一种含有赖氨酸核的聚乙二醇化脂质

本发明属于药物递送领域，总体上涉及一种聚乙二醇化脂质，具体涉及一种可作为药物载体组分的含有赖氨酸核的聚乙二醇化脂质，以及包含该聚乙二醇化脂质的脂质组合物、脂质药物组合物及其制剂和应用。

有效的体内递送是药物实现治疗效果的关键性要素。外源性药物必须穿透脂质膜的屏障，才能进入细胞质，进而被成功翻译成功能性蛋白质。将药物递送到细胞内部共有两道障碍，递送途中的酶降解和静电排斥致使的膜屏障。理想的递送系统需要满足以下几个条件：在到达靶点之前要有效地包裹和保护药物以维持其稳定；帮助药物高效地进入细胞；在药物到达溶酶体之前及时地将其释放到细胞质中。

目前，已经开发了多种递送载体用于促进药物的细胞摄取并保护其免于降解。主要的非病毒载体有鱼精蛋白、脂质纳米颗粒(LNPs)、树突细胞、无机纳米粒子等。其中，LNP是目前比较成熟的一个技术平台，用来递送RNA药物、疫苗或基因编辑工具。相对其他类型的核酸药物递送系统而言，LNP具有很多优势，比如核酸包封率高并且能够有效转染细胞，组织穿透性强，细胞毒性和免疫原性低，更有利于递送药物等优势，这些优势使LNP成为出色的核酸递送系统。LNP主要由可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂和聚乙二醇化脂质(PEG-脂质)组成。

与其他纳米载体一样，聚乙二醇化脂质为LNP提供了一个外部聚合层，延长了体内的循环时间，还可以防止纳米颗粒在储存过程和血液中的聚集，聚乙二醇化脂质的数量还可能决定颗粒的大小等，可见聚乙二醇化脂质是LNP中调控半衰期和细胞摄取的一个重要组分。

尽管聚乙二醇化脂质的研究取得了进展，例如商业上应用成熟的DMG-2k，但是报道的氨基酸核聚乙二醇化脂质较少。文献CN114539083A中报道了谷氨酸和天冬氨酸作为骨架且酯键为连接键的聚乙二醇化脂质，例如化合物PEG

发明内容

本发明提供的新型聚乙二醇化脂质及其制备方法、包含所述聚乙二醇化脂质的脂质组合物以及含有该脂质组合物的脂质药物组合物及其制剂、含有该脂质组合物的脂质体或者脂质纳米颗粒，尤其是含有该脂质组合物的LNP-核酸药物组合物及其制剂，具有高递送效率、安全低毒、高生物相容性的优点，能够提高药物的治疗和/或预防效果。

本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现，

本发明的一种实施方案，提供了一种聚乙二醇化脂质：

一种聚乙二醇化脂质，其结构如通式(1)所示：

其中，

X为-O-或-NH-；

L

L

L

B

R

R

n

本发明还提供了一种脂质组合物，实施方案为：

一种脂质组合物，含有式(1)所示结构的聚乙二醇化脂质。

本发明还提供了一种脂质药物组合物，实施方案如下：

一种脂质药物组合物，含有脂质组合物和药物，且所述的脂质组合物含有式(1)所示结构的聚乙二醇化脂质，所述药物选自核酸药物、基因疫苗、抗肿瘤药物、小分子药物、多肽药物或蛋白质药物中任一种。

本发明还提供了一种脂质药物组合物制剂，实施方案如下：

一种脂质药物组合物制剂，含有前述的脂质药物组合物和药学上可接受的稀释剂或赋形剂。

本发明还提供了一种脂质体或者脂质纳米颗粒，实施方案如下：

一种脂质体或者脂质纳米颗粒，含有脂质组合物，所述的脂质组合物含有式(1)所示结构的聚乙二醇化脂质。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明中，聚乙二醇化脂质的支化中心为赖氨酸，具有安全低毒、高生物相容性、简单易得、易于合成或商业获得和节约成本等优点。聚乙二醇化脂质的合成路线也较为简便，为核酸药物、基因疫苗、小分子药物等递送系统提供更多的选择。

本发明的新型聚乙二醇化脂质与现有技术中的含有两个酯键的谷氨酸核或天冬氨酸核聚乙二醇化脂质相比，其含有较少的不稳定连接键(酯键)，大多数只含有一个可解降解的酯键或者不含有酯键，在体内更为稳定，从而能够提高细胞摄取率和转染率。

本发明的新型聚乙二醇化脂质，赖氨酸核与PEG链的连接部分可以含有可降解的酯键，在体循环过程中PEG链较易脱落，有利于被包封的治疗剂或者诊疗剂从脂质纳米粒中逃逸到细胞质中发挥相应的疗效。

本发明的新型聚乙二醇化脂质的疏水尾链还可选用不饱和烃基链，不饱和烃基链使得分子层具有一定的刚性而更稳定，也使得分子层的排列更为疏松、具有更高的膜流动性，进而增强膜融合能力和细胞摄取。

本发明的新型聚乙二醇化脂质的PEG端还可以修饰各种靶向基团，为制备靶向性LNP、靶向治疗等提供了一种相对简单的方法。

图1为本发明实施例13制备的脂质药物组合物的体外细胞转染结果图。

1.发明详述

本发明对于具体的实施方式作出了详细描述，然而，应理解的是，其仅以说明性方 式而非限制性方式给出，在本发明的范围内的各种变化和修改对于所属领域的技术人员将是显而易见的。

本发明的引用文献中的描述与本发明的描述不同的，以本发明为准；这个原则针对说明书全文的所有引用文献。

1.1.术语说明

在本发明中，除非另有描述，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文引用的所有专利和其他出版物的公开内容通过引用的方式整体并入本文。在本文术语的任何描述阐释与通过引用并入本文的任何文件相冲突的情况下，以下述术语的描述与阐释为准。除非另外指明，否则各术语具有以下含义。

本发明中，两个或多个对象“各自独立地优选”，当具有多级的优选情况时，并不要求均选自同级的优选组，可以一个为大范围的优选、一个为小范围的优选，也可以一个为最大范围、另一个为任一种优选情况，也可以选自同级的优选。

本发明中，“各自独立地为/选自/优选”不仅可以指不同类目可以各自独立地为/选自/优选定义里的任一选项，还可以在加上“每次出现时”表示同一类目在不同位置或不同时间出现时每次独立地为/选自/优选定义里的任一选项，例如，“L

本发明中，除非特别说明，“任意”包括任一种、任两种和任两种以上。

本发明中，当列举了至少两项时，所列举的项的“任意组合”指前述列举的项中任两种或任两种以上的组合；且对项的数量不做限定，任一项的数量可以为零个、一个或大于一个，同种项的数量大于1时，可以是满足该项的相同或不同的具体形式。例如，“L

本发明中，除非特别说明，否则术语“包括”、“包含”和“含有”以及类似的表述应在本说明书和权利要求书中以开放性和包含性的含义解释为“包括但不限于”或“非限制性地包括”。

本发明中，“包括但不限于”某范围，指所述范围内的项可选，但不限定为所述范围的项，且并非所述范围内的所有结构都适用，尤其是本发明明确排除的项不在候选之列。基本原则是以本发明顺利实施为筛选标准。

本发明中，数值区间的释义，既包括短横线标记的数值区间(如1-6)，也包括波浪线标记的数值区间(如1～6)，还包括“至/到”标记的数值区间(如，1至6、1到6)。在没有特别说明的情况下，以区间形式标记的区间均可表示该区间范围内所有整数与非整数构成的组，且该范围包括两个端点。例如，EO单元数优选为20-70，其选择范围并不限于该区间内的整数，还可以是任意的非整数。又如，“1-6中的整数”表示1、2、3、4、5、6构成的组。又如，-(CH

本发明中的数值范围，包括但不限于整数、非整数、百分数、分数表示的数值范围，如无特别说明，均包括两个端点。

本发明中，对于聚合物分子量而言，“约”、“左右”一般指±10％的数值范围，部分情况可放大到±15％，但不超过±20％。以预设数值为基数。例如，11kDa、12kDa与10kDa之间的偏差分别为10％、20％，‘约10kDa“包括但不限于11kDa和12kDa。又如，指定通式中某个PEG组分的分子量约5kDa时，允许相应的分子量或数均分子量在5kDa±10％，也即4500～5500Da的范围内变化。

本发明中，对于百分数而言，当给出的数值(不含百分号)精确到N(包括1、0.1、0.01、0.001等)时，“约”、“左右”一般指±0.5*N的数值范围。例如，约1％指的是0.5％-1.5％的范围，约2.2％指的是2.15％-2.25％的范围。

本发明中的二价连接基，例如亚烃基、亚烷基、亚芳基、酰胺键等，没有特别限定的情况下，其连接其它基团时可选两个连接端中的任一个，例如在GroupA和GroupB之间以酰胺键作为二价连接基时，可以为GroupA-C(＝O)NH-GroupB或GroupB-NHC(＝O)-GroupA。

本发明的结构式中，涉及相连接基团的原子归属问题时，采用

本发明中，基团中的碳原子数范围以下标形式标注在C的下标位置，表示该基团具有的碳原子数，除非特别说明，所述碳原子数不含取代基的贡献。例如，C

本发明中，当涉及到的结构具有同分异构体时，没有特别指定的情况下，可以为其中任一种异构体。例如对于存在顺反异构体的结构，既可以为顺式结构也可以为反式结构；存在E/Z异构体的结构，既可以为E结构也可以为Z结构；有旋光性时可以为左旋或右旋。

本发明中，若本文所描述的结构与该结构的名称之间存在差异，则所描述的结构应具有更大的权重。

本发明中，“分子量”表征一个化合物分子的质量大小，“平均分子量”表征宏观物质中通式化合物组分的质量大小，且没有特别规定时，“平均分子量”一般指“数均分子量”M

本发明中，“任意合适的连接基”、“任意合适的反应性基团”等中的“任意合适的”是指符合化学结构的基本原则，且能够使本发明的制备方法顺利实施的结构。用此方式 描述的化学结构可视为具有清楚的、确定的范围。

