一种低内毒素γ-聚谷氨酸及其分离提取方法和应用

技术领域

本发明涉及γ-聚谷氨酸的分离提取技术领域，更具体地，涉及一种低内毒素γ-聚谷氨酸及其分离提取方法和应用。

背景技术

聚谷氨酸是一种由L型和D型谷氨酸之间通过酰胺键聚合形成的酰胺键聚氨基酸聚合物，可在特定环境下降解。聚谷氨酸大多由500-5000个谷氨酸单体聚合而成，相对分子质量约在10万-200万之间。现有研究表明，聚谷氨酸有良好的水溶性、生物降解性、食用性、成膜性和保水保湿性等，使得聚谷氨酸被广泛应用在农业、食品业、化妆品业和材料业等行业。

聚谷氨酸在我国生产研究比较晚，在现有技术中，聚谷氨酸的应用主要以农业和化妆品业为主，而医疗器械涉及较少，总体依然在研究阶段，提取工艺不成熟。在医药使用的γ-聚谷氨酸提取工艺中，主要考虑的是各提取步骤之间无缝配合，减少对人体有害的内毒素等热源物质，同时提高产品的纯度。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为解决上述技术中存在的问题，本发明提供了一种低内毒素γ-聚谷氨酸及其分离提取方法和应用。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明一方面提供了一种低内毒素γ-聚谷氨酸的分离提取方法，包括以下步骤：

S1、微滤膜去除菌体

将发酵完毕的聚谷氨酸混合液加入到中空纤维膜微滤膜中，循环并加压，将聚谷氨酸发酵液固液分离，收集聚谷氨酸透过液；

S2、超滤膜超滤

用超滤膜对聚谷氨酸透过液进行反复超滤，收集分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液；

S3、活性炭脱色

往聚谷氨酸发酵液中加入H

S4、纳滤并浓缩

取无色发酵液，利用纳滤膜反复截留除盐，随后将其浓缩得到浓度为5-7 g/100mL的聚谷氨酸浓缩液；

S5、去除内毒素

调节聚谷氨酸浓缩液的pH至5.0-5.5，随后加入药用活性炭，加热搅拌去除内毒素，过滤去除药用活性炭；

S6、后处理

真空冷冻干燥，粉碎，灭菌，包装，即可。

在上述技术方案中，步骤S3中，所述H

在上述技术方案中，步骤S3中，所述粉末状活性炭的加入量为15-25 g/L。

在上述技术方案中，步骤S3中，所述加热搅拌脱色的搅拌速度、温度和时间分别为100-180 rpm、35-45 ℃和30-60 min。

在上述技术方案中，步骤S5中，通过加入H

在上述技术方案中，步骤S5中，所述药用活性炭的种类和加入量分别为767型药用活性炭和5-10 g/L。

在上述技术方案中，步骤S5中，所述加热搅拌去除内毒素的搅拌速度、温度和时间分别为120-150 rpm、40-45 ℃和30-60 min。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，在加入到中空纤维膜微滤膜之前，通过加水调节聚谷氨酸混合液的粘度至50-70 Mpa·s。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S1中，所述中空纤维膜微滤膜的孔径为50-80nm。

在本发明的一个优选实施方式中，步骤S1中，在所述循环并加压的过程中，控制进料口和出料口的压力分别为0.12-0.18 Mpa和0.09-0.12 Mpa，且循环并加压的次数为3-5次。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S2中，具体包括，先通过截留分子量为500 KD的超滤膜进行超滤截留，获得分子量大于500 KD的聚谷氨酸发酵液，再利用截留分子量为1000 KD的超滤膜超滤截留，获得分子量500- 1000 KD的聚谷氨酸发酵液。

进一步地，在上述技术方案中，步骤S4中，取无色发酵液，加水后，利用截留分子量为500-1000 Da的纳滤膜组件，控制操作压力为0.1-0.5 Mpa，截留除盐5-8次，直至透过液的电导率为20-100 μs/cm且谷氨酸含量小于5 wt%。

再进一步地，在上述技术方案中，步骤S6中，所述真空冷冻干燥具体包括：

先在-80 ℃下预冻12-18 h，再利用冷冻干燥机，在冷阱温度为-65 ℃下冷冻12-18 h。

本发明另一方面还提供了上述分离提取方法制备得到的低内毒素γ-聚谷氨酸。

具体地，以市售化妆品级计，所述低内毒素γ-聚谷氨酸的纯度为101-104 %，且其内毒素小于0.5 EU/g。

本发明再一方面还提供了上述分离提取方法或上述低内毒素γ-聚谷氨酸在制备医药级γ-聚谷氨酸产品中的应用。

本发明与现有技术相比，具有以下优点：

（1）本发明所提供的分离提取方法采用微滤膜去除菌体，使用物理方法，不引入新的杂质且可高效迅速分离发酵菌体，截留液（带菌液）可作为农业用聚谷氨酸，提高了聚谷氨酸的利用回收率；

