一种生物微球及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种新的改性的生物微球，及其该生物微球的制备方法和应用。

背景技术

蛋白质是细胞的功能执行体，有些关键蛋白质是研究疾病机理和诊治药物等的直接靶体库，面对复杂多样的蛋白质，蛋白质的分离纯化在蛋白结构功能、相互作用及动态变化的分析解析，生物医药的制造，生物蛋白分子的检测诊断等领域尤为重要。因此开发具有高效、高选择性、高容量的蛋白质分离纯化新技术和新方法，实现目标蛋白质的分离纯化，对于蛋白质研究具有十分重要的意义。

现有技术中，亲和层析法以其特异性相互作用力强、分离选择性高、纯度高、回收率高等优点，成为了目前最有效的蛋白质分离方法，被广泛应用于复杂体系中目标蛋白质的高效分离。固定金属亲和层析的固定相由四个部分组成：基质、间臂、螯合配体和金属离子。其中，基质构成固定相的骨架；间臂是连接基质与配体间的桥梁；螯合配体是用来固定金属离子。目前，常用的载体基质材料主要是磁性纳米颗粒、纤维素和聚合物等，应用最为广泛的是琼脂糖凝胶，虽然其多孔结构增加了比表面积，提供更多的间臂位点，提高配体的空间利用度，从而拥有更多的过渡金属结合位点，增强蛋白质和金属离子的结合，但仍存在一些问题：1.原材料成本高；2.过多的空隙结构会增加蛋白质吸附和洗脱时间；3.填料不易清洗和再生；4.空隙过小会导致堵孔，从而引发填料柱干裂等；5.耐压能力较差。

发明内容

本发明要解决的技术问题是：为解决现有技术中原材料成本高、多孔结构材料蛋白质吸附和洗脱时间长、填料不易清洗和再生、填料柱堵孔及干裂和多孔材料耐压能力较差的缺陷，从而提供一种新的改性的生物微球，以及提供该生物微球的制备方法和应用。

本发明提供了一种生物微球，该微球不具有磁性，以微球本体为载体基质构成固定相的骨架，经过偶联剂接枝，将官能基团引入到微球表面，利用官能团与聚合单体的共价结合引入单体，将单体通过链引发的方式聚合到微球表面，再利用官能团之间的共价反应将螯合配体共价偶联到聚合物的每个单体上，然后再加入过渡金属离子，螯合至每个配基上，过渡金属离子上的空轨道作为配位作用的结合位点，在溶液中，空轨道一般被水分子或阴离子占据，当蛋白质氨基酸残基的N和S具有更强的配位能力，可以取代水分子或阴离子，将相应的生物分子固定在材料表面。通过调节溶液pH值、添加竞争性洗脱剂(如咪唑等)等方式改变氨基酸与金属亲和基团的作用力，从而将生物分子从亲和基质上洗脱，实现生物分子的高选择性分离纯化。

1.本发明第一方面提供一种生物微球其特征在于：包含有如下式(I)结构：

其中微球1～微球3相同或不同，且微球1～微球3的总数为3；R

作为优选方案之一，所述n为大于1的数。

作为优选方案之一，所述的生物微球，所述的R

作为优选方案之一，所述的R

作为优选方案之一，所述的R

作为优选方案之一，所述L的前体，即配体化合物，含有胺基或羧基。

作为优选方案之一，所述M优选为Ni、Cu和/或Co；更优选为Ni。

作为优选方案之一，所述式(I)的部分结构

2.本发明第二方面提供了本发明第一方面所述的一种生物微球的制备方法，包括以下步骤：

(1)将微球本体使用碱液处理，得到微球A；

(2)将偶联剂与所述微球A混合处理，形成微球B；

优选之一，所述偶联剂选自硅烷偶联剂；

(3)将微球B使用引发剂处理，得到微球C；

(4)将微球C与丙烯酸类单体分子反应，形成微球D；

(5)将微球D与配体化合物以及金属盐反应，得到最终的生物微球E。

作为优选方案之一，微球本体表面含有硅或氧化硅。

作为优选方案之一，所述的微球本体选自任意被二氧化硅包裹的非磁性材料、玻璃或陶瓷。

作为优选方案之一，所述微球选自玻璃微球、陶瓷微球或玻璃陶瓷微球。

作为优选方案之一，所述微球选自任意被二氧化硅包裹或表面上富有二氧化硅的微球。

作为优选方案之一，所述的微球不具有磁性。

作为优选方案之一，所述偶联剂选自硅烷偶联剂。

作为优选方案之一，所述偶联剂选自氨基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、3-(甲基丙烯酰氧)丙基三甲氧基硅烷、乙烯基三甲氧基硅烷、巯丙基三甲氧基硅烷或苯胺甲基三甲氧基硅烷中的一种或多种。