本发明中的“微修饰”，指经过简单的化学反应过程即可完成的化学修饰过程。所述简单的化学反应过程主要指脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团等化学反应过程。

本发明中，“微变化形式”与“微修饰”相对应，指经历脱保护、盐络合与解络合、离子化、质子化、去质子化、改变离去基团等简单的化学反应过程后能形成目标基团的结构形式。所述改变离去基团，例如但不限于酯形式向酰氯形式的转变。

本发明中基团的“可稳定存在”和“可降解”是一对相对的概念，可稳定存在基团和可降解基团的详细举例见CN113402405A中的[0134]-[0145]段。

本发明中，对于在血液中循环的聚乙二醇化药物而言，聚乙二醇组分的重复单元之间的醚键(-CH

本发明中，通式(1)化合物应被理解为包括通式(1)化合物的盐。所用术语“盐”选自与无机和/或有机酸形成的酸加成盐和与无机和/或有机碱形成的碱加成盐中的任一种、任二种或者任二种以上的组合。当通式(1)化合物含有碱性部分(例如但不限于吡啶或咪唑)和酸性部分(例如但不限于羧酸)，可以形成两性离子(“内盐”)并包括在所用术语“盐”中。“盐”可以是药学上可接受的(即，无毒、生理学上可接受的)盐，也可以是其他盐。通式(1)化合物的盐可通过通式(1)化合物与一定量(诸如当量)的酸或碱在诸如盐沉淀的介质中或在水性介质中反应然后冻干而形成。示例性的酸加成盐包括醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、葡庚酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、草酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、水杨酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、磺酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一烷酸盐等；示例性碱加成盐包括铵盐、碱金属盐(诸如钠盐、锂盐和钾盐)、碱土金属盐(诸如钙盐和镁盐)、具有有机碱(例如有机胺)的盐以及具有氨基酸(诸如精氨酸或赖氨酸)的盐。碱性含氮基团可用以下试剂进行季铵化，诸如低级烷基卤化物(例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物)、二烷基硫酸盐(例如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐)、长链卤化物(例如，癸基、月桂基、十四烷基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物)、芳基烷基卤化物(例如，苄基和苯乙基溴化物)及其他。所述酸加成盐和碱加成盐均优选为药学上可接受的盐，并且出于本公开的目的，均被认为等同于对应的通式(1)化合物的游离形式。

本发明中，除非特别说明，“基”等同于“基团”，指化合物失去一个或多个原子形成的自由基，所述自由基含有至少1个原子。相对于化合物，失去部分原子或基团后形成的基团也称为残基。本发明中的基团不为氢原子。基团的价态没有特别限定，作为举例可以分为一价基团、二价基团、三价基团、四价基团、…、一百价基团等。其中，价态大于等于2的基团统称为“连接基”。连接基还可以只含有一个原子，如醚基(-O-)、硫醚基(-S-)。特别地，当某个基团定义可以为连接键时，也即表示该基团可以不存在且仅起连接作用。

本发明中，除非特别说明，“连接键”指只起连接作用，不含有任何原子。

本发明中，二价连接基中的“基”可以替换为“键”，而不改变意义。例如但不限 于，二价醚基也可称为醚键，二价的酯基也可以称为酯键，二价的氨基甲酸酯基也可称为氨基甲酸酯键。

本发明中，所述“取代”，意指至少一个氢原子被取代基代替，或一个基团被另一个基团代替。本发明中，用于所述取代的基团称为“取代基”。取代基所含原子数可以为1，也可以大于1。当取代基所含原子数为1时，也可称为“取代原子”。

本发明中，一个基团被另一个基团取代时，可以是一个基团中的一个或多个氢原子被另一个基团代替，其中，另一个基团为取代基，也可以是一个基团整体被另一个基团代替。具体情况依据本领域技术人员的常规理解确定。例如，“苯基被氯原子取代”，结合不同的附加条件，可以是苯基被氯原子代替，也可以是苯基上含有一个氯原子取代基。又如，“羟基被-OTs取代”，通常认为所述羟基整体被-OTs基团代替。

本发明中，所述“取代基”为非氢原子或含非氢原子的基团，所述非氢原子例如，但不限于：诸如F、Cl、Br和I等卤素原子；所述含非氢原子的基团例如，但不限于：氧代基团(＝O)、羟基(-OH)、烃氧基(-OR

本发明中，所述化合物或基团为“取代的”时，意指所述化合物或所述基团(例如，但不限于：烷基、亚烷基、脂肪烃基、脂肪烃衍生物残基、氨基酸残基或单糖残基)含有一个或多个取代基。

本发明中，对于一个化合物、一个基团或一个原子，可以同时被取代和被杂化，例如-CH

本发明中，除非特别说明，“氨基”与“胺基”意义相同，包括一价、二价、三价、四价的中性基团或阳离子基团，为取代的或未取代的。例如，CH

本发明中，“胺基”包括但不限于伯胺基、仲胺基、叔胺基和季铵离子。例如但不限于，-NR

本发明中，除非特别说明，“封端基团”与“末端基团”的意义没有区别，均可以为反应性基团或非反应性基团，均可以为靶向性基团或非靶向性基团。本发明中，具体聚乙二醇链的封端基团/末端基团的定义没有特别限制；例如，

本发明中，“官能团”也即“功能性基团”，优选反应性基团、被保护的反应性基团、反应性基团的前体等等。

本发明的制备方法，除非特别说明，反应性基团还包含其被保护形式，所述被保护形式可在实际制备过程的任一合适步骤中进行脱保护得到相应的活性形式。

本发明中，“烃”指由碳原子和氢原子组成的碳氢化合物。

本发明中，按饱和度情况，烃可以分为饱和烃、不饱和烃两种。其中，不饱和烃包括含碳碳双键、碳碳三键或芳香环的烃。不饱和的脂肪烃的不饱和度没有特别限定。作为举例，包括但不限于烯烃(含双键)、炔烃(含三键)、二烯烃(含共轭双键)、多烯烃(含两个及两个以上双键)等。

本发明中，“亚烃基”为二价烃基。

本发明中，“脂肪烃基”指脂肪烃失去至少一个氢原子后形成的残基。没有特别指定的情况下，本发明中的脂肪烃基特指一价脂肪烃基。脂肪烃基包含饱和脂肪烃基和不饱和脂肪烃基。脂肪烃基可以是烷烃基、烯烃基或炔烃基。

本发明中，对于烃的结构没有特别限制，可以为直链结构、支链结构、含环状结构、树状结构、梳状结构、超支化结构等形式。没有特别定义的情况下，直链结构、含支链结构和含环状结构分别对应直链烃、支链烃和环烃。其中，不含环状结构的烃统称为开链烃。

本发明中，烃基的来源没有特别限制，例如可以源自脂肪烃或芳烃，也可以源自饱和烃或不饱和烃，也可以源自直链烃、支链烃或环烃，还可以源自烃或杂烃等等。从饱和度的角度，例如可以源自烷烃、烯烃、炔烃、共轭二烯烃、多烯烃等；对于环烃，例如可以源自脂环烃或芳烃、单环烃或多环烃；对于杂环烃，例如可以源自脂杂环烃或芳杂环烃。

本发明中，“烷烃”指的是饱和的脂肪烃，“烷基”指烷烃失去任一位置的氢原子形成的烃基。

本发明中，“亚烷基”，也即二价烷基，包括开链亚烷基和二价环烷基，开链亚烷基指不含环状结构的二价烷基，二价环烷基指环状结构的二价烷基。

本发明中的氨基酸的来源，在没有特别指明的情况下没有特别限制，既可以为天然来源，也可以是非天然来源，还可以为两者的混合。本发明中的氨基酸结构类型，在没有特别指明的情况下没有特别限制，既可以指L-型，也可以指D-型，还可以为两者的混合。

本发明中，“生物相关物质”包括但不限于文献CN104877127A、WO/2016/206540A、CN201610252378.X(CN106967213A)、CN201710125672.9、CN201710126727.8及各引用文献中所描述、列举及引用的物质。概括地，生物相关物质包括但不仅限于以下物质：药物、蛋白质、多肽、寡肽、蛋白模拟物、片段及类似物、酶、抗原、抗体及其片段、受体、小分子药物、核苷、核苷酸、寡核苷酸、反义寡核苷酸、多核苷酸、核酸、适配体、多糖、蛋白多糖、糖蛋白、类固醇、甾类化合物、脂类化合物、激素、维生素、磷脂、糖脂、染料、荧光物质、靶向因子、靶向分子、细胞因子、神经递质、细胞外基质物质、植物或动物提取物、病毒、疫苗、细胞、囊泡、脂质体、胶束等。所述生物相关物质可以为生物相关物质自身，也可以其前体、激活态、衍生物、异构体、突变体、类似物、模拟物、多晶型物、药物学上可接受的盐、融合蛋白、化学改性物质、基因重组物质等，还可以为相应的激动剂、激活剂、活化剂、抑制剂、拮抗剂、调节剂、受体、配体或配基、抗体及其片段、作用酶(如激酶、水解酶、裂解酶、氧还原酶、异构酶、转移酶、脱氨酶、脱亚胺酶、转化酶、合成酶等)、酶的底物(如凝血级联蛋白酶底物等)等。所述衍生物包括但不限于甙类、核苷类、氨基酸类、多肽类衍生物。形成新的反应性基团的化学修饰产物，即对反应性基团进行改性而改变类型、额外引入功能性基团、反应性基团、氨基酸或氨基酸衍生物、多肽等结构后生成的改性产物，均属于生物相关物质的化学改性物质。生物相关物质在与官能化聚乙二醇结合之前或之后，还允许有与其结合的目标分子、附属物或递送载体，形成改性的生物相关物质或复合的生物相关物质。其中，所述药物学上可接受的盐，既可以为无机盐，如盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐，也可以为有机盐，如草酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐等。其中，本发明中的“药物”包括在体内或体外提供生理或药理作用的任何药剂、化合物、组合物或混合物，且往往提供的是有益效果。其种类没有特别限制，包括但不限于药物、疫苗、抗体、维生素、食品、食品添加剂、营养剂、营养保健品及其它提供有益效果的药剂。所述“药物”在体内产生生理或药理作用的范围没有特别限制，可以为全身效果，也可以只在局部产生 效果。所述“药物”的活性没有特别限制，主要为能够与其它物质发生相互作用的活性物质，也可以为不发生相互作用的惰性物质；但惰性的药物可通过体内作用或一定刺激转变为活性形式。其中，“小分子药物”为分子量不超过1000Da的生物相关物质，或任一生物相关物质的小分子拟态物或活性片段。

