产生单鼠李糖脂的方法

技术领域

本发明涉及产生单鼠李糖脂的方法，特别是适用于洗涤剂组合物领域的单鼠李糖脂，特别是用于清洁家庭和个人护理领域中的物品的洗涤剂组合物，特别是洗衣洗涤剂和手洗餐具洗涤剂。

背景技术

本发明涉及产生单鼠李糖脂的方法。

鼠李糖脂是含羧酸的阴离子表面活性剂，其由通过β羟基连接至鼠李糖的一个或多个烷基链组成。它们可以由各种细菌物种产生。鼠李糖脂作为天然绿色表面活性剂是理想的，提供可持续性益处以及应用效益，例如良好的发泡特性、对皮肤的温和性以及优异的感官益处。

富含二鼠李糖脂的混合物可以由发酵方法产生，例如EP2787065A1和EP2786743A1中公开的。与单鼠李糖脂相比，二鼠李糖脂更容易通过发酵获得。单鼠李糖脂是洗涤剂组合物领域中特别有用的材料，因为与二鼠李糖脂相比，它们产生改善的清洁，参见，例如EP2596087A1。

获得更高单鼠李糖脂产率的一种途径是工程化宿主菌株发酵，但这对于产生单鼠李糖脂是一种昂贵且复杂的途径。

已经尝试使用固定的柚苷酶将二鼠李糖脂酶促转化成单鼠李糖脂(Margario etal,Biocatalysis and Biotransformation,July-August 2009；27(4):237-245)。然而，仍然需要改进。

因此，需要产生一种更简单且经济的途径以得到更高的单鼠李糖脂产率。

该问题可通过本文所述的本发明的方法来克服。

发明内容

本发明涉及将二鼠李糖脂转化为单鼠李糖脂的方法，其中该方法包括以下方法步骤：

(a)使起始二鼠李糖脂材料与固定在载体上的α-L-鼠李糖苷酶接触；

(b)使产生的单鼠李糖脂与反应介质和/或副产物分离；

其中所述α-L-鼠李糖苷酶不具有β-D-葡萄糖苷酶活性。

优选地，在产生单鼠李糖脂的方法中，α-L-鼠李糖苷酶来自曲霉属(Aspergillus)，优选来自黑曲霉(Aspergillus niger)、土曲霉(Aspergillus terreus)或迟缓曲霉(Aspergillus lentulus)，最优选来自黑曲霉、土曲霉。

优选地，在产生单鼠李糖脂的方法中，使用选自吸附、共价键合、包埋和/或交联的技术将酶固定在载体上。

优选地，起始二鼠李糖脂材料具有C

优选地，所得的单鼠李糖脂材料具有C

优选地，鼠李糖副产物随着反应的进行从酶促反应混合物中除去。

优选地，在产生单鼠李糖脂的方法中，反应过程中的温度为10至60℃，优选15至50℃，更优选18至45℃，最优选20至45℃。

优选地，在产生单鼠李糖脂的方法中，反应过程中的pH为pH 5至10，优选pH 5至9，更优选pH 5.5至8.5，最优选pH 6至8。

通过使用具有α-L-鼠李糖苷酶活性而没有β-D-葡萄糖苷酶活性的α-L-鼠李糖苷酶，可以将二鼠李糖脂起始材料选择性地转化为单鼠李糖脂材料。使用具有α-L-鼠李糖苷酶活性而没有β-D-葡萄糖苷酶活性的α-L-鼠李糖苷酶的方法的选择性特性通过选择性地去除一个鼠李糖部分得到所需的单鼠李糖脂物质，与完全不转化二鼠李糖脂材料或去除两个鼠李糖单元的其他酶相反，这两者都不能得到所需的单鼠李糖脂材料。

附图说明

图1显示了在鼠李糖苷酶活性测定中，由α-L-鼠李糖苷酶释放的对硝基苯酚的量可以通过在405nm处的比色测量获得。

图2显示了二鼠李糖脂(RL2)样品的RP-HPLC色谱图的比较：(a)未处理，(b)用源自土曲霉(A.terreus)的鼠李糖苷酶处理，(c)用源自黑曲霉(A.niger)的鼠李糖苷酶处理，以及(d)用商业柚苷酶处理。

图3显示了使用对硝基苯基-α-l-吡喃鼠李糖苷(pNPR)底物对土曲霉α-L-鼠李糖苷酶(Unilever)和黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶(Megazyme)的活性测定。这些酶促进pNPR水解成游离鼠李糖分子和4-硝基苯酚(pNP)。pNP的浓度随着时间通过分光光度法监测。由于该酶的较高活性，使用来自土曲霉的较低浓度的α-L-鼠李糖苷酶来监测动力学。底物以100μM使用。