作为优选方案之一，所述偶联剂选自

作为优选方案之一，m优选为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

作为优选方案之一，R

作为优选方案之一，所述偶联剂选自3-氨基丙基三乙氧基硅烷或3-氨基丙基三甲氧基硅烷。

作为优选方案之一，所述的丙烯酸类单体分子选自：丙烯酸、丙烯酸盐、丙烯酸C

作为优选方案之一，所述的丙烯酸类单体分子选自丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸丙酯、甲基丙烯酸异丙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯等。

作为优选方案之一，所述含配体化合物选自多酸配体或多胺配体。

作为优选方案之一，所述含配体化合物选自胺基多酸配体。

作为优选方案之一，所述配体化合物选自N,N-双羧甲基-L-赖氨酸、亚氨基二乙酸、乙二胺四乙酸、氨基三乙酸、二乙三胺五乙酸、三乙四胺六乙酸、苯基亚氨基乙酸、丙二胺四乙酸、乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸或三亚乙基二胺中的一种或多种。

作为优选方案之一，所述含配体化合物优选为N,N-双羧甲基-L-赖氨酸。

作为优选方案之一，所述步骤(4)的中使用了引发剂。

作为优选方案之一，所述的引发剂选自偶氮类引发剂和过氧化物引发剂；优选偶氮类引发剂。

作为优选方案之一，所述步骤(3)和(4)的引发剂选自4,4'-偶氮双(氰基戊酸)、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二异丁脒盐酸盐、偶氮二异丁咪唑啉盐酸盐或偶氮异丁氰基甲酰胺中的一种或多种。

作为优选方案之一，所述步骤(4)中引发剂与丙烯酸类单体分子的质量比为0.1％～1％。

作为优选方案之一，所述步骤(4)中引发剂与丙烯酸类单体分子的质量比为0.1％～0.5％。

作为优选方案之一，所述步骤(3)和(4)的引发剂可以相同或不同。

作为优选方案之一，所述的步骤(4)中使用了交联剂。

作为优选方案之一，所述交联剂与丙烯酸类单体分子的摩尔比为1:100～1:1000。

进一步优选地，所述交联剂与丙烯酸类单体分子的摩尔比为1:180～1:800。

作为优选方案之一，所述的交联剂选自多异氰酸酯类、异氰酸酯类、多元胺类、多元醇类、缩水甘油醚类、有机硅类、苯磺酸类、有机过氧化物、金属有机物、氮丙啶类、碳化二亚胺类或烯类单体中的任意一种或多种。

作为优选方案之一，所述的交联剂进一步选自N,N-亚甲基双丙烯酰胺、二乙烯基苯、二异氰酸酯、四异氰酸酯、过氧化二异丙苯、过氧化苯甲酰、二叔丁基过氧化物、过氧化氢二异丙苯、2,5-二甲基-2,5-二叔丁基过氧化己烷、2-乙基-4-甲基咪唑、2-苯基咪唑、2-异丙基咪唑、四氢邻苯二甲酸酐、六氢邻苯二甲酸酐、三亚乙基四胺、二甲胺基丙胺、二乙胺基丙胺、聚乙二醇、聚丙二醇、三羟甲基丙烷、三羟甲基乙烷或聚丙二醇缩水甘油醚种的一种或多种。

作为优选方案之一，所述步骤包括：

(1)将微球本体置于容器中，加水，搅拌下超声，然后采用碱溶液处理，得到微球A；

(2)将微球A洗涤后，加入硅烷偶联剂，得到微球B

(3)将微球B反应体系中加入引发剂，继续反应，得到微球C；

(4)向反应容器中引发剂、交联剂、溶剂、丙烯酸单体分子和微球C，密封装置反应，之后加入碱液停止反应，得到微球D；

(5)将微球D置于第一缓冲溶液中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺进行活化，加入配体化合物进行反应，之后加入金属盐反应，最终得到生物微球E。

作为优选方案之一，所述步骤(1)和(4)中的碱液既包括氢氧化物的水溶液，也包括本领域常见的碱性物质的水溶液，如但不限于碳酸盐、碳酸氢盐、铵盐等的水溶液。

作为优选方案之一，碱液选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠或碳酸氢钾的水溶液、或氨水中的这一种或多种。

作为优选方案之一，所述的步骤(3)加入引发剂后，进一步加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺。