本发明中，“氨基酸残基”包括从氨基上除去氢原子和/或从羧基上除去羟基和/或从巯基上除去氢原子和/或氨基被保护和/或羧基被保护和/或巯基被保护的氨基酸。本发明中，氨基酸残基可以被称为氨基酸。

本发明中，“靶向递送”或动词形式的“靶”是指促进递送的试剂到达特定器官、组织、细胞和/或细胞内区室(称为目标位置)的过程，使目标位置比任何其他的器官、组织、细胞或细胞内区室(称为非目标位置)递送的更多。靶向递送可以通过本领域已知的方法来检测，例如通过比较全身给药后靶细胞群体中递送的试剂的浓度与非靶细胞群体中递送的试剂的浓度。在某些实施方案中，与非靶标位置相比，靶向递送导致在靶标位置的浓度高至少2倍。

本发明中，“靶向基团”指能在期望的位置和/或在期望的条件下与互补结合部分相互作用的基团。例如，互补结合部分可以是配体和抗配体(例如链霉抗生素和生物素，蛋白A或G和免疫球蛋白的Fe区)，配体和受体(例如小分子配体及其受体，或糖-外源凝集素相互作用)，噬菌体展示-衍生的肽，互补核酸(例如DNA杂交体、RNA杂交体、DNA/RNA杂交体等)和适配子。其它示例性的互补结合部分包括但不限于，表现互补电荷的部分，疏水性，氢键合，共价键合，范德华力，反应性化学作用，静电相互作用，磁相互作用等。

本发明中的一些具体实施方案中，反应过程中还涉及相关基团的“保护”和“脱保护”过程。为防止某反应性基团对反应产生影响，通常对该反应性基团进行保护。本发明中的一些具体实施方案中，反应性基团为2个以上时，选择性地仅使目标反应性基团进行反应，因此对其他反应性基团进行保护。保护基不仅在目标反应进行过程中保持稳定，根据需要，可以通过本领域常规技术手段去除。

本发明中，反应性基团的“保护”，意指通过特定试剂将所要保护的反应性基团可逆地转化为惰性基团(非反应性基团)的策略。被保护的基团中，区别于未保护形式的部分称为“保护基”。例如，-OTBS是羟基(-OH)的一种被保护形式，其中-TBS基团为羟基的保护基。

本发明中，“脱保护”和“去保护”意义相同，皆指将被保护的基团从被保护形式转变为未保护形式的过程。

本发明中，“羟基保护基”包含可作为通常的羟基的保护基而使用的所有的基团。羟基保护基，优选为烷酰基(例如乙酰基、叔丁酰基)、芳烷酰基(例如苄酰基)、苄基、三苯甲基、三甲基硅基、叔丁基二甲硅基、烯丙基、缩醛基或缩酮基。乙酰基的脱去一般在碱性条件下进行，最常用的是NH

本发明中，“羧基保护基”是指能通过水解、羧基保护基的去保护反应而转化为羧基的保护基。羧基保护基，优选为烷基(例如甲基、乙基、叔丁基)或芳烷基(例如苄基)，更优选为叔丁基(tBu)、甲基(Me)或乙基(Et)。本发明中，“被保护的羧基” 是指羧基被适合的羧基保护基保护后所形成的基团，优选为甲氧羰基、乙氧羰基、叔丁氧羰基、苄氧羰基。所述羧基保护基可以在酸或碱的催化下水解除去，偶尔也可用热解反应消去，例如叔丁基可以在温和的酸性条件下除去，苄基可以通过氢解脱去。脱除羧基保护基的试剂选自TFA、H

本发明中，“氨基保护基”等同于“胺基保护基”，包含可作为通常的氨基/胺基的保护基而使用的所有的基，例如芳基C

本发明中，被羟基保护基保护的羟基没有特别限制，例如可以为醇羟基、酚羟基等的羟基；被氨基保护基保护的氨基/胺基没有特别限制，例如可以来自伯胺、仲胺、联胺、酰胺等。本发明中胺基没有特别限制，包括但不限于伯胺基、仲胺基、叔胺基、季铵离子。

本发明中，被保护羟基的脱保护与羟基保护基的类型有关。所述羟基保护基的类型没有特别限制，以苄基、硅醚、缩醛、叔丁基对末端羟基进行保护为例，相应的脱保护方法包括但不限于：

A：苄基保护基的脱保护

苄基脱保护可以利用氢化还原剂和氢供体的氢化作用来实现，在这个反应体系中的含水量应小于1％，反应才能顺利进行。

氢化还原催化剂没有限制，优选为钯和镍，但是并不限制载体，但优选氧化铝或碳，更优选碳。钯的用量为含被保护羟基化合物的1至100wt％，优选为含被保护羟基化合物的1至20％wt％。

反应溶剂没有特别的限制，只要原料和产物均可以溶剂即可，但优选甲醇、乙醇、乙酸乙酯、四氢呋喃，乙酸；更优选甲醇。并不特别限制氢供体，但优选氢气、环己烯、2-丙醇、甲酸铵等。反应温度优选为25至40℃。反应时间没有特别限制，反应时间与催化剂的用量成负相关，优选为1至5个小时。

B：缩醛、缩酮保护基的脱保护

用于这类羟基保护的缩醛或缩酮化合物优选乙基乙烯基醚、四氢吡喃、丙酮、2,2-二甲氧基丙烷、苯甲醛等。而这类缩醛、缩酮的脱保护通过在酸性条件下实现，溶液pH优选0至4。酸没有特别限制，但优选乙酸、磷酸、硫酸、盐酸、硝酸，更优选盐酸。反应溶剂没有特别的限制，只要能够溶解反应物和产物即可，优选水。反应温度优选0至30℃。

C：硅醚保护基的脱保护

用于这类羟基保护的化合物包括三甲基硅醚、三乙基硅醚、二甲基叔丁基硅醚、叔丁基二苯基硅醚等。而这类硅醚的脱保护通过含氟离子的化合物，优选四丁基氟化铵、四乙基氟化铵、氢氟酸、氟化钾，更优选四丁基氟化铵、氟化钾。含氟试剂的用量在被保护羟基的摩尔当量的5至20倍，优选8至15倍引发剂，如果含氟的用量小于5倍被保护羟基的摩尔当量，会导致脱保护不完全；当脱保护试剂的用量大于20倍被保护羟 基的摩尔当量，过量的试剂或化合物给纯化带来麻烦，可能混入后续步骤，从而引起副反应。反应溶剂没有特别的限制，只要能够溶解反应物和产物即可，优选非质子性溶剂，更优选四氢呋喃、二氯甲烷。反应温度优选0至30℃，当温度低于0℃，反应速度较慢，不能完全脱除保护基。

D：叔丁基保护基的脱保护

叔丁基的脱保护在酸性条件下进行，溶液pH优选0至4。酸没有特别限制，但优选乙酸、磷酸、硫酸、盐酸、硝酸，更优选盐酸。反应溶剂没有特别的限制，只要能够溶解反应物和产物即可，优选水。反应温度优选0至30℃。

本发明中，“羧基活化”是指用羧基活化剂对羧基进行活化处理，羧基活化后能够促进缩合反应更好的进行，如：抑制缩合反应中消旋杂质的产生、催化加快反应速度等。“羧基活化基”是羧基活化剂的残基。所述羧基活化剂为N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI)、N-羟基-5-降冰片烯-2,3-二甲酰亚胺(HONb)和N,N-二环己基碳二亚胺(DCC)中一种或多种的组合，优选为NHS/EDCI、NHS/DCC、HONb/DCC的组合，最优选为NHS/EDCI的组合。

本发明中，反应用到的缩合剂并不限制，但优选N,N’-二环己基羰二亚胺(DCC)，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDC·HCl，简称EDCI)，2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，最优选为DCC。而一般缩合剂的用量为羧酸摩尔当量的1至20倍，优选为5-10倍，这个反应可以加入适当的催化剂(如4-二甲基氨基吡啶)。

本发明中，反应用到的氧化剂没有特别限制，只要能使底物的化合价升高的化合物或多种化合物的组合，优选苯基碘二(三氟乙酸酯)、1,4-苯醌、苄基三甲基三溴化铵、重铬酸吡啶盐、重铬酸钾、臭氧、氧气、次氟酸、次氯酸钠、醋酸高钴、醋酸钴、醋酸锰、醋酸钯、醋酸铜、单过氧邻苯二甲酸、碘、N-碘代丁二酰亚胺、碘酰苯、2-碘酰苯甲酸、二甲基二氧环丙烷、二甲亚砜-草酰氯、二甲亚砜-醋酸酐、DDQ、二氯三(三苯基膦)钌、二氧化锰、二乙酰氧基碘苯、高碘酸、高碘酸钠、高碘酸钠-四氧化锇、高锰酸钾、高硼酸钠、过氧苯甲酸、过氧化二苯甲酰、过氧化镍、过氧化氢、过氧化氢异丙苯、过氧叔丁醇、过氧乙酸、间氯过氧苯甲酸、N-氯代丁二酰亚胺、氯铬酸吡啶、氯化钯-氯化铜、尿素过氧化氢复合物、三苯基甲基四氟硼酸盐、三丁基氧化锡、三氟化钴、三氟氧钒、三氧化铬、三乙酸锰、TEMPO、硝酸铈铵、溴、N-氧化吡啶、氧化银、O-乙基过氧碳酸、乙酰丙酮锰、乙酰丙酮氧钒、异丙醇铝、过硫酸氢钾、二氯碘苯等中的一种或其组合，更优选氧气、次氯酸钠、双氧水、二氯碘苯、过硫酸氢钾等的一种或其组合，氧化剂的量为中间体化合物中羟基摩尔当量的1至50倍，优选1至20倍，更优选5至10倍。