（2）本发明所提供的分离提取方法对发酵液进行超滤分级，不仅可以得到不同分子量的聚谷氨酸，还能对发酵液进行脱色并去除离子及小分子蛋白，减轻下游脱色和除盐浓缩压力，同时还提高了产品的品质，即采用超滤膜分离高分子目标物质技术，专一分离纯化目标物质，减少工艺成本；

（3）本发明所提供的分离提取方法采用全水化无醇提取方式，并结合微滤膜、超滤膜和纳滤膜结合，使得提纯效率高、产品纯度高，也避免了下游分离过程中内毒素的增长，在下游提取工艺中保持低内毒素发酵液状态；

（4）利用本发明所提供的分离提取方法制备得到的聚谷氨酸的纯度高于市售的聚谷氨酸，生产成本低，且生产过程安全、高效、连续和自动化，产品收率可达80-85 %，内毒素含量为0.2-0.4EU/g，纯度101-104 %（按市售化妆品级计）。

附图说明

图1为本发明实施例中低内毒素γ-聚谷氨酸的分离提取方法的工艺流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中，如无特别说明，所用手段均为本领域常规的手段。

本文中所用的术语“包含”、“包括”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。在本发明的以下实施例中，所用的原料均为市售产品，未经特殊处理直接使用。

本发明实施例所用的聚谷氨酸混合液的发酵过程包括：

（1）以地衣芽孢杆菌（

（3）将种子培养液接种于发酵培养基中，接种量10 %，于37 ℃，发酵罐通气搅拌培养72 h，得到聚谷氨酸发酵液。

实施例1

本发明实施例提供了一种低内毒素γ-聚谷氨酸的分离提取方法，如图1所示，具体包括以下步骤：

S1、微滤膜去除菌体

取新发酵的聚谷氨酸混合液，通过加水稀释至粘度为50 Mpa·s，选取膜孔径为60nm的中空纤维膜微滤膜，将其加入，并控制进料口压力和出料口压力分别为0.15Mpa和0.1Mpa，循环加水洗脱4次，收集聚谷氨酸透过液；

S2、超滤膜超滤

取步骤S1中的聚谷氨酸透过液，通过截留分子量为500 KD的超滤膜进行超滤截留，获得分子量大于500 KD的聚谷氨酸发酵液，再利用1000 KD的超滤膜超滤，获得分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液；

S3、活性炭脱色

往步骤S2中获得的分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液中加入6 mol/L的H

S4、纳滤并浓缩

取无色发酵液，通过截留分子量为500 Da和1000 Da的纳滤膜组件进行组合纳滤除盐，控制操作压力为0.2 Mpa，并向其中反复加入水（新制去离子水），加入体积为无色发酵液的0.5倍，反复纳滤5次至透过液的电导率为20-100 μs/cm，谷氨酸含量低于5%，且溶液浓度达7 g/100 ml；

S5、去除内毒素

通过加入H

S6、后处理

在-80 ℃预冷12 h后，利用冷冻干燥机，在冷阱温度为-65 ℃下冻干燥12 h，收集后粉碎、灭菌并包装，即可。

实施例2

本发明实施例提供了一种低内毒素γ-聚谷氨酸的分离提取方法，具体包括以下步骤：

S1、微滤膜去除菌体

取新发酵的聚谷氨酸混合液，通过加水稀释至粘度为60 Mpa·s，选取膜孔径为60nm的中空纤维膜微滤膜，将其加入，并控制进料口压力和出料口压力分别为0.15Mpa和0.1Mpa，循环加水洗脱4次，收集聚谷氨酸透过液；

S2、超滤膜超滤

取步骤S1中的聚谷氨酸透过液，通过截留分子量为500 KD的超滤膜进行超滤截留，获得分子量大于500 KD的聚谷氨酸发酵液，再利用1000 KD的超滤膜超滤，获得分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液；