图4显示了在T0时在向反应混合物中添加或不添加鼠李糖的情况下，对于土曲霉α-L-鼠李糖苷酶(Unilever)的基于对硝基苯基-α-l-吡喃鼠李糖苷(pNPR)的活性测定。活性表示为405nm处相对吸光度随时间的变化。每30秒测量吸光度。底物以100μM使用。

图5显示了分别使用对硝基苯基-α-l-吡喃鼠李糖苷(pNPR)和对硝基苯基-β-l-吡喃葡萄糖苷(pNPG)分析来自土曲霉的酶中α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性。活性表示为405nm处相对吸光度随时间的变化。

具体实施方式

除非另有说明，本文使用的不定冠词“一(a)”或“一个(an)”及其相应的定冠词“该(the)”是指至少一个，或者一个或多个。

wt.％涉及基于组合物总重量以成分的重量计的量。对于阴离子表面活性剂，wt.％基于表面活性剂的质子化形式计算。

鼠李糖脂

鼠李糖脂是生物表面活性剂。这些是一类糖脂。它们由与β-羟基脂肪酸结合的鼠李糖构建。鼠李糖是一种糖。脂肪酸在动物和植物中普遍存在。

E.Deziel等人在Applied Microbiology and Biotechnology(2010)86:1323-1336中讨论了鼠李糖脂。鼠李糖脂由Evonik、Stepan、Glycosurf、AGAE Technologies和Urumqi Unite Bio-Technology Co.,Ltd.生产。鼠李糖脂可由铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)菌株产生。鼠李糖脂有两大类：单鼠李糖脂和二鼠李糖脂。

单鼠李糖脂具有单一鼠李糖糖环。由铜绿假单胞菌产生的典型单鼠李糖脂是L-鼠李糖基-β-羟基癸酰基-β-羟基癸酸酯(RhaC

IUPAC名称为3-[3-[(2R,3R,4R,5R,6S)-3,4,5-三羟基-6-甲基氧杂环己烷-2-基]氧基癸酰氧基]癸酸。

二鼠李糖脂具有两个鼠李糖糖环。典型的二鼠李糖脂是L-鼠李糖基-L-鼠李糖基-β-羟基癸酰基-β-羟基癸酸酯(Rha2C

IUPAC名称为3-[3-[4,5-二羟基-6-甲基-3-(3,4,5-三羟基-6-甲基氧杂环己烷-2-基)氧基氧杂环己烷-2-基]氧基癸酰氧基]癸酸。

实际上，根据碳源和细菌菌株，具有不同烷基链长度组合的多种其他次要组分与上述更常见的鼠李糖脂组合存在。

在整个本专利说明书中，我们使用术语单鼠李糖脂和二鼠李糖脂以避免可能的混淆。然而，如果使用缩写，则R1为单鼠李糖脂且R2为二鼠李糖脂。

合适的二鼠李糖脂起始材料

优选地，鼠李糖脂是下式的二鼠李糖脂：Rha2C

已经检测到由以下细菌产生的以下鼠李糖脂：(C12:1、C14:1表示具有双键的脂肪酰基链):

由铜绿假单胞菌产生的鼠李糖脂(二鼠李糖脂)：

Rha-Rha-C8-C10、Rha-Rha-C8-C12:1、Rha-Rha-C10-C8、Rha-Rha-C10-C10、Rha-Rha-C10-C12:1、Rha-Rha-C-10-C-12、Rha-Rha-C-12-C-10、Rha-Rha-C-12:1-C-12、Rha-Rha-C-10-C14:1。