作为优选方案之一，所述的步骤(3)的体系中任选地进入第一缓冲溶液。

作为优选方案之一，所述步骤(4)中引发剂与丙烯酸类单体分子的质量比为0.1％～1％。

作为优选方案之一，所述步骤(4)中引发剂与丙烯酸类单体分子的质量比为0.1％～0.5％。

作为优选方案之一，所述丙烯酸类单体分子与步骤(4)中的溶剂的质量比为1％～10％。

作为优选方案之一，所述丙烯酸类单体分子与步骤(4)中的溶剂的质量比为3％～8％。

作为优选方案之一，所述步骤4)中的溶剂选自水；更优选为去离子水。

作为优选方案之一，所述交联剂与丙烯酸类单体分子的摩尔比为1:100～1:1000。

进一步优选地，所述交联剂与丙烯酸类单体分子的摩尔比为1:180～1:800。

作为优选方案之一，所述第一缓冲溶液为磺酸类缓冲溶液。

作为优选方案之一，所述第一缓冲溶液中包含2-吗啉乙磺酸(MES)。

作为优选方案之一，步骤(5)中的配体化合物任选地溶于第二缓冲液中。

作为优选方案之一，所述第二缓冲液中含有磷酸二氢盐和磷酸氢二盐。

作为优选方案之一，所述第二缓冲液中含有NaH

作为优选方案之一，所述第二缓冲液中还包含NaCl。

作为优选方案之一，所述步骤(5)加入金属盐之后，任选地对体系的pH值进行调整。优选地，调整后的pH值为6.8～7.8。

作为优选方案之一，所述微球本体的粒径尺寸选自如下范围：1μm～10000μm；所述粒径尺寸为平均值。

作为优选方案之一，所述微球本体的直径选自10μm～8000μm；

作为优选方案之一，所述微球本体的直径选自50μm～5000μm；

作为优选方案之一，所述生物微球本体的直径选自100μm～1000μm。

3.本发明第三方面提供了由本发明第二方面的制备方法制备得到的生物微球。

4.本发明第四方面提供了本发明第一方面和第三方面提供的生物微球在无细胞蛋白合成、蛋白分离纯化、免疫分析、目标抗体药物富集、靶向给药、核酸分离提取、细胞分选、酶固定、基因载体构建、以及无细胞蛋白合成体系和试剂盒中的应用。

本发明的主要优点和积极效果包括：

(1)制备的生物微球特异性好，能高效地将目标蛋白从混合体系中捕获到微球上，实现高载量结合目标蛋白；

(2)制备的生物微球基质无孔，可降低目标蛋白的滞留时间，实现目标蛋白的高效洗脱；

(3)制备的生物微球粒度均匀，刚性好，可增强耐压能力；

(4)制备的生物微球物理和化学稳定性好，可再生重复使用多次；

(5)制备生物微球的工艺易放大，适用于大规模工业化生产的蛋白质分离纯化。

下面结合附图和实施例对本申请的技术方案进一步说明。

附图说明

图1是对实施例1制备得到的生物微球进行效果验证时，通过对洗涤和洗脱时收集的样品取样进行电泳，得到SDS-PAGE电泳结果。EGFP分子量为30kDa，可在洗脱液中收集得到目的条带。

具体实施方式

下面结合具体实施方式和实施例，进一步阐述本发明，请一并参阅附图。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先按照、参考上文所述的具体实施方式指引的条件，然后可按照常规条件，例如“Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)”、《无细胞蛋白合成实验手册》“Edited by Alexander S.Spirin and JamesR.Swartz.Cell-free protein synthesis:methods and protocols[M].2008”等文献中所述的实验条件，或按照制造厂商所建议的条件。

除非另外说明，否则本发明中提及的百分比和份数是重量百分比和重量份数。

如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。

本申请中的温度单位如无特殊说明，均为摄氏度(℃)。

名词和术语

以下是针对本发明所采用的部分相关“名词”、“术语”的含义进行的解释或说明，以便于更好地理解本发明。相应的解释或说明适用于本发明的全文，既适用于下文，也适用于上文。本发明中涉及引用文献时，相关术语、名词、短语在引用文献中的定义也一并被引用，但是，与本发明中的定义相冲突时，以本发明中的定义为准。在引用文献中的定义与本发明中的定义发生冲突时，并不影响所引用的成分、物质、组合物、材料、体系、配方、种类、方法、设备等以引用文献中确定的内容为准。

聚合物，本发明中广义地包括寡聚物和高聚物，至少具有三个结构单元或者分子量至少为500Da(所述分子量可以采用适合的表征方式，比如数均分子量、重均分子量、粘均分子量等)。

