一种齿瓣石斛聚糖及其制备方法和在降血糖中的应用

技术领域

本发明属于植物聚糖制备技术领域，具体涉及一种齿瓣石斛聚糖及其制备方法和在降血糖中的应用。

背景技术

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种以胰岛素相对或绝对不足引起的以慢性高血糖为主要表现的代谢性综合疾病。糖尿病会引发许多并发症，包括糖尿病肾病、糖尿病足病和糖尿病眼病等，严重的将导致肾衰竭、截肢、失明甚至死亡，给患者的身心带来极大的痛苦和不便。

齿瓣石斛（别称紫皮石斛，学名：Dendrobium devonianum Paxton）为兰科（Orchidaceae）石斛属多年生草本植物，常见民间药用，作为铁皮石斛的相似品，具有滋阴生津；润肺益肾；厚肠胃等功效。

目前，国内外只有少数研究者对齿瓣石斛多糖进行化学成分提取分离结构鉴定研究，Wu Yue-Guo等人从齿瓣石斛中分离鉴定了一个分子量为9.52×10

发明内容

本发明的目的在于提供一种齿瓣石斛聚糖及其制备方法和在降血糖中的应用，所述齿瓣石斛聚糖具有较高的降血糖功效，可以用于制备降血糖产品，增加了齿瓣石斛聚糖的用途。

本发明提供了一种齿瓣石斛聚糖，所述齿瓣石斛聚糖的主链为O-2, O-3位乙酰基取代的聚糖及其衍生物，且含有4.3~18万个甘露糖和葡萄糖残基；

所述齿瓣石斛聚糖的分子量为3.0×10

优选的，所述齿瓣石斛聚糖包括齿瓣石斛聚糖G0、齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16中的一种或几种；

所述齿瓣石斛聚糖G0、齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16的分子量分别为6.7×10

本发明还提供了上述技术方案所述的齿瓣石斛聚糖的制备方法，包括如下步骤：

将齿瓣石斛干品与醇溶液混合后进行浸泡脱色，得到齿瓣石斛醇混合物；

将所述齿瓣石斛醇混合物进行减压浓缩，得到齿瓣石斛渣；

将所述齿瓣石斛渣与水混合后煮沸浸提，将得到的混合物进行固液分离，得到齿瓣石斛水提液；

将所述齿瓣石斛水提液的浓缩液中的蛋白进行去除，得到齿瓣石斛粗聚糖水溶液；

将所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液进行醇沉，得到的沉淀为齿瓣石斛聚糖G0；

将所述齿瓣石斛聚糖G0与纤维素酶混合酶解，将得到的酶解液进行固液分离，得到齿瓣石斛聚糖水溶液；

将所述齿瓣石斛聚糖水溶液进行凝胶层析，收集洗脱峰，分别得到齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16；所述凝胶层析的流动相为水。

优选的，所述浸泡脱色的次数为2~3次，每次浸泡脱色的时间为24h。

优选的，所述煮沸浸提的次数为2次，每次煮沸浸提的时间为2h；每次煮沸浸提时的料液比为1g：（20~50）mL。

优选的，去除所述齿瓣石斛水提液的浓缩液中蛋白的方法包括：将齿瓣石斛水提液的浓缩液与氯仿-正丁醇混合溶液混合进行Sevage法除蛋白；

所述齿瓣石斛水提液的浓缩液的料液比为1g：（5~10）mL；所述氯仿-正丁醇混合溶液中氯仿与正丁醇的体积比为（3~5）：1。

优选的，所述醇沉的步骤包括：将所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液的浓缩液与体积百分比为95%的醇溶液混合至混合溶液中醇的体积浓度为70%~85%，静置过夜后固液分离；