由类鼻疽伯克氏菌(Burkholderia pseudomallei)产生的鼠李糖脂(二鼠李糖脂)：

Rha-Rha-C14-C14。

由植物伯克氏菌(假单胞菌)(Burkholderia(Pseudomonas)plantarii)产生的鼠李糖脂(二鼠李糖脂)：

Rha-Rha-C14-C14。

典型的二鼠李糖脂是L-鼠李糖基-L-鼠李糖基-β-羟基癸酰基-β-羟基癸酸酯(具有式C

优选地，起始二鼠李糖脂材料具有C

优选的单鼠李糖脂产物

优选地，所得单鼠李糖脂是下式的单鼠李糖脂：RhaC

优选的单鼠李糖脂材料是L-鼠李糖基-β-羟基癸酰基-β-羟基癸酸酯(具有式C

优选地，所得单鼠李糖脂材料具有C

α-L-鼠李糖苷酶

通过使用具有α-L-鼠李糖苷酶活性而没有β-D-葡萄糖苷酶活性的α-L-鼠李糖苷酶，可以将二鼠李糖脂起始材料选择性地转化为单鼠李糖脂材料。使用具有α-L-鼠李糖苷酶活性而没有β-D-葡萄糖苷酶活性的α-L-鼠李糖苷酶的方法的这种选择性特性通过选择性地去除一个鼠李糖部分得到所需的单鼠李糖脂物质，与完全不转化二鼠李糖脂物质或者去除两个鼠李糖单元的其他酶相反，这两者都不产生所需的单鼠李糖脂材料。

α-L-鼠李糖苷酶优选来自曲霉属。

优选地，α-L-鼠李糖苷酶来自黑曲霉、土曲霉或迟缓曲霉。最优选α-L-鼠李糖苷酶来自黑曲霉或土曲霉。

在本发明的方法中，酶可以适当地固定。

方法详述

本发明涉及将二鼠李糖脂转化为单鼠李糖脂的方法，包括以下方法步骤：

(a)使起始二鼠李糖脂材料与固定在载体上的α-L-鼠李糖苷酶接触；

(b)使产生的单鼠李糖脂与反应介质和/或副产物分离；

其中α-L-鼠李糖苷酶不具有β-D-葡萄糖苷酶活性。

优选地，鼠李糖副产物随着反应的进行从酶促反应混合物中除去。这可以导致单鼠李糖脂产物的更高转化率和/或产率。

优选地，在产生单鼠李糖脂的方法中，反应过程中的温度为10至60℃，优选15至50℃，更优选18至45℃，最优选20至45℃。

优选地，在产生单鼠李糖脂的方法中，反应过程中的pH为pH 5至10，优选pH 5至9，更优选pH 5.5至8.5，最优选pH 6至8。

酶的固定

α-L-鼠李糖苷酶可以潜在地被固定化以改善如活性、选择性和特异性以及酶稳定性的特性。固定本身可通过酶和基质之间的物理相互作用或通过化学过程(例如酶和载体之间的共价键形成)来进行。典型的实验室过程可包括但不限于吸附、共价键合、包埋和交联。M.Javed et al.在Materials Research Foundations(2019)44:1-28中以及R.Wahabet al.在Reactive and Function Polymers(2020)152:104613中更详细地描述了这些方法。

优选地，在产生单鼠李糖脂的方法中，使用选自吸附、共价键合、包埋和/或交联的技术将酶固定在载体上。

优选的商业酶固定材料包括可从Purolite获得的Praesto

将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。

实施例

实验方法和材料

酶和化学品

本研究考虑了三种具有α-L-鼠李糖苷酶活性的酶变体：

(i)来自黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶从Megazyme LTD(Bray,Ireland)获得，

(ii)按照Weignerova et al.2012(43)描述的生物合成方法，内部制备为自土曲霉的重组α-L-鼠李糖苷酶，以及

(iii)柚苷酶(外部来源的样品，来源和起源未知)。

来自黑曲霉的Megazyme酶以0.02％(w/v)叠氮化钠中的硫酸铵悬浮液提供。巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)分泌的土曲霉鼠李糖苷酶在1.7mg/mL的总蛋白浓度下以上清液形式提供，且使用含有500mM咪唑的50mM磷酸钠洗脱缓冲液，Sigma Aldrich(Gillingham,United Kingdom)，pH 6.5在镍柱上纯化用于分析的样品，并针对不含咪唑的相同缓冲液透析。

本研究中使用的鼠李糖脂样品以50％(w/v)水溶液的形式获自Evonik(Witten,Germany)。该样品是由各种鼠李糖脂同源物(congener)组成的共混物，具有主要同源物，(Rha-Rha-C10-C10)，2-O-α-L-鼠李糖基-α-L-鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸，且其在下文中称为RL2。该样品还含有少量鼠李糖基-3-羟基癸酰基-3-羟基癸酸酯同源物(Rha-C10:0/C10:0)，其在下文中称为RL1。RL1的预期分子量为504.321g*mol