丙烯酸类单体分子：可用于合成丙烯酸类聚合物的单体分子，具有C(COO-)＝C的基本结构，举例如，CH(COOH)＝CH

固定、固定于、固定有、固定在等“固定”方式，指共价的结合方式。

带有、连接有、连接于、连接在、结合、捕捉、捕获到等“连接”/“结合”方式，没有特别限定，包括但不限于共价方式、非共价方式等方式。

共价方式：以共价键直接键合的方式。所述共价方式中包括但不限于动态共价方式，所述动态共价方式指以动态共价键直接键合的方式。

共价键：包括酰胺键、酯键等常见的共价键，还包括具有可逆性质的动态共价键。

所述共价键中包括动态共价键。动态共价键是一种具有可逆性质的化学键，包括但不限于亚胺键、酰腙键、二硫键或者其组合。化学领域的技术人员可以理解其含义。

纯化底物，也称为目标物，待从混合体系中分离出来的物质。本发明中的纯化底物没有特别限制，但优选纯化底物为蛋白类物质(此时也称为目标蛋白)。

“改性”产物，包括但不限于本发明的衍生物、经修饰的产物、基因改造产物、融合产物等，可以保持原有的功能或性能，也可以优化、改变其功能或性能。

洗脱液(以目标蛋白为例)：洗脱目标蛋白；经洗脱后，目标蛋白存在于洗脱液中。

洗涤液(以目标蛋白为例)：洗脱杂蛋白等杂质；经洗脱后，杂蛋白被洗涤液带走。

结合力：结合能力，如生物微球与某一蛋白的结合能力。

亲和作用力：使用不同浓度梯度的底物溶液，当生物微球只结合50％底物时的底物浓度。

IVTT：In vitro transcription and translation，体外转录与翻译系统，即为无细胞蛋白合成体系。无细胞蛋白合成体系是以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的合成。本发明的无细胞蛋白合成体系无特别限制，可以是基于酵母细胞提取物、大肠杆菌细胞提取物、哺乳动物细胞提取物、植物细胞提取物、昆虫细胞提取物的无细胞蛋白合成体系的任一种或任意组合。

本发明中，“翻译相关酶”，translation-related enzymes(TRENs)，指从核酸模板到蛋白质产物合成过程中所需的酶物质，不局限于翻译过程需要的酶。

核酸模板：也称为遗传模板，指作为蛋白合成模板的核酸序列，包括DNA模板、mRNA模板及其组合。

流穿液：生物微球与含目标蛋白的体系进行孵育后所收集的清液，其中含有未被生物微球捕获的残余的目标蛋白。

RFU，相对荧光单位值(Relative Fluorescence Unit)。

eGFP：增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein)。本发明中，所述eGFP广义地包括野生型及其变体，包括但不限于野生型及其突变体。

mEGFP：eGFP的A206K突变体。

“可选地”，表示可以有，也可以无，以能够实现本发明的技术方案的为选择标准。

本发明中，“可选方式”，表示只要适用于本发明的技术方案，就可以用来实施本发明。

本发明中，“优选”、“较佳”、“更优选”、“更佳”、“最优选”等优选实施方式，不构成对发明的涵盖范围及保护范围的任何意义上的限制，并非用于限定本发明的范围和实施方式，仅用于提供一些实施方式作为举例。

本发明的描述中，对于“优选之一”、“优选方式之一”、“优选实施方式之一”、“优选例之一”、“优选例”、“在一优选的实施方式中”、“一些优选例中”、“一些优选方式中”、“优选为”、“优选”、“优选地”、“更优选”、“更优地”、“进一步优选”、“最优选”等优选方式，以及“实施方式之一”、“方式之一”、“示例”、“具体示例”、“举例如”、“作为举例”、“例如”、“比如”、“如”等示意的列举方式，同样不构成对发明的涵盖范围及保护范围的任何意义上的限制，且各方式所描述的具体特征包含于本发明的至少一个具体实施方式中。本发明中，各方式

所描述的具体特征可以在任何的一个或者多个具体实施方式中以合适的方式结合。本发明中，各优选方式对应的技术特征或技术方案也可以通过任意合适的方式结合。

本发明中，“其任意组合”，在数量上表示“大于1”，在涵盖范围上表示以下情形构成的组：“任选其中一个，或者任选其中至少两个构成的组”。

本发明中，“一个或多个”、“一种或多种”等“一或多”的描述，与“至少一个”、“至少一种”、“其组合”、“或其组合”、“及其组合”、“或其任意组合”、“及其任意组合”等具有相同含义，可以互换使用，表示数量上等于“1”或“大于1”。

本发明中，采用“或/和”、“和/或”表示“任选其一或者任选其组合”，也表示至少其一。

本发明所述的“通常”、“常规”、“一般”、“经常”、“往往”等方式描述的现有技术手段，也都被引用作为本发明内容的参考，如无特别说明，可视为本发明的部分技术特征的优选方式之一，且需要注意的是，不构成对发明的涵盖范围及保护范围的任何意义上的限制。

在本发明提及的所有文献及这些文献直接引用或者间接引用的文献，都在本申请中被引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

应理解，在本发明范围内，本发明的上述各技术特征和在下文(包括但不限于实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，只要能够用于实施本发明的即可。限于篇幅，不再一一累述。

1.纯化底物(优选为蛋白类物质)

本发明的纯化底物指本发明的磁性微球用来捕捉分离的物质，没有特别限制，只要所述纯化底物能够与本发明的生物微球的纯化介质(如本发明经修饰的生物微球末端的金属螯合物部分)特异性地相结合即可。

所述纯化底物为蛋白类物质时，纯化底物也称为目标蛋白。

2.目标蛋白中的纯化标签

所述目标蛋白中可以不携带纯化标签，此时，目标蛋白本身应当能够被生物微球中的纯化介质所捕获。

一些优选方式中，所述目标蛋白带有纯化标签，所述纯化标签能够与所述纯化介质特异性地相结合。一个目标蛋白分子中，所述纯化标签的数量为一个、两个或更多个；当含有两个或两个以上纯化标签时，所述纯化标签的种类为一种、两种或者更多种。需要说明的是，只要标签的氨基酸序列不同，就视为不同种类的标签。