S3、活性炭脱色

往步骤S2中获得的分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液中加入8 mol/L的H

S4、纳滤并浓缩

取无色发酵液，通过截留分子量为500 Da和1000 Da的纳滤膜组件进行组合纳滤除盐，控制操作压力为0.4 Mpa，并向其中反复加入水（新制去离子水），加入体积为无色发酵液的1.0倍，反复纳滤7次至透过液的电导率为20-100 μs/cm，谷氨酸含量低于5%，且溶液浓度达5 g/100 ml；

S5、去除内毒素

通过加入H

S6、后处理

在-80 ℃预冷12 h后，利用冷冻干燥机，在冷阱温度为-65 ℃下冻干燥12 h，收集后粉碎、灭菌并包装，即可。

实施例3

本发明实施例提供了一种低内毒素γ-聚谷氨酸的分离提取方法，具体包括以下步骤：

S1、微滤膜去除菌体

取新发酵的聚谷氨酸混合液，通过加水稀释至粘度为70 Mpa·s，选取膜孔径为60nm的中空纤维膜微滤膜，将其加入，并控制进料口压力和出料口压力分别为0.15Mpa和0.1Mpa，循环加水洗脱4次，收集聚谷氨酸透过液；

S2、超滤膜超滤

取步骤S1中的聚谷氨酸透过液，通过截留分子量为500 KD的超滤膜进行超滤截留，获得分子量大于500 KD的聚谷氨酸发酵液，再利用1000 KD的超滤膜超滤，获得分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液；

S3、活性炭脱色

往步骤S2中获得的分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液中加入10 mol/L的H

S4、纳滤并浓缩

取无色发酵液，通过截留分子量为500 Da和1000 Da的纳滤膜组件进行组合纳滤除盐，控制操作压力为0.5 Mpa，并向其中反复加入水（新制去离子水），加入体积为无色发酵液的1.0倍，反复纳滤7次至透过液的电导率为20-100 μs/cm，谷氨酸含量低于5%，且溶液浓度达6 g/100 ml；

S5、去除内毒素

通过加入H

S6、后处理

在-80 ℃预冷12 h后，利用冷冻干燥机，在冷阱温度为-65 ℃下冻干燥12 h，收集后粉碎、灭菌并包装，即可。

实施例4

本发明实施例提供了一种低内毒素γ-聚谷氨酸的分离提取方法，具体包括以下步骤：

S1、微滤膜去除菌体

取新发酵的聚谷氨酸混合液，通过加水稀释至粘度为70 Mpa·s，选取膜孔径为60nm的中空纤维膜微滤膜，将其加入，并控制进料口压力和出料口压力分别为0.15Mpa和0.1Mpa，循环加水洗脱4次，收集聚谷氨酸透过液；

S2、超滤膜超滤

取步骤S1中的聚谷氨酸透过液，通过截留分子量为500 KD的超滤膜进行超滤截留，获得分子量大于500 KD的聚谷氨酸发酵液，再利用1000 KD的超滤膜超滤，获得分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液；

S3、纳滤并浓缩

取分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液，通过截留分子量为500 Da和1000 Da的纳滤膜组件进行组合纳滤除盐，控制操作压力为0.5 Mpa，并向其中反复加入水（新制去离子水），加入体积为聚谷氨酸发酵液的1.0倍，反复纳滤7次至透过液的电导率为20-100 μs/cm，谷氨酸含量低于5%，且溶液浓度达7 g/100 ml；

S4、活性炭脱色

往经步骤S3处理后的聚谷氨酸发酵液中加入10 mol/L的H

S5、去除内毒素

通过加入H

S6、后处理

在-80 ℃预冷12 h后，利用冷冻干燥机，在冷阱温度为-65 ℃下冻干燥12 h，收集后粉碎、灭菌并包装，即可。

实施例5

本发明实施例提供了一种低内毒素γ-聚谷氨酸的分离提取方法，具体包括以下步骤：

S1、微滤膜去除菌体

取新发酵的聚谷氨酸混合液，通过加水稀释至粘度为70 Mpa·s，选取膜孔径为60nm的中空纤维膜微滤膜，将其加入，并控制进料口压力和出料口压力分别为0.15Mpa和0.1Mpa，循环加水洗脱4次，收集聚谷氨酸透过液；

S2、超滤膜超滤

取步骤S1中的聚谷氨酸透过液，通过截留分子量为500 KD的超滤膜进行超滤截留，获得分子量大于500 KD的聚谷氨酸发酵液，再利用1000 KD的超滤膜超滤，获得分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液；

