙醇溶液中，分散均匀，加入含有乙烯砜基的化合物，于常温下反应1-12h。将所得产物旋蒸除去多余的乙醇，再加入二氯甲烷进行萃取，离心静置分层后取上清液。在上清液中加入两性离子单体，加入有机碱，使pH在7～10，之后在-20～50℃下反应1-12h，得到最终产物。所述的含有乙烯砜基的化合物选自二乙烯基砜和双乙酰基磺基甲烷；有机碱为含有咪唑基团的有机物，如咪唑、1-乙烯基咪唑、1-甲基咪唑等，优选1-甲基咪唑。

以下具体实施例的是对本发明的内容作进一步说明，不应理解为对本发明任何形式的限定。

实施例1：对合成GSH-VS-PSBMA(含有乙烯砜基的谷胱甘肽偶联聚甲基丙烯酸磺酸甜菜碱)的pH筛选及其表征

将谷胱甘肽(0.01g)溶于8ml 50％乙醇(体积比)溶液中，分散均匀，加入DVS(乙烯基砜)100ul(DVS远远过量)，于常温下反应3h。将所得产物真空旋蒸，将乙醇除净，再加入二氯甲烷进行萃取，离心静置分层后取上清液。将上清液取3ml分别装入3支试管，每支1ml，每支加入SBMA(甲基丙烯酸磺酸甜菜碱)，这里SBMA与上清液中GSH-VS的摩尔比约为30∶1，再加入有机碱1-甲基咪唑，使3支试管中溶液的pH分别为7、8、9，之后将3支试管在37℃下反应6小时，得到最终产物。其第一步合成GSH-VS的核磁表征结果如图1所示，合成最终产物GSH-VS-PSBMA的核磁表征如图2所示。最终产物GSH-VS-PSBMA的化学位移在1.1～1.2ppm为成链后甲基的特征峰(a所示)，在1.8ppm左右为成链后亚甲基的特征峰(b所示)，证明反应成功。

实施例2：对合成GSH-VS-PSBMA(含有乙烯砜基的谷胱甘肽偶联聚甲基丙烯酸磺酸甜菜碱)的温度筛选及其表征

将还原性谷胱甘肽(0.015g)溶于11ml 50％乙醇(体积比)溶液中，分散均匀，加入DVS(乙烯基砜)100ul(DVS远远过量)，于常温下反应3h。将所得产物真空旋蒸，将乙醇除净，再加入二氯甲烷进行萃取，离心静置分层后取上清液。将上清液取5ml分别装入5支试管，每支1ml，每支加入SBMA(甲基丙烯酸磺酸甜菜碱)，这里SBMA与上清液中GSH-VS的摩尔比约为30∶1，在加入有机碱1-甲基咪唑，使5支试管中溶液的pH为8，约为GSH-VS之后将5支试管分别在-20℃、4℃、25℃、37℃、50℃下反应6h，得到最终产物。其合成最终产物GSH-VS-PSBMA的核磁表征如图3所示。最终产物GSH-VS-PSBMA的化学位移在1.1～1.2ppm为成链后甲基的特征峰(a所示)，1.8ppm左右为成链后亚甲基的特征峰(b所示)，证明反应成功。以GSH特征峰为基准，积分计算，纵坐标是峰面积，表示聚合上SBMA单体的数量。证明反应成功，温度对阴离子聚合反应影响不大。

实施例3：对合成GSH-VS-PSBMA(含有乙烯砜基的谷胱甘肽偶联聚甲基丙烯酸磺酸甜菜碱)的时间筛选及其表征

将谷胱甘肽(0.012g)溶于9ml 50％乙醇(体积比)溶液中，分散均匀，加入DVS(乙烯基砜)100ul(DVS远远过量)，于常温下反应3h。将所得产物真空旋蒸，将乙醇除净，再加入二氯甲烷进行萃取，离心静置分层后取上清液。将上清液取4ml分别装入4支试管，每支1ml，每支加入SBMA(甲基丙烯酸磺酸甜菜碱)，这里SBMA与上清液中GSH-VS的摩尔比约为30∶1，在加入有机碱1-甲基咪唑，使4支试管中溶液的pH为8，之后将4支试管分别在37℃下反应15min、1.5h、3h，DCl作为猝灭剂，加入10ul，得到最终产物。其合成最终产物GSH-VS-PSBMA的核磁表征如图4所示。最终产物GSH-VS-PSBMA的化学位移在1.1～1.2ppm为成链后甲基的特征峰(a所示)，1.8ppm左右为成链后亚甲基的特征峰(b所示)，3.8ppm左右为氘代盐酸的特征峰，证明反应成功，且反应进行很快速。

实施例4：对合成GSH-BVS-PSBMA(含有双乙酰基磺基甲烷的谷胱甘肽偶联聚甲基丙烯酸磺酸甜菜碱)的表征

将谷胱甘肽(0.0lg)溶于9ml 20％乙腈(体积比)溶液中，分散均匀，加入BVS(双乙酰基磺基甲烷)30mg(BVS远远过量)，于常温下反应3h。将所得产物真空旋蒸，将乙醇除净，再加入二氯甲烷进行萃取，离心静置分层后取上清液。将上清液取1ml装入试管中，加入SBMA(甲基丙烯酸磺酸甜菜碱)，这里SBMA与上清液中GSH-BVS的摩尔比约为30∶1，在加入有机碱1-甲基咪唑，使试管中溶液的pH为8，之后将在37℃下反应3h，得到最终产物。其合成最终产物GSH-BVS-PSBMA的核磁表征如图5所示。最终产物GSH-BVS-PSBMA的化学位移在1.1～1.2ppm为成链后甲基的特征峰(a所示)，1.8ppm左右为成链后亚甲基的特征峰(b所示)，证明反应成功。

实施例5：对合成干扰素α2b-VS-PSBMA(含有乙烯砜基的干扰素α2b偶联聚甲基丙烯酸磺酸甜菜碱)的表征

将重组人干扰素α2b(0.01g)溶于9ml 50％乙醇(体积比)溶液中，分散均匀，加入DVS(乙烯基砜)100ul(DVS远远过量)，于常温下反应3h。将所得产物真空旋蒸，将乙醇除净，再加入二氯甲烷进行萃取，离心静置分层后取上清液。将上清液取2ml分别装入试管，加入SBMA(甲基丙烯酸磺酸甜菜碱)，这里SBMA与上清液中干扰素α2b-VS的摩尔比约为30∶1，在加入有机碱1-甲基咪唑，使试管中溶液的pH为8，在37℃下反应3h，得到最终产物。其合成最终产物干扰素α2b-VS-PSBMA的核磁表征如图6所示。最终产物干扰素α2b-VS-PSBMA的化学位移在1.1～1.2ppm为成链后甲基的特征峰(a所示)，1.8ppm左右为成链后亚甲基的特征峰(b所示)，证明反应成功。