所述目标蛋白中的纯化标签可以选自包括但不限于以下标签的组：组氨酸标签、亲和素、亲和素类似物、Streg标签(包含WSHPQFEK序列或其变体的标签)、包含WRHPQFGG序列或其变体的标签、包含RKAAVSHW序列或其变体的标签、FLAG标签或其变体、C标签及其变体、Spot标签及其变体、GST标签及其变体、MBP标签及其变体、SUMO标签及其变体、CBP标签及其变体、HA标签及其变体、Avi标签及其变体、亲和蛋白、抗体类标签、抗原类标签、及其组合。所述纯化标签可以通过N-端或C-端融合。

所述组氨酸标签一般含有至少5个组氨酸残基，比如5×His标签、6×His标签、8×His标签等。

八肽WRHPQFGG可以特异性结合核心链霉亲和素(core streptavidin)。

Streg标签，可以与亲和素或其类似物形成特异性结合作用，所述Streg标签中包含WSHPQFEK或其变体。举例如，

WSHPQFEK-(XaaYaaWaaZaa)n-WSHPQFEK，其中Xaa、Yaa、Waa、Zaa各自独立地为任一种氨基酸，XaaYaaWaaZaa至少包括一个氨基酸且(XaaYaaWaaZaa)n至少包括4个氨基酸，其中n选自1～15(比如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15)；(XaaYaaWaaZaa)n的具体举例(G)8,(G)12,GAGA,(GAGA)2,(GAGA)3,(GGGS)2、(GGGS)3。

Streg标签举例如WSHPQFEK、WSHPQFEK-(GGGS)n-WSHPQFEK、WSHPQFEK-GGGSGGGSGGSA-WSHPQFEK、

SA-WSHPQFEK-(GGGS)2GGSA-WSHPQFEK、

WSHPQFEK-GSGGG-WSHPQFEK-GL-WSHPQFEK、GGSAWNHPQFEK-GGGSGSGGSA-WSHPQFEK-GS、GGGS-WSHPQFEK-GGGSGGGSGGSA-WSHPQFEK等。

所述FLAG标签的序列为DYKDDDDK。FLAG标签的变体序列举例如DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK。

所述Spot标签的序列为PDRVRAVSHWSS。

所述C标签中包含EPEA序列。

所述GST标签指谷胱甘肽S-转移酶标签。

所述MBP标签指麦芽糖结合蛋白标签。

所述SUMO标签，是一种已知的小分子泛素样修饰蛋白(Small ubiq uitin-likemodifier)，是泛素(ubiquitin)类多肽链超家族的重要成员之一。在一级结构上，SUMO与泛素只有18％的同源性，然而两者的三级结构及其生物学功能却十分相似。

所述CBP标签的序列为KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL。

所述HA标签的序列为YPYDVPDYA。

所述Avi标签，是一种已知的由15个氨基酸残基组成的小标签，该小标签可以被脱硫生物素连接酶BirA特异性识别。

抗体类标签，包括但不限于抗体的完整结构(完整抗体)、结构域、亚基、片段、重链、轻链、单链片段(如纳米抗体，缺失轻链的重链，重链可变区、互补决定区等)，等。

抗原类标签，包括但不限于抗原的完整结构(完整抗原)、结构域、亚基、片段、重链、轻链、单链片段(如抗原决定基等)，等。

一些优选方式中，所述目标蛋白的N端或C端连接一个纯化标签，或者在两端均连接有纯化标签。

本部分所述的各种纯化标签，均可以作为本发明的生物微球中的纯化介质的候选。

3.目标蛋白的类型

所述目标蛋白可以为天然蛋白或其改造产物，也可以为人工合成序列。所述天然蛋白的来源没有特别限制，包括但不限于：真核细胞、原核细胞、病原体；其中真核细胞来源包括但不限于：哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、线虫细胞、及其组合；所述哺乳动物细胞来源可以包括但不限于鼠源(包括大鼠、小鼠、豚鼠、金地鼠、仓鼠等)、兔源、猴源、人源、猪源、羊源、牛源、狗源、马源等。所述病原体包括病毒、衣原体、支原体等。所述病毒包括HPV、HBV、TMV、冠状病毒、轮状病毒等。

所述目标蛋白的类型包括但不限于多肽(本发明中“目标蛋白”广义地包括多肽)、荧光类蛋白、酶及相应的酶原、抗体、抗原、免疫球蛋白、激素、胶原、聚氨基酸、疫苗等，前述任一种蛋白的部分结构域，前述任一种蛋白的亚基或片段，以及前述任一种蛋白的变体。所述“前述任一种蛋白的亚基或片段”包括“前述任一种蛋白的部分结构域”的亚基或片段。所述“前述任一种蛋白的变体”包括“前述任一种蛋白的部分结构域、前述任一种蛋白的亚基或片段”的变体。所述“前述任一种蛋白的变体”包括但不限于前述任一种蛋白的突变体。本发明中，其它位置的连续两个或两个以上“前述”的情形，含义做类似解释。