除非以下方法中另有说明，所有其他化学品均获自Sigma Aldrich(Gillingham,United Kingdom)。

用于鼠李糖脂分析的HPLC-CAD仪器和方法参数

RL2样品在乙腈中稀释至0.75mM的终浓度，用0.45μm硝酸纤维素注射器式过滤器过滤，并施加到柱上用于分析。以每级分30秒的速率收集级分，并进行MALDI-TOF分析。接下来，RL2被用作来自土曲霉和黑曲霉的酶以及柚苷酶的底物。

对于每个反应，酶以1.2mg*mL

鼠李糖脂分析采用Dionex UltiMate 3000系统(Thermo Scientific,Dreieich,Germany)进行，该系统由RS双梯度泵、RS自动进样器、RS柱室、RS二极管阵列检测器和Corona Veo SD带电气溶胶检测器(CAD)组成。这种类型的检测器中的响应与每单位时间到达检测器的分析物的质量成比例，且其以皮安(pA)表示。

使用Accucore

通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDITOF MS)的RL分析

MALDI-TOF用于分析如上所述收集的RL2级分。基质溶液是溶于含有0.1％三氟乙酸(TFA)的50％乙腈水溶液中的2,5-二羟基苯甲酸。在Eppendorf管中混合1μL HPLC分级级分、1μL基质溶液和2μL蒸馏水。将1μL基质-样品混合物点样到不锈钢锚芯片上。将斑点在室温下风干，然后使用与智能光束激光系统操作的UltraflexIII MALDI-TOF/TOF质谱仪(Bruker,Billerica,MA)通过MALDI TOF MS进行分析。

鼠李糖脂MS谱在正模式反射器中获得；RLs检测的所用参数为：离子源1，25.08kV以及离子源2，21.72kV；反射器，26.42kV以及13.867kV；透镜，9.28kV。采用以下考虑因素将LIFT模式应用于MS/MS分析：离子源1，8.01kV以及离子源2，7.21kV；反射器，29.50kV以及2，13.91kV；透镜，3.61kV；LIFT 1，19.08kV以及LIFT 2，2.71kV。测量的所用质量范围为m/z300-4000Da，和最大MS偏差为0.5Da。累积4000次激光照射，增量为200次照射，以代表最终的质谱。使用肽校准标准II(Bruker Daltonics)进行外部MS校准，使用FlexControl V.3.4软件进行系统控制，其中FlexAnalysis V.3.4和BioTools V.3.2软件用于数据处理。

鼠李糖苷酶活性评估

使用对硝基苯基-α-l-吡喃鼠李糖苷(pNPR)通过比色法测定来自土曲霉的酶和来自黑曲霉的酶的α-l-鼠李糖苷酶活性(参见图1所示的化学式方程)。首先将pNPR底物溶解在DMSO中，在100mM磷酸钠缓冲液pH 6.5中将浓度调节至200μM。在100mM磷酸钠缓冲液pH6.5中将酶稀释至20μg/mL浓度。通过将底物溶液与酶溶液以1:1的比率混合来制备反应。活性测定在Thermo Scientific(Waltham,MA USA)的96孔Microtiter UV板上进行。所有反应均在pH 6.5和温度40℃下进行。在微板阅读仪

pH和温度对鼠李糖苷酶活性的影响

仅对来自土曲霉的α-l-鼠李糖苷酶进行分析。使用与上述相同的比色法研究温度变化和pH变化对酶活性的影响(参见图1)。首先将pNPR底物溶解在DMSO中，在选择的缓冲液中将浓度调节至200μM。在选择的缓冲液中将酶稀释至20μg/mL的浓度。通过将底物溶液与酶溶液以1:1的比率混合来制备反应。活性测定在Thermo Scientific(Waltham,MA USA)的96孔Microtiter UV板上进行。为了分析pH对酶活性的影响，反应在40℃下进行，并且选择的缓冲液是：100mM磷酸钠缓冲液pH 6.5，100mM Tris-HCl缓冲液pH 7.5，100mM Tris-HCl缓冲液pH 8.5，以及100mM碳酸钠缓冲液pH 10.5。为了分析温度对酶活性的影响，反应在20℃和40℃下在pH 6.5的100mM磷酸钠缓冲液中进行。在微板阅读仪

鼠李糖过量对鼠李糖苷酶活性的影响

仅对来自土曲霉的α-l-鼠李糖苷酶进行分析。使用与上述相同的比色法研究鼠李糖过量对酶活性的影响(参见图1)。首先将pNPR底物溶解在DMSO中，在100mM磷酸钠缓冲液pH 6.5中将浓度调节至300μM。在100mM磷酸钠缓冲液pH 6.5中将酶稀释至30μg/mL的浓度。在100mM磷酸钠缓冲液pH 6.5中制备以下鼠李糖浓度序列：0.6mM、1.2mM、1.8mM、2.4mM、3mM。通过以1:1:1的比率加入底物溶液、酶溶液和鼠李糖溶液来制备240μL的总反应混合物。活性测定是在Thermo Scientific(Waltham,MA USA)的96孔Microtiter UV板上进行的。所有反应均在pH 6.5和温度40℃下进行。在微板阅读仪