本发明中，反应用到的还原剂没有特别限制，只要能将氨与醛或酮生成的希夫碱还原成氨基即可；优选硼氢化钠、氰基硼氢化钠、氢化铝锂、硼烷、二硼烷、二异丁基氢化铝、二异松莰基硼烷、硼氢化锂、硼氢化锌、硼烷-吡啶、硼烷-甲硫醚、硼烷-四氢呋喃等中的一种或组合；更优选氰基硼氢化钠，还原剂的当量为待修饰氨基摩尔当量的1至50倍，优选1至20倍，更优选5至10倍。

本发明中，反应温度为0至200℃，优选0至100℃，反应时间优选为10分钟至48小时，更优选为30分钟至24小时。得到的产物可通过萃取、重结晶、吸附处理、沉淀、反沉淀、薄膜透析或超临界提取等纯化方法加以纯化。

本发明中，反应的溶剂可以是无溶剂或非质子性溶剂，非质子性溶剂包括甲苯、苯、二甲苯、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚、四氢呋喃、氯仿、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺或二甲基乙酰胺，优选四氢呋喃、二氯甲烷、二甲基亚砜、二甲基 甲酰胺。

本发明中，反应用到的碱一般为有机碱(如三乙胺、吡啶、4-二甲基氨基吡啶、咪唑或二异丙基乙基胺)，优选三乙胺、吡啶。碱的用量为羧酸的摩尔当量的1至50倍，优选为1至10倍，更优选为1至3倍。

本发明中，聚乙二醇组分的重复单元为氧化乙烯基单元，即-CH

本发明中，对于多分散性情况，化合物单个分子的分子量/聚合度、宏观物质中化合物组分的数均分子量/数均聚合度的“相等”或“相同”或“等于”(包括其他形式的等价表达)，在没有特别指定的情况下，并不限定在数值上严格相等，而是指数值相接近或近似相等，所述相接近或近似相等优选偏差不超过±10％，通常以预设数值为基数。

本发明中，对于单分散性情况，单个化合物分子及通式中氧化乙烯基单元数相同或相等是指在数值上严格相等；例如设定某个PEG组分的EO单元数为11，则等于12的设定值不落在设定范畴；但对于为了获得含设定EO单元数的化合物组分，而采用一定制备方法获得的宏观产物，由于制备方法、纯化方法的限制，可能导致该宏观产物中还含有除目标EO单元数组分之外的其他EO单元数组分，此时当EO单元平均数偏离预设的EO单元数不超过±5％(基数≥10)或者不超过±0.5(基数<10)时，视为获得了含目标组分的单分散性宏观产物；此外，当符合EO单元数或EO单元平均数范围的组分含量达到一定百分比时(优选≥90％，更优选>95％，更优选大于96％，更优选大于98％，更优选99～100％)，也视为获得了含目标组分的单分散性宏观产物；即使未达到上述的含量比例，只要采用了本发明的制备方法或采用基本相同的制备思路的类似方法，因故获得的含量不足的产品、以主产品、联产品或副产品形式出现的组分，不论是否进行分离纯化，均在本发明的范围内。

本发明中，当用Da、kDa、重复单元数、EO单元数描述多分散组分的化合物通式的分子量时，对于单个化合物分子，分子量数值允许落在给定数值的一定范围内(包括端点，优选±10％范围内)；用氧化乙烯基单元数描述单分散组分的化合物通式的预设分子量时，则无范围波动，为离散点，但其制备产物可能因分子量不均一而使EO单元平均数在一定范围范围内波动(不超过±10％或±1，优选不超过±5％或±0.5)。例如mPEG(甲氧基聚乙二醇单元)的分子量为5kDa，指通式中单个分子的分子量数值在4500～5500Da之间，对应的制备产物相应组分的平均分子量为5kDa，也即平均分子量的数值在4500～5500Da之间时的产物为目标产物，且分子量落在该范围的组分才对目标组分的含量有贡献；又如设计mPEG具有22个氧化乙烯基单元，则通式中所有化合物分子的EO单元数均应当严格为22，但制备产物可能是20、21、22、23、24个EO单元的化合物的混合物，此时EO单元的平均数落在22±2.2范围内(优选在22±1.1范围内)时则视为获得目标组分，而分子量落在该数值范围内的组分均可视为目标组分用以计算纯度。

本发明中，除非特别说明，“mPEG”为甲氧基封端的聚乙二醇链段，其结构式为

本发明中，产物PDI<1.005即可视为单分散性，可记为PDI＝1。

本发明中，“单链组分”中的重复单元个数至少为2。

本发明中，“脂质”又称“脂类”(lipid)，包括但不限于脂肪酸的脂，并且以通常在水中有较差的溶解性，但可溶于许多非极性有机物中为特征。尽管脂质通常在水 中具有较差的溶解度，但是某些类别的脂质(例如，被极性基团修饰的脂质如DMG-PEG2000)具有有限的水溶性，并且在某些条件下可以溶解于水中。脂质的已知类型包括生物分子，例如脂肪酸、蜡、固醇、脂溶性维生素(如维生素A、D、E和K)、单酸甘油酯、二酸甘油酯、三酸甘油酯和磷脂。

本发明中，脂质包括单纯酯类、复合酯类和衍生脂质。所述单纯酯类为脂肪酸与醇所组成的酯类，它又可分为脂、油及腊三小类。所述复合酯类即“类脂质化合物”，也称为“类脂质”或“类脂”(lipoid)，包括磷脂、鞘脂类、糖脂、类固醇及固醇、脂蛋白类。所述衍生脂质，包括简单脂质衍生物和复合脂质衍生物，具有脂质的一般性质。

本发明中，脂质可以是合成的或衍生(分离或修饰)自天然来源或化合物。

本发明中，“阳离子”是指相应的结构永久地、或非永久地能响应某些条件(例如pH)而带有正电荷。因此，阳离子既包括永久性阳离子，也包括可阳离子化的。永久性阳离子是指相应的化合物或基团或原子在其环境的任何pH值或氢离子活性下均带正电荷。典型地，因季氮原子的存在而产生正电荷。当化合物携带多个这样的正电荷时，它可以被称为永久性阳离子。可阳离子化的是指化合物或基团或原子在较低pH下带正电荷并且在其环境的较高pH下不带电荷。另外，在不能测定pH值的非水性环境中，可阳离子化的化合物、基团或原子在高氢离子浓度下带正电荷并且在低氢离子浓度或活性下不带电荷。它取决于可阳离子化的或可聚阳离子化的化合物的各个性质，特别是相应的可阳离子化基团或原子的pKa，在所述pH或氢离子浓度下它带电荷或不带电荷。在稀释的水性环境中，可以使用所谓的海森巴赫(Henderson-Hasselbalch)方程来估计带有正电荷的可阳离子化的化合物、基团或原子的分率，该方程是本领域技术人员公知的。在一些实施方案中，可阳离子化的化合物的整体或部分在生理pH值(例如约7.0-7.4)下带正电荷。在一些优选的实施方案中，可阳离子化的化合物的整体或部分在生理pH值(例如约7.0-7.4)下是中性的，但在较低pH值(例如约5.5至6.5)下带正电荷。在一些实施方案中，可阳离子化的化合物的整体或部分的pKa优选范围是约5至约7。

本发明中，“阳离子脂质”是指在其所处环境的任何pH值或氢离子活性下带正电荷的脂质，或能够响应其所处环境(例如其预期使用环境)的pH值或氢离子活性而带正电荷的脂质。因此，术语“阳离子”涵盖“永久阳离子”和“可阳离子化的“的范围。在一些实施方案中，阳离子脂质中的正电荷源自季氮原子的存在。在一些实施方案中，阳离子脂质包括两性离子脂质，该两性离子脂质在其预期施用的环境中(例如，在内体pH下)带正电荷。在一些实施方案中，如果某脂质组合物中含有可阳离子化脂质，则优选的是，它在约1至9，优选地4至9、5至8或6至8的pH值下，最优选地在内体(endosome)pH值(例如约5.5至6.5)下，其中约1％至100％的可阳离子化脂质发生阳离子化。

阳离子脂质包括但不限于N,N-二油基-N,N-氯化二甲铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-溴化二甲铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-氯化三甲铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-氯化三甲铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙胺(DODMA)、3-(双十二烷基氨基)-N

本发明中，“聚乙二醇化脂质”指包含脂质部分和聚乙二醇部分的分子。聚乙二醇化脂质除了本发明结构通式(1)所示的，还包括但不限于聚乙二醇-1,2二肉豆蔻酸甘油酯(PEG-DMG)、聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、PEG-胆固醇、聚乙二醇-二酰基甘油(PEG-DAG)，聚乙二醇-二烷氧基丙基(PEG-DAA)，具体地包括聚乙二醇500-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇2000-二棕榈酰磷脂酰胆碱、聚乙二醇500-硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇500-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺、聚乙二醇2000-1,2-油酰基磷脂酰乙醇胺和聚乙二醇2000-2,3-二肉豆蔻酰甘油(PEG-DMG)等。