所述目标蛋白的结构，既可以为完整结构，也可以选自相应的部分结构域、亚基、片段、二聚体、多聚体、融合蛋白、糖蛋白等。不完整的抗体结构的举例如，纳米抗体(缺失轻链的重链抗体，VHH，保留了重链抗体完整的抗原结合能力)、重链可变区、互补决定区(CDR)等。

例如，本发明所述体外蛋白合成体系可合成的目标蛋白，可以选自包括但不限于以下任一种蛋白、任意组合方式的融合蛋白、任意组合方式的组合物：荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强绿色荧光蛋白(eGFP)、黄色荧光蛋白(YFP)、氨酰tRNA合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶(Catalase，举例如鼠过氧化氢酶)、肌动蛋白、抗体、抗体的可变区域(如抗体的单链可变区域，scFV)、抗体的单链及其片段(如抗体的重链、纳米抗体、抗体的轻链)、α-淀粉酶、肠道菌素A、丙型肝炎病毒E2糖蛋白、胰岛素及其前体、胰高血糖素样肽(GLP-1)、干扰素(包括但不限于干扰素α，如干扰素αA、干扰素β、干扰素γ等)、白介素(如白细胞介素-1β、白介素2、白介素12，等)、溶菌酶素、血清白蛋白(包括但不限于人血清白蛋白、牛血清白蛋白)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,LacZ，举例如大肠杆菌β-半乳糖苷酶)，等，前述任一种蛋白的部分结构域，前述任一种蛋白的亚基或片段，或前述任一种的变体(如前述定义，所述变体包括突变体，举例如萤光素酶突变体、eGFP的突变体，所述变体还可以是同源体)。所述氨酰tRNA合成酶，举例如人赖氨酸-tRNA合成酶(lysine-tRNA synthetase)、人亮氨酸-tRNA合成酶(leucine-tRNA synthetase)等。所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶，举例如拟南芥甘油醛3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。还可参考专利文献CN109423496A。所述任意组合方式的组合物，可以包括前述任一种蛋白，也可以包括前述任意组合方式的融合蛋白。

一些优选方式中，采用GFP、eGFP、mScarlet等之一，或其类似物质、或其突变体等具有荧光性质的目标蛋白对所述体外蛋白合成体系的蛋白合成能力进行评估。

所述目标蛋白的应用领域包括但不限于生物医药、分子生物、医学、体外检测、医疗诊断、再生医学、生物工程、组织工程、干细胞工程、基因工程、聚合物工程、表面工程、纳米工程、化妆品、食品、食品添加剂、营养剂、农业、饲料、生活用品、洗涤、环境、化学染色、荧光标记等领域。

4.含有目标蛋白的混合体系

本发明的生物微球可用于将目标蛋白从其混合体系中分离出来。所述目标蛋白不限于一种物质，允许是多种物质的组合，只要纯化的目的是为了获得这种组合物，或者这种组合物的形式可以满足纯化需求。

含有目标蛋白的混合体系没有特别限制，只要本发明的生物微球的纯化介质能够与目标蛋白特异性结合即可；通常地，还需要所述纯化介质与混合体系中目标蛋白以外的其他物质不存在特异性结合或非特异性结合作用。

本发明的实施例中，所述含有目标蛋白的混合体系可以为天然来源，也可以为人工构建或得到的混合体系。

比如，可以从市售血清中分离纯化特定蛋白。

比如，可以从体外蛋白合成体系(In vitro protein synthesis system)的反应后的体系中分离目标蛋白。

所述体外蛋白合成体系的具体实施方式之一，还包括但不限于，例如WO2016005982A1所记载的基于大肠杆菌的无细胞蛋白合成体系。本发明的其它引用文献、其直接及间接引用文献中所记载的包括但不限于基于麦胚细胞、兔网织红细胞、酿酒酵母、毕赤酵母、马克斯克鲁维酵母的体外无细胞蛋白合成体系，也均作为本发明的体外蛋白合成体系的实施方式纳入本发明。举例如，文献“L u,Y.Advances in Cell-FreeBiosynthetic Technology.Current Developments in Biotechnology and

Bioengineering,2019,Chapter 2,23-45”中包括但不限于“2.1Systems andAdvantages”部分第27-28页所引用文献中记载的体外无细胞蛋白合成体系(In vitrocell-free protein synthesis system)，均可作为实施本发明的体外蛋白合成体系。举例如(除非和本发明相冲突，否则，下述文献及其引用文献以全部内容、全部目的被引用)，文献CN106978349A、CN108535489A、CN108690139A、CN108949801A、CN108642076A、CN109022478A、CN109423496A、CN109423497A、CN10942350 9A、CN109837293A、CN109971783A、CN109988801A、CN109971775A、CN1100 93284A、CN110408635A、CN110408636A、CN110551745 A、CN110551700A、CN110551785A、CN110819647A、CN110845622、CN110938649A、CN110964736A、CN111378706A、CN111378707A、CN111378708A、CN111718419A、CN111748569A、CN2019107298813、CN2019112066163、CN2018112862093、CN2019114181518、CN2020100693833、CN2020101796894、CN202010269333X、CN2020102693382、CN2020113574616及其引用文献中记载的体外无细胞蛋白合成体系、DNA模板的构建和扩增方法，均可作为实施本发明的体外蛋白合成体系、本发明的DNA模板的构建和扩增方法。