所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液的浓缩液的料液比为1g：（2~5）mL。

优选的，所述纤维素酶的用量为所述齿瓣石斛聚糖G0质量的1%~4%，所述纤维素酶的酶活力为40000U/g；所述酶解反应的温度为40~70℃，时间为1~4h；

所述齿瓣石斛聚糖G0以齿瓣石斛聚糖G0水溶液的形式与纤维素酶混合进行所述酶解，所述齿瓣石斛聚糖G0的水溶液的浓度为10mg/mL。

优选的，所述凝胶层析包括：将所述齿瓣石斛聚糖水溶液依次进行DEAE52纤维素柱层析和G75凝胶柱层析；所述凝胶层析的流动相的流速为2mL/min。

本发明还提供了上述技术方案所述的齿瓣石斛聚糖或上述技术方案所述齿瓣石斛聚糖在制备降血糖的产品中的应用。

有益效果：

本发明提供了一种齿瓣石斛聚糖，所述齿瓣石斛聚糖的主链为O-2，O-3位乙酰基取代的聚糖及其衍生物，且含有4.3~18万个甘露糖和葡萄糖残基；所述齿瓣石斛聚糖的分子量为3.0×10

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为实施例1齿瓣石斛粗聚糖的制备路线图；

图2为实施例1中四种齿瓣石斛聚糖纯度鉴定HPLC-ELSD图谱；

图3为实施例1中齿瓣石斛聚糖G1的

图4为实施例1中齿瓣石斛聚糖G1的

图5为实施例1中齿瓣石斛聚糖G5的

图6为实施例1中齿瓣石斛聚糖G5的

图7为实施例1中齿瓣石斛聚糖G16的

图8为实施例1中齿瓣石斛聚糖G16的

图9为实施例2中四种齿瓣石斛聚糖对GLUT-1蛋白的活力影响结果；

图10为实施例3中四种齿瓣石斛聚糖对胰岛素蛋白的活力影响结果；

图11为实施例4中四种齿瓣石斛聚糖对min-6细胞的活力影响结果。

具体实施方式

本发明提供了一种齿瓣石斛聚糖，所述齿瓣石斛聚糖的主链为O-2, O-3位乙酰基取代的聚糖及其衍生物，且含有4.3~18万个甘露糖和葡萄糖残基；所述齿瓣石斛聚糖的分子量为3.0×10

本发明所述衍生物优选为与O-2, O-3位乙酰基取代的甘露聚糖的骨架结构类似的聚糖。本发明所述分子量优选为均一分子量。

本发明所述齿瓣石斛聚糖优选包括齿瓣石斛聚糖G0、齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16中的一种或几种，进一步优选包括齿瓣石斛聚糖G0、齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16，更优选为齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16。本发明所述齿瓣石斛聚糖G0、齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16的分子量分别优选为6.7×10

本发明还提供了上述技术方案所述的齿瓣石斛聚糖的制备方法，包括如下步骤：

将齿瓣石斛干品与醇溶液混合后进行浸泡脱色，得到齿瓣石斛醇混合物；

将所述齿瓣石斛醇混合物进行减压浓缩，得到齿瓣石斛渣；

将所述齿瓣石斛渣与水混合后煮沸浸提，将得到的混合物进行固液分离，得到齿瓣石斛水提液；

将所述齿瓣石斛水提液的浓缩液与氯仿-正丁醇混合溶液混合进行Sevage法除蛋白，得到齿瓣石斛粗聚糖水溶液；

将所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液进行醇沉，得到的沉淀为齿瓣石斛聚糖G0；

将所述齿瓣石斛聚糖G0与纤维素酶混合酶解，将得到的酶解液进行固液分离，得到齿瓣石斛聚糖水溶液；

将所述齿瓣石斛聚糖水溶液进行凝胶层析，收集洗脱峰，分别得到齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16。

本发明优选将齿瓣石斛进行干燥、粉碎和过筛，得到齿瓣石斛粉末。本发明所述齿瓣石斛优选包括新鲜齿瓣石斛的茎。本发明优选采用鼓风干燥箱进行所述干燥，至齿瓣石斛干品的含水量小于6%，所述干燥的温度优选为40~60℃，更优选为55℃；所述含水量的齿瓣石斛干品具有脱水的作用。本发明对所述粉碎的参数没有特殊限定，采用本领域中常规粉碎参数即可。本发明所述过筛用的筛孔优选为20~60目，更优选为40目，即得到的齿瓣石斛粉末的粒径≤40目。

得到所述齿瓣石斛粉末后，本发明将所述齿瓣石斛粉末与醇溶液混合后进行浸泡脱色，得到齿瓣石斛醇混合物。本发明所述醇溶液优选包括乙醇溶液，所述乙醇溶液的体积百分比优选为90%~100%，更优选为95%。本发明所述浸泡脱色的次数优选为2~3次，更优选为3次，每次浸泡脱色的时间优选为12~48h，更优选为24h；相邻两次浸泡脱色连续进行。