本发明中，“中性脂质”指在选定的pH下以无电荷或中性两性离子形式存在的许多脂质物质中的任一种，优选为磷脂，可以是合成的或天然来源的。

本发明中，“类固醇脂质”为类固醇或类固醇类似物。

本发明中，“N/P比”是指阳离子脂质中可电离的氮原子与核酸中磷酸的摩尔比。

本发明中，“核酸”是指DNA或RNA或其修饰的形式。

本发明中，“RNA”是指可能天然存在或非天然存在的核糖核酸。例如，RNA可以包括修饰过的和/或非天然存在的组分，如一个或多个核碱基、核苷、核苷酸或连接子。RNA可以包括帽结构、链终止核苷、茎环、聚腺苷酸序列和/或聚腺苷酸化信号。RNA可以具有编码所关注多肽的核苷酸序列。例如，RNA可以是信使RNA(mRNA)。翻译编码特定多肽的mRNA，例如在哺乳动物细胞内部体内翻译mRNA可以产生编码的多肽。RNA可以选自由以下组成的非限制性组：小干扰RNA(siRNA)、不对称干扰RNA(aiRNA)、微RNA(miRNA)、Dicer-底物RNA(dsRNA)、小发夹RNA(shRNA)、mRNA、单链向导RNA(sgRNA)、cas9mRNA及其组合物。本发明中，FLuc mRNA能表达荧光素酶蛋白，其在萤光素底物的存在下发射出生物光，所以FLuc常用于哺乳动物细胞培养以测量基因表达和细胞活度。本发明中，确定靶基因表达水平的方法包括不限于斑点印迹、northern印迹、原位杂交、ELISA、免疫沉淀、酶作用以及表型测定。

本发明中，“转染”是指将一个物种(例如RNA)引入细胞中。转染可以例如在体外、离体或体内发生。

本发明中，“抗原”典型地是指可以被免疫系统识别的物质，优选地被适应性免疫系统识别，并且能够触发抗原特异性免疫应答，例如通过作为适应性免疫应答的一部分形成抗体和/或抗原特异性T细胞的物质。典型地，抗原可以是或可以包含可以由MHC呈递给T细胞的肽或蛋白。在本发明的意义上，抗原可以是所提供的核酸分子(优选地如本文所定义的mRNA)的翻译产物。在此上下文中，包含至少一个表位的肽和蛋白的片段、变体和衍生物也被理解为抗原。

本发明中，“递送”是指将实体提供至目标。例如，将药物和/或治疗剂和/或预防剂递送至受试者，所述受试者为人类和/或其它动物的组织和/或细胞。

本发明中，“脂质组合物”为含有多种脂质成分的组合物。

本发明中，“脂质纳米颗粒”或“LNP”(lipid nanoparticle)是指包含一种或多种类型的脂质分子的纳米量级(如1nm至1000nm)颗粒。本发明中，LNP可以进一步包含至少一种药物分子。例如，“LNP-药物组合物”为包封药物分子的LNP，“LNP-mRNA”为包封mRNA的LNP。

本发明中，“脂质药物组合物制剂”指除了含有包封药物分子的LNP外，还含有药学上可接受的载体。

本发明中，“药学上可接受的载体”是指与治疗剂一同给药的稀释剂、辅剂、赋形 剂或媒介物，并且其在合理的医学判断的范围内适于接触人类和/或其它动物的组织而没有过度的毒性、刺激、过敏反应或与合理的益处/风险比相应的其它问题或并发症。在本发明的药物组合物中可使用的药学上可接受的载体包括但不限于无菌液体，例如水和油，包括那些石油、动物、植物或合成来源的油，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当所述药物组合物通过静脉内给药时，水是示例性载体。还可以使用生理盐水和葡萄糖及甘油水溶液作为液体载体，特别是用于注射液。适合的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽糖、白垩、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石、氯化钠、脱脂奶粉、甘油、丙二醇、水、乙醇等。所述组合物还可以视需要包含少量的湿润剂、乳化剂或pH缓冲剂。口服制剂可以包含标准载体，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。具体地，例如赋形剂包括但不限于抗黏附剂、抗氧化剂、黏合剂、包衣、压缩助剂、崩解剂、染料(色素)、缓和剂、乳化剂、填充剂(稀释剂)、成膜剂或包衣、调味剂、香料、助流剂(流动增强剂)、润滑剂、防腐剂、印刷墨水、吸附剂、悬浮剂或分散剂、甜味剂以及水合用水。更具体地赋形剂包括但不限于丁基化羟基甲苯(BHT)、碳酸钙、磷酸氢二钙、硬脂酸钙、交联羧甲基纤维素钠、交联聚乙烯吡咯烷酮、柠檬酸、交联聚维酮(crospovidone)、半胱氨酸、乙基纤维素、明胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乳糖、硬脂酸镁、麦芽糖醇、甘露糖醇、甲硫氨酸、甲基纤维素、对羟基苯甲酸甲酯、微晶纤维素、聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、预胶化淀粉、对羟基苯甲酸苯酯、视黄醇棕榈酸酯、虫胶、二氧化硅、羧甲基纤维素钠、柠檬酸钠、羟基乙酸淀粉钠、山梨糖醇、淀粉(玉米)、硬脂酸、蔗糖、滑石、二氧化钛、维生素A、维生素E(α-生育酚)、维生素C、木糖醇。

本发明中，药物组合物可以系统地作用和/或局部地作用。为此目的，它们可以适合的途径给药，例如通过注射(如静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、肌内注射，包括滴注)或经皮给药；或通过口服、含服、经鼻、透粘膜、局部、以眼用制剂的形式或通过吸入给药。对于这些给药途径，可以适合的剂型给药本发明的药物组合物。所述剂型包括但不限于片剂、胶囊剂、锭剂、硬糖剂、散剂、喷雾剂、乳膏剂、软膏剂、栓剂、凝胶剂、糊剂、洗剂、软膏剂、水性混悬剂、可注射溶液剂、酏剂、糖浆剂。

本发明中，“疫苗”为提供至少一种抗原或抗原功能的预防性或治疗性材料。抗原或抗原功能可以刺激身体的适应性免疫系统提供适应性免疫应答。

发明详述

本发明的一种实施方案如下：

1.2.一种聚乙二醇化脂质，其特征在于，结构如通式(1)所示：

其中，

X为-O-或-NH-；

L

L

L

B

R

R

n

本发明中，通式(1)化合物能够以非溶剂化或溶剂化形式存在，包括水合形式。一般来讲，出于本发明的目的，具有药学上可接受的溶剂(诸如水、乙醇等)的溶剂化形式等同于非溶剂化形式。

本发明中，通式(1)化合物及其盐、溶剂化物可以它们的互变异构形式存在，包括酮-烯醇互变、酰胺-亚胺酸互变、内酰胺-内酰亚胺互变、烯胺-亚胺互变、质子转移互变和价互变。

本发明中，通式(1)化合物应理解为包含其盐、互变异构体、立体异构体或溶剂化物。

1.2.1.X

本发明中，X为-O-或-NH-。

1.2.2.聚乙二醇链

本发明的一种具体实施方案中，优选聚乙二醇链对应的数均分子量为900、1000、1500、2000、2500、3000、3350、3500、4000、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000或11000。

本发明的一种具体实施方案中，优选聚乙二醇链为多分散性或单分散性，满足以下任一种情形：

情形(1)：聚乙二醇链为多分散性，且数均聚合度n

情形(2)：聚乙二醇链为单分散性，其EO单元数优选为20-70；更优选为20-60；更优选20、22、24、26、27、28、29、30、32、34、36、38、40、42、44、45、46、48、50、52、54、56、58、60中任一种。

1.2.3.L

本发明中，L

本发明的一种具体实施方案中，优选L

更优选L

更优选L

1.2.4.L

本发明中，L

本发明中，L

本发明中，B

本发明的一种具体实施方案中，优选L

情形(1)：B

情形(2)：B

情形(3)：L

本发明的一种具体实施方案中，优选所述B

更优选聚乙二醇化脂质的结构为式(2-2)或式(2-4)所示；更优选式(2-2)和式(2-4)中的L

进一步优选所述聚乙二醇化脂质的结构选自以下通式中任一种：

本发明的一种具体实施方案中，优选所述B

1.2.5.R

本发明中，R

本发明的一种具体实施方案中，R

情形(1)：环氧基、羟基、被保护的羟基、巯基、被保护的巯基、羧基、被保护的羧基、氨基、被保护的氨基、醛基、被保护的醛基、活性酯基、烯基、烯酸酯基、叠氮基、氰基、二硫代吡啶基、α‐卤代乙酰基炔基、炔基、

情形(2)：为具有治疗靶向性的功能性基团；优选为叶酸、胆固醇、生物素、N-乙酰基半乳糖胺中任一种的残基或任一种的功能性衍生物的残基；

进一步优选为以下结构中任一种：

1.2.6.R

本发明中，R

本发明的一种具体实施方案中，R

1.2.7.B

本发明中，B

本发明的一种具体实施方案中，优选B

1.2.8.具体的结构举例

本发明的一些具体实施方案，最终得到了结构如下所示的聚乙二醇化脂质，包括但不限于以下结构中任一种：

或者所述聚乙二醇化脂质选自以下结构中任一种：

2.含有赖氨酸核的聚乙二醇化脂质的制备

2.1.小分子中间体IM-1、IM-2

本发明的一种具体实施方案中，结构如式(1)所示的含有赖氨酸核的聚乙二醇化脂质的制备过程涉及小分子中间体IM-1和IM-2，IM-1和IM-2的结构如下所示：

其中，IM-2中的L

本发明的一种具体实施方案中，IM-1优选为以下通式中任一种：

其中任一种的末端羧基被保护的形式；其中，B

其中任一种结构的末端反应性基团羧基被保护的形式。

本发明的一种具体实施方案中，IM-2优选为以下结构式中任一种：

2.2.活性聚乙二醇衍生物PEG

本发明的一种具体实施方案中，结构如式(1)所示的聚乙二醇化脂质的制备过程中涉及含有反应性基团的聚乙二醇衍生物PEG

2.3.具体的制备方法

本发明中，前述的任一种含有赖氨酸核的聚乙二醇化脂质的制备可以采用包括但不限于以下的方法：

2.3.1.方法一：

步骤一、制备小分子中间体IM-1：将一分子赖氨酸A-1与小分子A-2反应生成赖氨酸核脂质小分子中间体IM-1；其中，F

步骤二、小分子中间体IM-1的羧基与含有反应性基团的聚乙二醇衍生物PEG

当R

当R

其中，X、R

步骤一、

步骤二：

例如，实施例1.1中，S1-1对应上述路线中的A-1，S1-2对应上述路线中的A-2，经取代反应获得S1-3对应IM-1，IM-1与活性聚乙二醇衍生物PEG

2.3.2.方法二：

步骤一、制备小分子中间体IM-1：同.2..3.1方法一中的步骤一，在此不再赘述；

步骤二、制备小分子中间体IM-2：小分子中间体IM-1的羧基与小分子B-3的反应性基团F

步骤三、小分子中间体IM-2的F

当R

当R

其中，X、R

步骤一、

步骤二、

步骤三、

例如，实施例5.1中，S1-3对应上述路线中的IM-1，S5-1对应上述路线中的B-3，经取代反应获得S5-2(对应IM-2)，IM-2与活性聚乙二醇衍生物PEG