S3、活性炭脱色

往步骤S2中获得的分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液中加入10 mol/L的H

S4、纳滤并浓缩

取无色发酵液，通过截留分子量为500 Da和1000 Da的纳滤膜组件进行组合纳滤除盐，控制操作压力为0.5 Mpa，并向其中反复加入水（新制去离子水），加入体积为无色发酵液的1.0倍，反复纳滤7次至透过液的电导率为20-100 μs/cm，谷氨酸含量低于5%，且溶液浓度达7 g/100 ml；

S5、去除内毒素

通过加入H

S6、后处理

在-80 ℃预冷12 h后，利用冷冻干燥机，在冷阱温度为-65 ℃下冻干燥12 h，收集后粉碎、灭菌并包装，即可。

对比例1

本发明对比例提供了一种低内毒素γ-聚谷氨酸的分离提取方法，具体包括以下步骤：

S1、微滤膜去除菌体

取新发酵的聚谷氨酸混合液，通过加水稀释至粘度为50 Mpa·s，选取膜孔径为60nm的中空纤维膜微滤膜，将其加入，并控制进料口压力和出料口压力分别为0.15Mpa和0.1Mpa，循环加水洗脱4次，收集聚谷氨酸透过液；

S2、超滤膜超滤

取步骤S1中的聚谷氨酸透过液，通过截留分子量为500 KD的超滤膜进行超滤截留，获得分子量大于500 KD的聚谷氨酸发酵液，再利用1000 KD的超滤膜超滤，获得分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液；

S3、活性炭脱色

往步骤S2中获得的分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液中加入6 mol/L的H

S4、纳滤并浓缩

取无色发酵液，通过截留分子量为500 Da和1000 Da的纳滤膜组件进行组合纳滤除盐，控制操作压力为0.2 Mpa，并向其中反复加入水（新制去离子水），加入体积为无色发酵液的0.5倍，反复纳滤5次至透过液的电导率为20-100 μs/cm，谷氨酸含量低于5%，且溶液浓度达7 g/100 ml；

S5、去除内毒素

通过加入H

S6、后处理

在-80 ℃预冷12 h后，利用冷冻干燥机，在冷阱温度为-65 ℃下冻干燥12 h，收集后粉碎、灭菌并包装，即可。

对比例2

本发明对比例提供了一种低内毒素γ-聚谷氨酸的分离提取方法，具体包括以下步骤：

S1、微滤膜去除菌体

取新发酵的聚谷氨酸混合液，通过加水稀释至粘度为50 Mpa·s，选取膜孔径为60nm的中空纤维膜微滤膜，将其加入，并控制进料口压力和出料口压力分别为0.15Mpa和0.1Mpa，循环加水洗脱4次，收集聚谷氨酸透过液；

S2、超滤膜超滤

取步骤S1中的聚谷氨酸透过液，通过截留分子量为500 KD的超滤膜进行超滤截留，获得分子量大于500 KD的聚谷氨酸发酵液，再利用1000 KD的超滤膜超滤，获得分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液；

S3、活性炭脱色

往步骤S2中获得的分子量500-1000 KD的聚谷氨酸发酵液中加入6 mol/L的H

S4、纳滤并浓缩

取无色发酵液，通过截留分子量为500 Da和1000 Da的纳滤膜组件进行组合纳滤除盐，控制操作压力为0.2 Mpa，并向其中反复加入水（新制去离子水），加入体积为无色发酵液的0.5倍，反复纳滤5次至透过液的电导率为20-100 μs/cm，谷氨酸含量低于5%，且溶液浓度达7 g/100 ml；

S5、去除内毒素

通过加入H

S6、后处理

在-80 ℃预冷12 h后，利用冷冻干燥机，在冷阱温度为-65 ℃下冻干燥12 h，收集后粉碎、灭菌并包装，即可。

采用内毒素测定仪分别检测实施例1-2和对比例1-2中经步骤S1处理后的聚谷氨酸透过液、步骤S2处理后的聚谷氨酸发酵液、步骤S3处理后的聚谷氨酸发酵液、步骤S4处理后的无色发酵液、步骤S5处理后的无色发酵液、步骤S6处理后的产品的内毒素含量，结果如下表1所示。

表1实施例1-2和对比例1-2经各步骤处理后的产物的内毒素含量检测结果

分别采用HPLC、内毒素测定仪和电感耦合等离子体质谱仪方法，检测实施例1-7所制备得到的产物的提取收率、内毒素含量、重金属含量和纯度（按市售化妆品级计），结果如下表2所示。

表2实施例1-7所制备得到的产物的提取收率、内毒素含量和纯度检测结果

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。

应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。