得到所述齿瓣石斛醇混合物后，本发明优选对所述齿瓣石斛醇混合物进行减压浓缩，得到乙醇提取部位和齿瓣石斛渣。本发明优选采用旋转蒸发仪进行所述减压浓缩，所述减压浓缩的温度优选为40~70℃，更优选为50℃；所述减压浓缩优选采用旋转蒸发仪进行，压力优选为负压。本发明优选还包括将所述齿瓣石斛渣于室温下静置挥发至所述齿瓣石斛渣无醇味。

得到所述齿瓣石斛渣后，本发明将所述齿瓣石斛渣与水混合后煮沸浸提，将得到的混合物进行固液分离，得到齿瓣石斛水提液。本发明所述煮沸浸提的次数优选为2次，每次浸提的时间优选为2h，具体优选为：将所述齿瓣石斛渣与水混合后进行第一煮沸浸提，得到第一煮沸浸提液和第一浸提齿瓣石斛渣；将所述第一浸提齿瓣石斛渣与水混合进行第二煮沸浸提，得到第二煮沸浸提液和第二浸提齿瓣石斛渣；将所述第一煮沸浸提液与第二煮沸浸提液混合，得到所述齿瓣石斛水提液。本发明所述齿瓣石斛渣或第一浸提齿瓣石斛渣与水的料液比优选为1g：（20~50）mL，更优选为1g：40mL。本发明所述固液分离优选包括离心，所述离心的转速优选为3000~4000rpm，更优选为3500rpm；时间优选为10~20min，更优选为15min；温度优选为室温。

得到所述齿瓣石斛水提液后，本发明优选将所述齿瓣石斛水提液进行第一减压浓缩，得到齿瓣石斛水提液的浓缩液。本发明优选采用旋转蒸发仪进行所述第一减压浓缩，所述第一减压浓缩的参数没有特殊限定，采用本领域中常规减压浓缩的参数即可。本发明所述齿瓣石斛水提液的浓缩液的料液比优选为1g：（5~10）mL，更优选为1g：6mL。

得到所述齿瓣石斛水提液的浓缩液后，本发明将所述齿瓣石斛水提液的浓缩液与氯仿-正丁醇混合溶液混合进行Sevage法除蛋白，得到齿瓣石斛粗聚糖水溶液。本发明所述Sevage法除蛋白优选包括：将所述齿瓣石斛水提液的浓缩液与氯仿-正丁醇混合溶液混合后离心，得到所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液。本发明所述氯仿-正丁醇混合溶液中氯仿和正丁醇的体积比优选为（3~5）：1。本发明所述离心的转速优选为3000~4000rpm，更优选为3500rpm；时间优选为10~20min，更优选为15min；温度优选为室温。

得到所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液后，本发明将所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液进行醇沉。本发明所述醇沉的步骤优选包括：将所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液的浓缩液与体积百分比为95%的醇溶液混合至混合溶液中醇的体积浓度为70%~85%，静置过夜后固液分离，得到沉淀。

本发明优选将所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液进行第二减压浓缩，得到齿瓣石斛粗聚糖水溶液的浓缩液。本发明优选采用旋转蒸发仪进行所述第二减压浓缩，所述第二减压浓缩的参数没有特殊限定，采用本领域中常规减压浓缩的参数即可。本发明所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液的浓缩液的料液比优选为1g：（2~5）mL，更优选为1g：4mL。

得到所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液的浓缩液后，本发明优选将所述齿瓣石斛粗聚糖水溶液的浓缩液与体积百分比为95%的醇溶液混合至混合溶液中醇的体积浓度为70%~85%，静置过夜后固液分离，得到沉淀。本发明所述醇溶液优选包括乙醇溶液；所述混合溶液中醇的体积浓度优选为80%。本发明所述固液分离优选为离心，所述离心的转速优选为3000~4000rpm，更优选为3500rpm；时间优选为10~20min，更优选为15min；温度优选为室温。