3.脂质组合物

本发明的一种具体实施方案中，一种脂质组合物，其含有前述的结构如通式(1)所述的任一聚乙二醇化脂质。

本发明的一种更具体的实施方案中，优选脂质组合物除了含有结构如通式(1)所示的聚乙二醇化脂质，还含有磷脂、类固醇脂质和阳离子脂质中的一种或者一种以上，选自以下情形中任一种：

情形(1)：还含有磷脂；

情形(2)：还含有类固醇脂质；

情形(3)：还含有阳离子脂质；

情形(4)：还含有磷脂和类固醇脂质；

情形(5)：还含有磷脂和阳离子脂质；

情形(6)：还含有类固醇脂质和阳离子脂质；

情形(7)：还含有磷脂、类固醇脂质和阳离子脂质；

更优选还同时含有磷脂、类固醇脂质和阳离子脂质三种脂质。

本发明的一种更具体的实施方案中，脂质组合物中的磷脂优选为1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二油酰 基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-双十一烷酰基-sn-甘油-磷酸胆碱(DUPC)、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、1,2-二-O-十八碳烯基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(18:0Diether PC)、1-油酰基-2-胆固醇基半琥珀酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(OChemsPC)、1-十六烷基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(C16Lyso PC)、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(ME 16.0PE)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二亚麻酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二花生四烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-双二十二碳六烯酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-(1-甘油)钠盐(DOPG)、二油酰基磷脂酰丝氨酸(DOPS)、二棕榈酰基磷脂酰甘油(DPPG)、棕榈酰基油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、二硬脂酰基-磷脂酰-乙醇胺(DSPE)、二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰基磷酸乙醇胺(DMPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-硬脂酰乙醇胺(SOPE)、1-硬脂酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(SOPC)、鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰基油酰基磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺(LPE)中任一种及其组合物；所述磷脂可以是合成的或天然来源的。

本发明的一种更具体的实施方案中，优选脂质组合物中的类固醇脂质选自胆固醇、粪固醇、谷固醇、麦角固醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、番茄碱、熊果酸、α-生育酚中任一种及其组合物。

本发明的一种更具体的实施方案中，优选脂质组合物中的阳离子脂质选自N,N-二油基-N,N-氯化二甲铵(DODAC)、N,N-二硬脂基-N,N-溴化二甲铵(DDAB)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-氯化三甲铵(DOTAP)、N-(1-(2,3-二油基氧基)丙基)-N,N,N-氯化三甲铵(DOTMA)、N,N-二甲基-2,3-二油基氧基丙胺(DODMA)、3-(双十二烷基氨基)-N1,N1,4-三-十二烷基-1-哌嗪乙胺(KL10)、N1-[2-(双十二烷基氨基)乙基]-N1,N4,N4-三-十二烷基-1,4-哌嗪二乙胺(KL22)、14,25-双十三烷基-15,18,21,24-四氮杂-三十八烷(KL25)、1,2-二亚油基氧基-N,N-二甲基氨基丙烷(DLin-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-K-DMA)、4-(二甲基氨基)丁酸三十七碳-6,9,28,31-四烯-19-基酯(DLin-MC3-DMA)、2,2-二亚油基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1,3]-二氧杂环戊烷(DLin-KC2-DMA)、((4-羟基丁基)氮杂二烷基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(ALC-0315)和十七烷-9-基-8-((2-羟乙基)(6-氧代-6-((十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯)(SM102)中任一种及其组合物。

本发明的一种更具体的实施方案中，优选脂质组合物中的阳离子脂质选自以下结构中任一种及其组合物：

本发明的一种具体的实施方案中，聚乙二醇化脂质、阳离子脂质、磷脂、类固醇脂质各自占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比没有特别限制；所述百分比为各脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比。

本发明的一种更具体的实施方案中，优选脂质组合物包含20-80％的阳离子脂质、5-15％的磷脂、25-55％的类固醇脂质和0.5-10％的聚乙二醇化脂质。

本发明的一种更具体的实施方案中，优选所述聚乙二醇化脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为1-5％；更优选为1-3％；更优选为约1.5％、1.6％、1.7％、1.8％、1.9％；

优选所述阳离子脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为30-65％；更优选为约35％、40％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、55％；

优选所述磷脂占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为7.5-13％；更优选为约8％、9％、10％、11％、12％；

优选所述类固醇脂质占包含溶剂的溶液中的总脂质的摩尔百分比为35-50％，更优 选为约40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％。

3.1.脂质组合物的制备

本发明中，脂质组合物可以通过以下方法进行制备，包括但不限于乙醇注入法，微流控法，T型管混合法，过膜挤压法，优选为乙醇注入法和微流控法。

4.脂质药物组合物及其制剂

4.1.脂质药物组合物

本发明的一种实施方案中，一种脂质药物组合物，含有前文1.3部分所述的任一种脂质组合物和药物，其中，脂质组合物含有前文所述的任一种结构如通式(1)所示的聚乙二醇化脂质，所述药物选自核酸药物、基因疫苗、抗肿瘤药物、小分子药物、多肽药物或蛋白质药物中任一种。

本发明的一种具体实施方案中，脂质药物组合物中，所述核酸类药物选自RNA、DNA、反义核酸、质粒、干扰核酸、适体、antagomir和核酶任一种，所述RNA选自mRNA、saRNA、circRNA、miRNA和siRNA中任一种；优选核酸药物为DNA、mRNA、miRNA和siRNA中任一种。

本发明的一种具体实施方案中，脂质药物组合物优选作为药物使用，选自以下任一种药物：抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗真菌剂和疫苗。

本发明的一种具体实施方案中，优选所述脂质组合物与所述核酸的N/P比为(0.1～100):1，更优选为(0.2～30):1，最优选为(0.5～20):1。

4.2.一种脂质药物组合物制剂

本发明的一种具体实施方案中，脂质药物组合物中的药物为核酸药物，且脂质药物组合物制剂工作液为去离子水、超纯水、磷酸盐缓冲液或生理盐水，更优选为磷酸盐缓冲液或生理盐水，最优选为生理盐水；优选脂质组合物:工作液＝(0.05～20)g:100mL，更优选为(0.1～10)g:100mL，最优选为(0.2～5)g:100mL。

本发明的一种具体实施方案中，一种脂质药物组合物制剂，含有前述的脂质药物组合物和药学上可接受的稀释剂或赋形剂，所述稀释剂或赋形剂优选为去离子水、超纯水、磷酸盐缓冲液和生理盐水中任一种，更优选为磷酸盐缓冲液或生理盐水，最优选为生理盐水。

本发明中，脂质药物组合物制剂的制备，包含下述步骤：

(1)将所述脂质组合物在所述稀释剂或赋形剂中平衡；

(2)将核酸类药物加入平衡后的脂质组合物与稀释剂或赋形剂的混合物中进行复合；

其中，优选地，所述平衡时间为0.1～12h，优选为0.2～6h，更优选为0.5～3h；优选地，所述复合时间为0.1～12h，优选为0.2～5h，更优选为0.5～2h。

5.脂质体或者脂质纳米颗粒及其制备

5.1.脂质体或者脂质纳米颗粒

本发明的一种具体实施方案中，一种脂质体或者脂质纳米颗粒含有前文所述的任一种脂质药物组合物。

本发明的一种具体实施方案，优选前述的脂质纳米颗粒为LNP-药物组合物、LPP-药物组合物或PNP-药物组合物；优选为LNP-药物组合物；更优选为LNP-核酸药物组合物；更优选为LNP-mRNA药物组合物。

5.2.脂质体或者脂质纳米颗粒的制备

本发明的一种具体实施方案中，脂质体可以通过以下方法进行制备，包括但不限于薄膜分散法、超声分散法、反相蒸发法、冷冻干燥法、冻融法、复乳法和注入法，优选为薄膜分散法、超声分散法和/或反相蒸发法。

本发明的一种具体实施方案中，脂质纳米颗粒可以通过以下方法进行制备，包括但不限于微乳法、复乳法、高剪切均质超声法、薄膜水化挤出法、微流控法。

本发明的一种具体实施方案中，脂质体采用薄膜分散法进行制备，所述薄膜分散法包括以下步骤：

(1)称取阳离子脂质、类固醇脂质、磷脂和聚乙二醇化脂质，将其在有机溶剂中充分溶解，摇匀，减压旋蒸除去有机溶剂，形成油膜，用真空泵抽干，除去有机溶剂；

(2)加入溶解有冷冻保护剂的磷酸盐缓冲液，水浴超声，形成半透明状乳液；

(3)将乳液加入到高压均质机中过压，之后将过压后的乳液加入脂质体挤出器中过膜，形成脂质体；

(4)任选地，将所述脂质体在冷冻干燥机中干燥，形成脂质体粉末；

其中，优选地，所述有机溶剂为二氯甲烷、三氯甲烷和/或甲醇，更优选为三氯甲烷和甲醇；优选地，所述减压旋蒸的转速为30～300rpm，更优选为50～200rpm，最优选为100～170rpm；优选地，所述减压旋蒸的温度为10～200℃，更优选为20～100℃，最优选为40～80℃；