所述体外蛋白合成体系的细胞提取物的来源细胞没有特别限制，只要能够体外表达所述目标蛋白即可。现有技术已公开的适用原核细胞提取物、真核细胞提取物(可以优选酵母细胞提取物，还可以更优先乳酸克鲁维酵母)来源的体外蛋白合成体系的外源蛋白，或者适用于细胞内合成的原核细胞体系、真核细胞体系(可以优选为酵母细胞体系，还可以更优选为乳酸克鲁维酵母体系)的内源蛋白，也均可以采用本发明的体外蛋白合成体系进行合成，或者尝试用本发明提供的体外蛋白合成体系进行合成。

所述体外蛋白合成体系的优选方式之一为IVTT体系。进行IVTT反应后的液体(记为IVTT反应液)，除了含有所表达的目标的蛋白外，还含有IVTT体系中残余反应原料，特别含有来自细胞提取物的各种因子(比如核糖体、tRNA、翻译相关酶、起始因子、延伸因子、终止因子等)。所述IVTT反应液，一方面能够提供用于与生物微球结合的目标蛋白，另一方面还可以提供用于检验目标蛋白分离效果的混合体系。

5.具体实施方式

实施例1：

将60ml玻璃微球(平均粒径为100μm)置于烧杯中，加水200ml，搅拌下超声30min，再用去离子水清洗3次，在反应釜搅拌下投入微球，加入2mol/L的NaOH溶液250ml，70℃下反应2h，得到微球A。

将微球A用乙醇抽滤洗涤3次，在390ml乙醇溶剂中加入微球A和KH550(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)30ml，50℃下搅拌反应48h，再升温至70℃，反应2h，得到微球B。

在40ml X-buffer(由0.1M 2-吗啉乙磺酸和0.5M NaCl配制而成)中依次投料4,4'-偶氮双(氰基戊酸)(V501)1.09g、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)7.48g、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)5.92g和微球B，于0℃下搅拌反应24h，得到微球C。

向反应釜中依次加入V501 76mg和交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBAM)338mg、去离子水70ml、丙烯酸(AA)30ml和微球C，密封装置，抽换氮气3次，氮气鼓泡30min，在N

将微球D置于X-buffer溶液中，依次加入EDC 9.59g和NHS 11.51g，于室温下活化30min，再用去离子水快速洗涤3次；将螯合配体N,N-双羧甲基-L-赖氨酸(NTA)4.44g溶解于Y-buffer(由34.2ml 1M的NaH

实施例2：

将75ml玻璃微球(平均粒径为200μm)置于烧杯中，加水250ml，搅拌下超声30min，再用去离子水清洗3次，在反应釜搅拌下投入微球，加入2mol/L的NaOH溶液300ml，70℃下反应2h，得到微球A。

将微球A用乙醇抽滤洗涤3次，在400ml乙醇溶剂中加入微球A和KH550(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)35ml，50℃下搅拌反应48h，再升温至70℃，反应2h，得到微球B。

在45ml X-buffer(由0.1M 2-吗啉乙磺酸和0.5M NaCl配制而成)中依次投料4,4'-偶氮双(氰基戊酸)(V501)1.3g、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)8.9g、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)7.1g和微球B，于0℃下搅拌反应24h，得到微球C。

向反应釜中依次加入V501 95mg和交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBAM)405mg、去离子水85ml、丙烯酸(AA)36ml和微球C，密封装置，抽换氮气3次，氮气鼓泡30min，在N

将微球D置于X-buffer溶液中，依次加入EDC 11.5g和NHS 13.8g，于室温下活化30min，再用去离子水快速洗涤3次；将螯合配体N,N-双羧甲基-L-赖氨酸(NTA)5.33g溶解于Y-buffer(由34.2ml 1M的NaH

实施例3：

将80ml玻璃微球(平均粒径为300μm)置于烧杯中，加水250ml，搅拌下超声30min，再用去离子水清洗3次，在反应釜搅拌下投入微球，加入2mol/L的NaOH溶液325ml，70℃下反应2h，得到微球A。

将微球A用乙醇抽滤洗涤3次，在500ml乙醇溶剂中加入微球A和KH550(3-氨基丙基三乙氧基硅烷)40ml，50℃下搅拌反应48h，再升温至70℃，反应2.5h，得到微球B。

在50ml X-buffer(由0.1M 2-吗啉乙磺酸和0.5M NaCl配制而成)中依次投料4,4'-偶氮双(氰基戊酸)(V501)1.42g、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)9.72g、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)7.7g和微球B，于0℃下搅拌反应24h，得到微球C。