得到所述沉淀后，本发明优选将所述沉淀与水混合后复溶。本发明所述沉淀的质量与水的体积比优选为1~10g：4~40mL，更优选为1g：5mL。

所述复溶后，本发明优选将复溶后的溶液进行冷冻干燥，得到齿瓣石斛粗聚糖，即齿瓣石斛聚糖G0，所述齿瓣石斛聚糖G0的分子量优选为6.7×10

得到所述齿瓣石斛聚糖G0后，本发明优选将齿瓣石斛聚糖G0与水混合进行溶解，得到齿瓣石斛聚糖G0水溶液。本发明所述齿瓣石斛聚糖G0水溶液的浓度优选为5~15mg/mL，更优选为10mg/mL。

得到所述齿瓣石斛聚糖G0水溶液后，本发明将所述齿瓣石斛聚糖G0的水溶液与纤维素酶混合酶解。本发明所述纤维素酶的用量优选为所述齿瓣石斛聚糖G0质量的1%~4%，更优选为2%；所述纤维素酶的酶活力优选为3000~50000U/g，更优选为40000U/g；所述酶解反应的温度优选为40~70℃，更优选为70℃；时间优选为1~4h，更优选为4h。

所述酶解后，本发明优选对得到的混合液进行灭酶处理，得到酶解液。本发明所述灭酶处理优选为将所述混合液煮沸，所述灭酶处理的时间优选为20~60min，更优选为30min。

得到所述酶解液后，本发明对所述酶解液进行固液分离，得到齿瓣石斛聚糖水溶液。本发明所述固液分离优选为离心，所述离心的转速优选为3000~4000rpm，更优选为3500rpm；时间优选为10~20min，更优选为15min；温度优选为室温。

得到所述齿瓣石斛聚糖水溶液后，本发明将所述齿瓣石斛聚糖水溶液进行凝胶层析，分别收集7.8min、8.4min和9.1min的洗脱峰，分别得到齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16。本发明所述凝胶层析优选包括：将所述齿瓣石斛聚糖水溶液依次进行DEAE52纤维素柱层析和G75凝胶柱层析。本发明所述凝胶层析的流动相为水，流速优选为2mL/min。本发明所述齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16的分子量分别优选为3.2×10

本发明所述齿瓣石斛聚糖G0、齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16均具有较强的降血糖活性，尤其齿瓣石斛聚糖G1、齿瓣石斛聚糖G5和齿瓣石斛聚糖G16分子量小于10万Da，较齿瓣石斛聚糖G0的分子量更小更容易被细胞吸收，降血糖的效果更好。

基于上述优势，本发明还提供了上述技术方案所述的齿瓣石斛聚糖或上述技术方案所述齿瓣石斛聚糖在制备降血糖的产品中的应用。本发明所述产品优选包括药品、保健品和食品中的一种或多种，而优选包括药品、保健品和食品。本发明所述食品优选包括功能性食品；所述保健品优选包括餐后血糖调节保健品。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

齿瓣石斛聚糖提取分离纯化及结构鉴定，步骤如下：

将齿瓣石斛新鲜茎切断放置于鼓风干燥箱中55℃干燥，测其水分，水分达到6 %以下时，将其粉碎过40目筛，得到齿瓣石斛粉末；

将齿瓣石斛粉末加入95%乙醇溶液中浸泡24h，连续浸泡2-3次，进行脱色；将脱色后的混合物在旋转蒸发仪（50℃，负压）减压浓缩得乙醇提取部位和齿瓣石斛滤渣，将齿瓣石斛滤渣室温25℃，挥干至无醇味。

齿瓣石斛渣和纯水按照1:20-1:50 (m:v, g/mL)混合，沸水浴2次，每次煮沸的时间为2h，合并水提液。将水提液在室温25℃，3000-4000rpm条件下离心10-20min，取上清液，获得齿瓣石斛水提液；将齿瓣石斛水提液减压浓缩（与上一步骤中的减压浓缩条件相同）至料液比为1:5-1:10 (m:v，g/mL)，得到齿瓣石斛水提液的浓缩液，

对齿瓣石斛水提液的浓缩液进行Sevage法除蛋白，具体为将齿瓣石斛水提液的浓缩液与氯仿-正丁醇（氯仿和正丁醇的体积比为（3-5）: 1）混合溶液混合后，离心，离心条件为3000-4000rpm，10-20min，室温25℃，获得齿瓣石斛粗聚糖水溶液；将齿瓣石斛粗聚糖水溶液减压浓缩至合适得体积，即料液比为1：2-1：5 (m:v，g/mL)，得到齿瓣石斛粗聚糖水溶液的浓缩液。