优选地，所述真空泵抽干时间为1～72h，更优选为5～48h，最优选为15～36h；

优选地，所述冷冻保护剂溶于磷酸盐缓冲液的质量浓度为0.1-80％，优选为1-50％，更优选为5～20％；

优选地，所述水浴超声的频率为10～300kHz，更优选为30～200kHz，最优选为60～150kHz；

优选地，所述水浴超声的时间为0.1～5h，更优选为0.2～2h，最优选为0.25～1h；

优选地，所述高压均质机的压力为50～240MPa，更优选为80～200MPa，最优选为100～150MPa；

优选地，所述高压均质机的过压次数为1～50间的任意整数，更优选为3～20间的任意整数，最优选为5～10次间的任意整数；

优选地，所述脂质体挤出器的压力为50～300MPa，更优选为80～250MPa，最优选为120～200MPa；

优选地，所述脂质体挤出器的过膜次数为1～50间的任意整数，更优选为3～30间的任意整数，最优选为5～20间的任意整数；

优选地，所述冷冻干燥机的干燥时间为1～120h，更优选为5～72h，最优选为10～36h。

本发明的一种具体实施方案中，脂质体的制备方法中，脂质体：溶解有冷冻保护剂的磷酸盐缓冲液可以为1mg：(0.1～100)mL，优选为1mg：(0.3～50)mL，更优选为1mg：(0.5～5)mL。

本发明的一种具体实施方案中，优选脂质纳米颗粒采用微流控的方法进行制备，步骤如下：

(1)将各个脂质组分溶于有机溶剂，获得溶于有机相的脂质组合物；所述有机相优选为乙醇；

(2)将核酸药物加到缓冲液，获得水相溶液；所述水相优选为柠檬酸缓冲盐或者乙酸钠缓冲液；

(3)通过微流控设备将有机相溶液和水相溶液混合形成脂质纳米颗粒组合物，并通过超滤等进行纯化以除去有机溶剂和游离的核酸分子。

下面结合一些具体实施例对聚乙二醇化脂质、脂质组合物、脂质药物组合物制剂的制备方法及脂质药物组合物的生物活性测试做进一步描述，具体实施例为进一步详细说明本发明，非限定本发明的保护范围。其中，制备聚乙二醇化脂质的实施例中，终产物 通过核磁表征结构，通过GPC或MALDI-TOF确认分子量。

实施例1.1：聚乙二醇化脂质(E1-1)

制备过程如下所示：

步骤a：将赖氨酸(S1-1，0.58g，4.0mmol)溶解在丙酮和水(2:1，v/v)的混合溶液中。向混合物中滴加10％(wt％)NaOH水溶液调节pH为8.5-9.5。在冰浴条件下，边搅拌边滴加十四酰氯(S1-2，1.35g，5.2mmol)，在此过程中，滴加10％的NaOH水溶液使pH保持在7.5-11.5之间。然后将混合液在冰浴下继续搅拌2.5h，反应结束后，室温下静置过夜。旋蒸去除溶剂，然后向残余物中加入浓盐酸和水的混合溶液(1:1，v/v)调节pH为1-2。将析出的固体过滤，滤液用去离子水洗涤至pH为7，然后用石油醚洗涤3次，最后用甲醇重结晶得到小分子脂质中间体S1-3(1.75g)。

步骤b：将单氨基甲氧基封端的PEG2000(S1-4，2.00g，1.0mmol，mPEG-CH

实施例1.2：聚乙二醇化脂质(E1-2)

制备过程如下所示：

将mPEG-CH

实施例2.1：聚乙二醇化脂质(E2-1)

制备过程如下所示：

步骤a：将S1-1(0.58g，4.0mmol)溶解在无水DMF(50mL)中，然后依次加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA，25.44mL，145.2mmol)和化合物S2-1(2.44g，7.2mmol)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，浓缩滤液，用乙酸乙酯(50mL)溶解粗产物，然后依次用0.5M柠檬酸(50mL*3)、NaHCO

步骤b：将S1-4(2.00g，1.0mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.32g，2.6mmol)、S2-2(1.25g，2.0mmol)和EDC(0.38g，2.0mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到聚乙二醇化脂质E2-1(1.87g)。

实施例2.2：聚乙二醇化脂质(E2-2)

制备过程如下所示：

将S1-5(2.10g，1.0mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.32g，2.6mmol)、S2-2(1.25g，2.0mmol)和EDC(0.38g，2.0mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到聚乙二醇化脂质E2-2(1.92g)。

实施例3.1：聚乙二醇化脂质(E3-1)

制备过程如下所示：

步骤a：将S1-1(0.58g，4.0mmol)溶解在无水DMF(50mL)中，然后依次加入DIPEA(25.44mL，145.2mmol)和化合物S3-1(2.92g，7.2mmol)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，浓缩滤液，用乙酸乙酯(50mL)溶解粗产物，然后依次用0.5M柠檬酸(50mL*3)、NaHCO

步骤b：将S1-4(2.00g，1.0mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.32g，2.6mmol)、S3-2(1.52g，2.0mmol)和EDC(0.38g，2.0mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到聚乙二醇化脂质E3-1(2.13g)。

实施例3.2：聚乙二醇化脂质(E3-2)

制备过程如下所示：

将S1-5(2.10g，1.0mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.32g，2.6mmol)、S3-2(1.52g，2.0mmol)和EDC(0.38g，2.0mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到聚乙二醇化脂质E3-2(2.07g)。

实施例4.1：聚乙二醇化脂质(E4-1)

制备过程如下所示：

步骤a：将甘氨酸叔丁酯(S4-1，0.59g，4.5mmol)溶解于二氯甲烷，在0℃下依次加入1‐乙基‐(3‐二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(EDCI，1.15g，6.0mmol)、1‐羟基苯并三唑(HOBt，0.61g，4.5mmol)并搅拌5～10min，随后将混合溶液移至室温反应1～3h，得到反应液A。将化合物S2-2(1.88g，3.0mmol)溶解于二氯甲烷，在室温下加入三乙胺(0.61g，6.0mmol)，搅拌反应1～3h，得到反应液B。将反应液B缓慢滴加进反应液A，室温搅拌6～20h。反应结束后，反应液用适量水洗涤两次，10％柠檬酸水溶液洗涤两次，饱和食盐水洗涤一次，无水硫酸钠干燥后，抽滤浓缩，粗产物经柱层析纯化，得到化合物S4-2(1.86g)。

步骤b：脱除tBu保护基。在干燥洁净的圆底烧瓶中，配制三氟乙酸/二氯甲烷(1:2，v/v)的溶液，冰浴条件下缓慢滴加S4-2(1.48g，2.0mmol)的二氯甲烷溶液，室温反应2小时。反应结束后，浓缩反应液，加入纯化水，摇匀，用二氯甲烷萃取，将有机相用无水硫酸镁干燥，过滤，浓缩滤液，重结晶得到小分子脂质中间体S4-3(1.26g，92.1％)。

步骤c：将S1-4(1.20g，0.6mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.19g，1.6mmol)、S4-3(0.82g，1.2mmol) 和EDC(0.23g，1.2mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到聚乙二醇化脂质E4-1(1.19g)。

实施例4.2：聚乙二醇化脂质(E4-2)

制备过程如下所示：

将S1-5(1.26g，0.6mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.19g，1.6mmol)、S4-3(0.82g，1.2mmol)和EDC(0.23g，1.2mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到聚乙二醇化脂质E4-2(1.21g)。

实施例5.1：聚乙二醇化脂质(E5-1)

制备过程如下所示：

步骤a：将S1-3(1.19g，2.0mmol)、HOBt(0.47g，2.2mmol)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU，0.83g，2.2mmol)、DIPEA(0.70mL，4.0mmol)依次加入二氯甲烷(60mL)中，室温搅拌30min，得到反应液A。将乙二胺(S5-1，6.00g，100.0mmol)溶解于二氯甲烷，得到反应液B。将反应液A缓慢滴加进反应液B，室温下搅拌反应24h。反应结束后，反应液依次用10％柠檬酸(20mL)、1M NaHCO

步骤b：将S5-3(2.50g，1.0mmol，mPEG-SC，M

实施例5.2：聚乙二醇化脂质(E5-2)

制备过程如下所示：

步骤a：将S1-3(1.19g，2.0mmol)、HOBt(0.47g，2.2mmol)、HBTU(0.83g，2.2mmol)、DIPEA(0.70mL，4.0mmol)依次加入二氯甲烷(80mL)中，室温搅拌30min，得到反应液A。将1,3-丙二胺(S5-4，7.40g，100.0mmol)溶解于二氯甲烷，得到反应液B。将反应液A缓慢滴加进反应液B，室温下搅拌反应24h。反应结束后，反应液依次用10％柠檬酸(30mL)、1M NaHCO

步骤b：将S5-3(2.50g，1.0mmol)和三乙胺(0.70mL，3.2mmol)的溶液溶解在无水DMF(30mL)中。S5-5(0.68g，1.1mmol)溶解在无水DMF(10mL)中。将上述溶液混合并在室温下搅拌一夜。反应结束后，反应液浓缩得到粗品，通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到聚乙二醇化脂质E5-2(2.48g)。

实施例6.1：聚乙二醇化脂质(E6-1)