向反应釜中依次加入V501 100mg和交联剂N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBAM)440mg、去离子水90ml、丙烯酸(AA)40ml和微球C，密封装置，抽换氮气3次，氮气鼓泡30min，在N

将微球D置于X-buffer溶液中，依次加入EDC12.5g和NHS 15g，于室温下活化40min，再用去离子水快速洗涤3次；将螯合配体N,N-双羧甲基-L-赖氨酸(NTA)5.77g溶解于Y-buffer(由34.2ml 1M的NaH

实施例4：

体外无细胞蛋白合成方法中使用的体外蛋白合成体系(IVTT体系)包括以下组分(终浓度)：9.78mM的pH8.0三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)，80mM醋酸钾，5mM醋酸镁，1.8mM核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的浓度均为1.8mM)，0.7mM的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，每种氨基酸各自浓度均为0.1mM)，15mM葡萄糖，320mM麦芽糊精(以葡萄糖单元计量摩尔浓度，对应约52mg/mL)，24mM磷酸三钾，2％聚乙二醇8000，最后加入50％体积的细胞提取物(具体为酵母细胞提取物，更具体地为乳酸克鲁维酵母细胞提取物)。

其中，所述乳酸克鲁维酵母提取物中包括内源性表达的T7 RNA聚合酶。所述乳酸克鲁维酵母提取物经过以下方式改造：采用基于乳酸克鲁维酵母菌株ATCC8585的改造菌株；采用CN109423496A所记载的方法，将T7 RNA聚合酶的编码基因整合到乳酸克鲁维酵母的基因组中，获得改造菌株，使其可以内源性表达T7 RNA聚合酶；以改造菌株培养出细胞原料，然后制备细胞提取物。乳酸克鲁维酵母细胞提取物的制备过程采用常规技术手段，参考CN109593656A记载的方法制备。制备步骤概括而言，包括：提供经发酵培养的乳酸克鲁维酵母细胞的适量原料，用液氮将细胞速冻，将细胞打碎，离心收集上清液，即可得到细胞提取物。所得乳酸克鲁维酵母细胞提取物中的蛋白浓度为20～40mg/mL。

IVTT反应：向上述体外蛋白合成体系中加入15ng/μL DNA模板(所编码的蛋白中含有荧光标记)，进行体外蛋白质合成反应。合成所述DNA模板编码的蛋白，得到含有所述蛋白的IVTT反应液。采用紫外吸收法测量RFU值，结合其浓度与RFU值的标准曲线，可计算所述蛋白的含量。

实施例5：

将实施例1制备得到生物微球E装柱，进行性能测试。

(1)制备8L的EGFP的IVTT反应液1，在30度反应3小时后，收集反应液。15000g离心20min后取上清，得到7.7L的上清液1，测量其EGFP的荧光值记为Total1。

制备8L的EGFP的IVTT反应液2，在30度反应3小时后，收集反应液。15000g离心20min后取上清，得到7.4L的上清液2，测量其EGFP的荧光值记为Total2。

制备2L的EGFP的IVTT反应液2，在30度反应3小时后，收集反应液。15000g离心20min后取上清，得到1.8L的上清液3，测量其EGFP的荧光值记为Total3。

用2L washing buffer平衡纯化柱(washing buffer成分：50mM Tris-Cl pH8.0，500mM NaCl)

上样IVTT上清液1，收集流穿液，测量其EGFP的荧光值记为FT mix 1。而后继续上样上清液2，收集流穿液，测量其EGFP的荧光值记为FT mix2。而后继续上样上清液3，收集流穿液，测量其EGFP的荧光值记为FT mix3。

上样结束后，用1L的washing buffer进行洗涤，收集洗涤液，测量其EGFP的荧光值记为W。

最后用1.5L的elution buffer洗脱，收集洗脱液，测量其EGFP的荧光值记为E。

根据RFU值，换算出对应的蛋白浓度，并计算出蛋白量、载量等相关数据。如下表格所示：

表1

注1：载量1(％)＝E目的蛋白总质量g/Total目的蛋白总质量g*100％

注2：载量1(mg/ml)＝E目的蛋白总质量g*1000/柱体积ml

注3：载量2(％)＝(Total目的蛋白总质量g-FT mix目的蛋白总质量g)/Total目的蛋白总质量g*100％

注4：载量2(mg/ml)＝(Total目的蛋白总质量g-FT mix目的蛋白总质量g)*1000/柱体积ml*100％

洗涤和洗脱时收集的样品取样进行电泳，得到SDS-PAGE电泳结果，如图1所示。EGFP分子量为30kDa，可在洗脱液中收集得到目的条带。

由表1可知，采用本发明制备得到的生物微球能高效地将目标蛋白从混合体系中进行捕获，目标蛋白的载量可以达到16.7mg/ml，实现高载量结合目标蛋白的目的。

以上述依据本申请的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项申请技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项申请的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。