在齿瓣石斛粗聚糖水溶液的浓缩液加入适量95%乙醇溶液至混合水液中醇浓度为70%-85%，隔夜沉淀，之后离心，离心条件：3000-4000rpm，10-20min，室温25℃，弃去上清液，得到沉淀；按沉淀重量1:5（m:v，g/mL）加入水复溶，冷冻干燥得齿瓣石斛粗聚糖（G0分子量≈6.7×10

取适量齿瓣石斛粗聚糖加水溶解至10mg/mL，按齿瓣石斛粗聚糖重量的1%-4%投入纤维素酶（酶活力为40000U/g），混匀，40-70℃反应1h-4h后，煮沸30min灭活，离心，离心条件：3000-4000rpm/min，10-20min，室温25℃，弃去沉淀；得齿瓣石斛聚糖水溶液，取适量降解后齿瓣石斛聚糖水液依次过DEAE52，G75凝胶柱，流动相为纯水，流速为2mL/min，分别收集7.8min、8.4min和9.1min的洗脱峰，分别得纯化的齿瓣石斛聚糖1-3（即分别为齿瓣石斛聚糖G1，G5，G16纯度为99%，分子量≈ 3.2×10

分别对G1，G5，G16进行HPLC-ELSD及核磁结构测定，得到的结果分别如图2~7所示，其中在图2中的曲线由上到下依次表示G0、G16、G5和G1。

由图2可以得出G1，G5，G16的纯度≥99%，结合标准糖制作的标准曲线法计算出G1，G5，G16的分子量分别为3.2×10

实施例2

GLUT-1蛋白活力实验

1、试剂

GLUT-1蛋白检测试剂盒（购买自艾博抗（北京）生物医药科技有限公司）、HCT116细胞、齿瓣石斛聚糖、阿卡波糖、纯水等。

2、实验方法

将待测齿瓣石斛聚糖与96孔板中HCT116细胞（齿瓣石斛聚糖的终浓度为100、200、400µg/mL）在DMEM细胞培养基中在5% CO

将齿瓣石斛聚糖G0、G1、G5和G16分别按照步骤1和步骤2中的流程进行试验，结果如图9所示。

由图9可以得出：齿瓣石斛聚糖G0在100、200µg/mL浓度下，具有一定的促进糖转运蛋白的活力，而齿瓣石斛聚糖G1，齿瓣石斛聚糖G5，齿瓣石斛聚糖G16在100、200、400µg/mL浓度下，具有更强的活性。

实施例3

胰岛素蛋白活力实验

1、试剂

胰岛素蛋白检测试剂盒（购买自艾博抗（北京）生物医药科技有限公司）、min6细胞、齿瓣石斛聚糖、纯水等。

2、实验方法

将待测齿瓣石斛聚糖与96孔板中min6细胞（终浓度分别为100、200、400µg/mL）5%CO

将齿瓣石斛聚糖G0、G1、G5和G16分别按照步骤1和步骤2中的流程进行试验，结果如图10所示。

本实验对齿瓣石斛聚糖的胰岛素蛋白活力进行了评价，图10中的结果显示，在100、200、400µg/ml浓度下，齿瓣石斛聚糖G0，G1，G5和G16都具有一定的胰岛素蛋白活力增强作用。

实施例4

Min6细胞活力测试

1、试剂

细胞活力检测试剂盒(MTS)（购买自南京建成生物科技有限公司）、min6细胞、齿瓣石斛聚糖、纯水等。

2、实验方法

将待测齿瓣石斛聚糖与96孔板中min6细胞（终浓度分别为100、200、400µg/mL）5%CO

将齿瓣石斛聚糖G0、G1、G5和G16分别按照步骤1和步骤2中的流程进行试验，结果如图11所示。

本实验对齿瓣石斛聚糖的min6细胞存活率进行了评价，由图11中的结果显示，在12、24、48h，齿瓣石斛聚糖G0，G1，G5和G16基本都无细胞毒性。

尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。