制备过程如下所示：

步骤a：将S2-2(1.25g，2.0mmol)、HOBt(0.47g，2.2mmol)、HBTU(0.83g，2.2mmol)、DIPEA(0.70mL，4.0mmol)依次加入二氯甲烷(80mL)中，室温搅拌30min，得到反应液A。将S5-1(6.00g，100.0mmol)溶解于二氯甲烷，得到反应液B。将反应液A缓慢滴加进反应液B，室温下搅拌反应24h。反应结束后，反应液依次用10％柠檬酸(30mL)、1M NaHCO

步骤b：将S5-3(2.50g，1.0mmol)和三乙胺(0.70mL，3.2mmol)的溶液溶解在无水DMF(30mL)中。S6-1(0.70g，1.1mmol)溶解在无水DMF(10mL)中。将上述溶液混合并在室温下搅拌一夜。反应结束后，反应液浓缩得到粗品，通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到聚乙二醇化脂质E6-1(2.51g)。

实施例6.2：聚乙二醇化脂质(E6-2)

制备过程如下所示：

步骤a：将S2-2(1.25g，2.0mmol)、HOBt(0.47g，2.2mmol)、HBTU(0.83g，2.2mmol)、DIPEA(0.70mL，4.0mmol)依次加入二氯甲烷(80mL)中，室温搅拌30min，得到反应液A。将S5-4(7.40g，100.0mmol)溶解于二氯甲烷，得到反应液B。将反应液A缓慢滴加进反应液B，室温下搅拌反应24h。反应结束后，反应液依次用10％柠檬酸(30mL)、1M NaHCO

步骤b：将S5-3(2.50g，1.0mmol)和三乙胺(0.70mL，3.2mmol)的溶液溶解在无水DMF(30mL)中。S6-2(0.72g，1.1mmol)溶解在无水DMF(10mL)中。将上述溶液混合并在室温下搅拌一夜。反应结束后，反应液浓缩得到粗品，通过柱层析纯化，浓缩，油泵抽干得到聚乙二醇化脂质E6-2(2.60g)。

实施例7.1：聚乙二醇化脂质(E7-1)

制备过程如下所示：

将S7-1(2.00g，1.0mmol，

实施例7.2：聚乙二醇化脂质(E7-2)

参考E7-1的制备过程，以S1-3和S7-2(

实施例7.3：聚乙二醇化脂质(E7-3)

参考E7-1的制备过程，以S1-3和S7-3(

实施例7.4：聚乙二醇化脂质(E7-4)

制备过程如下所示：

将S7-1(2.00g，1.0mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.32g，2.6mmol)、S2-2(1.25g，2.0mmol)和EDC(0.38g，2.0mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到聚乙二醇化脂质E7-4(1.61g)。

实施例7.5：聚乙二醇化脂质(E7-5)

参考E7-4的制备过程，以2-2和S7-2

实施例7.6：聚乙二醇化脂质(E7-6)

参考E7-4的制备过程，以2-2和S7-3

实施例8.1：聚乙二醇化脂质(E8-1)

制备过程如下所示：

将S7-2(2.00g，1.0mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.32g，2.6mmol)、S3-2(1.52g，2.0mmol)和EDC(0.38g，2.0mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到聚乙二醇化脂质E8-1(1.96g)。

实施例8.2：聚乙二醇化脂质(E8-2)

制备过程如下所示：

将S7-3(2.00g，1.0mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.32g，2.6mmol)、S3-2(1.52g，2.0mmol)和EDC(0.38g，2.0mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到聚乙二醇化脂质E8-2(1.97g)。

实施例9.1：聚乙二醇化脂质(E9-1)

制备过程如下所示：

将S9-1(2.70g，1.0mmol，mPEG-CM，M

实施例9.2：聚乙二醇化脂质(E9-2)

制备过程如下所示：

将S9-1(2.70g，1.0mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.32g，2.6mmol)、S6-2(1.36g，2.0mmol)和EDC(0.38g，2.0mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到聚乙二醇化脂质E9-2(2.44g)。

实施例10：聚乙二醇化脂质(E10-1)

制备过程如下所示：

向装有溶于二氯甲烷(50mL)的S3-2(1.52g，2.0mmol)和S10-1(2.00g，1.0mmol，mPEG-OH，M

实施例11：聚乙二醇化脂质(E11-1)

制备过程如下所示：

向装有溶于二氯甲烷(50mL)的S1-3(1.19g，2.0mmol)和S10-1(2.00g，1.0mmol)的圆底烧瓶中依次加入EDCI(0.58g，3.0mmol)和DMAP(0.12g，1.0mmol)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，反应液用1M HCl溶液(50mL)淬灭，分离有机层，水层用二氯甲烷(50mL*2)萃取，合并有机层，用无水Na

实施例12：聚乙二醇化脂质(E12-1)

制备过程如下所示：

步骤a：向装有溶于二氯乙烷(50mL)的半乳糖胺五乙酸酯(S12-1，2.33g，6.0mmol)的圆底烧瓶中加入三氟甲磺酸三甲基硅酯(TMSOTf，2.00g，9.0mmol)，并在50℃下水浴中搅拌90分钟，然后停止加热，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液倒入冰冷的碳酸氢钠溶液中，二氯甲烷萃取，水洗有机相，并用无水Na

步骤b：将上述化合物S12-2(1.65g，5.0mmo1))和4-羟基丁酸苄酯(S12-3，1.46g，7.5mmol)溶解在二氯乙烷(20mL)中，加入适量分子筛，搅拌反应30分钟。然后加入TMSOTf(0.56g，2.5mmo1)，室温下搅拌反应过夜。反应结束后，将反应液倒入冰冷的碳酸氢钠溶液中，二氯甲烷萃取，水洗有机相，并用无水Na

步骤c：将化合物S12-4(1.57g，3.0mmo1)溶解在甲醇/乙酸乙酯的混合物中,并用氩脱气。加入Pd/C(0.15g)并在气球压力下搅拌反应过夜。反应结束后，过滤，用甲醇冲洗并在真空中干燥以得到化合物S12-5(1.27g，98％)。

步骤d：将S12-6(2.10g，1.0mmol，M

步骤e：将S12-7(1.25g，0.5mmol)溶解在无水DMF和无水DCM混合溶液中(1:8，v/v)，冰浴条件下依次缓慢加入DMAP(0.16g，1.3mmol)、S1-3(0.59g，1.0mmol)和EDC(0.19g，1.0mmol)，室温下搅拌过夜。反应结束后，浓缩滤液，用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，将收集的沉淀物再次用少量DCM溶解，然后缓慢滴加到乙醚溶液中，过滤，收集沉淀，最后干燥得到S12-8(1.09g)。

步骤f：将化合物S12-8(0.90g，0.3mmo1)溶于MeOH/DCM(10mL，2:1)的混合溶液中，向其中加入NaOMe(10mL，在MeOH中的0.5M溶液)并搅拌反应过夜。反应结束后，使用乙酸调节pH至5-6。浓缩后在真空中干燥得到聚乙二醇化脂质E12-1(0.80g，92％)。

实施例13：LNP-mRNA药物组合物的制备及其理化性质测试

实施例13.1：LNP-mRNA药物组合物的制备

本实施中，制备了多组含有Fluc-mRNA的LNP-mRNA药物组合物进行比较，各组含有的磷脂都为DSPC，含有的甾醇类脂质都为胆固醇，阳离子脂质都为CL-1，不同在于聚乙二醇化脂质，其中，对照组(L-CT1和L-CT2)：聚乙二醇化脂质为PEG2k-DMG(简称DMG)和乙二醇2000丁二酸双十四醇酯(PEG

所述CL-1参考CN113402405A披露的制备方法获得，其结构如下：

LNP-mRNA药物组合物制备方法如下：

步骤a：将阳离子脂质、DSPC、胆固醇、聚乙二醇化脂质按照48:9:42:1.5的摩尔比溶于乙醇，获得乙醇相溶液；

步骤b：将Fluc-mRNA加到10～50mM的柠檬酸盐缓冲液(pH＝4)中，获得水相溶液；

步骤c：将乙醇相溶液和水相溶液混合(1:3v/v)制备LNP-mRNA，并通过多次DPBS超滤洗涤以除去乙醇和游离分子，最后通过0.2μm的无菌过滤器过滤以得到LNP-mRNA药物组合物。

实施例13.2：LNP-mRNA药物组合物的理化性质测试

包封率测定：使用Quant‐it Ribogreen RNA定量测定试剂盒测定LNP-mRNA组合物的包封率，结果显示本发明的脂质组合物(L-1～L-25)对核酸药物(mRNA)有较高的包封率，均在80％-98％的范围内，大部分包封率在90％-98％的范围内。结果表明各实验组的聚乙二醇化脂质制备的脂质组合物能很好地包封mRNA，显示出比现有聚乙二醇化脂质DMG更优异的包封率，各个不同的聚乙二醇化脂质的包封率之间也存在着差异。

粒径测定：本实施例中，通过动态光散射(DLS)测定LNP-mRNA的粒径，结果如下表1所示。所测定的LNP-mRNA尺寸均匀性较高，其PDI均小于0.3。本申请的脂质组合物制备的LNP-mRNA的粒径在90-120nm的范围内。

表1：各脂质组合物的配方及其制备的LNP-mRNA的粒径和包封率汇总表

实施例14：LNP-mRNA药物组合物的生物学活性测试

(1)细胞毒性(生物相容性)的研究

通过市售的细胞增殖检测试剂盒(MTS，Promega)评估LNP-mRNA组合物制剂的细胞毒性，在96孔板中接种40000个293T细胞/孔，过夜培养，以每孔剂量为0.2μg mRNA的Luciferase mRNA脂质组合物制剂转染293T细胞，游离的Luciferase mRNA作为阴性对照组，DMG和PEG

(2)细胞水平mRNA转染率的研究

为了考察本发明实施例13中制备的各组LNP-mRNA组合物细胞水平的mRNA转染率，采用Luciferase生物发光进行测试。将LNP-mRNA组合物制剂溶解于培养基中配成所需剂量，用293T细胞作为细胞模型，以接种密度4×10

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，对此应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。