β-D-葡萄糖苷酶活性评估

使用对硝基苯基-β-l-吡喃葡萄糖苷(pNPG)通过比色法测定来自土曲霉的酶的β-D-葡萄糖苷酶活性。首先将pNPG底物溶解在DMSO中，并在100mM磷酸钠缓冲液pH 6.5中将浓度调节至200μM。为了分析底物偏好，将pNPG与pNPR以1:1的比率混合，然后溶解在DMSO中，并在100mM磷酸钠缓冲液pH 6.5中将这种混合物的浓度调节至200μM。作为对照，使用如上制备的浓度为200μM的pNPR。在100mM磷酸钠缓冲液pH 6.5中将酶稀释至20μg/mL的浓度。通过将底物溶液与酶溶液以1:1的比率混合来制备反应。活性测定是在Thermo Scientific(Waltham,MA USA)的96孔Microtiter UV板上进行的。所有反应均在pH 6.5和温度40℃下进行。在微板阅读仪

实施例1-酶促处理的二鼠李糖脂的RP-HPLC分析

我们使用土曲霉α-L-鼠李糖苷酶、黑曲霉α-L-鼠李糖苷酶和柚苷酶评估α-L-鼠李糖苷酶利用鼠李糖脂作为底物的能力。

将底物样品与所研究的酶以1mg/mL的浓度混合，并在40℃，pH 6.5下进行反应24小时。对于对照，R2样品仅与缓冲液混合。接下来，使用RP-HPLC分析反应，并且对照另外使用MAL-TOF分析，以确认哪个峰对应于R1和R2同源物。

在图2中，在保留时间1至2分钟之间检测到的峰对应于空白。在保留时间6.5分钟处检测的峰对应于样品的二鼠李糖脂级分，且在保留时间8.2分钟处检测的峰对应于更疏水性的单鼠李糖脂级分。收集级分，并通过MALDI-TOF分析其分子量。

对照样品的色谱图在保留时间6.5min和保留时间8.2min处呈现两个峰(参见图2，A)。MALDI-TOF分析表明6.5分钟之后洗脱的物质的MW与R2的估计MW相对应，且8.2分钟之后洗脱的物质的MW与R1的估计MW相对应(数据未包括)。酶促处理24小时后样品的分析显示每个反应的色谱图的变化。

用来自土曲霉的酶处理的样品的色谱图显示仅检测到R1峰(参见图2，B)。在用来自黑曲霉的酶处理的样品中，在色谱图中检测到R2和R1峰两者，但与对照相比，R2峰要小得多(参见图2，C)。在通过柚苷酶处理的样品中，没有检测到这些峰(参见图2，D)。这表明柚苷酶具有α-l-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶活性，并从鼠李糖脂分子中完全切除鼠李糖。由于柚苷酶的这种特性，该酶不能用于产生单鼠李糖脂，并且不对其进行进一步评估。

实施例2-不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的活性

针对p-NPR测量来自土曲霉的α-L-鼠李糖苷酶和来自黑曲霉的α-L-鼠李糖苷酶的相对活性。在40℃和pH 6.5下随时间监测反应(参见图3)。酶导致产物4-硝基苯酚的释放。两种酶显示出不同的动力学行为，其中土曲霉的酶的作用更快，但10分钟后以70％的底物转化达到平台期。黑曲霉的酶在30分钟后转化相似量的底物，然而，之后转化不达到平台，并且在60min后该酶比土曲霉转化多10％的底物，其中动力学曲线表明，随着更长的反应时间，底物可以完全转化。R2的70％转化率完全足以用于测试目的，因此具有较快动力学的酶用于进一步分析。

实施例3-鼠李糖对鼠李糖苷酶活性的影响

使用pNPR底物在反应混合物中的过量鼠李糖下测量来自土曲霉的α-L-鼠李糖苷酶的相对活性。进行分析以研究产物抑制现象。对具有各种不同鼠李糖浓度的反应中酶活性的监测表明，随着鼠李糖添加量的增加，反应中底物转化率降低(参见图4)。该结果表明，在反应时间期间产生的鼠李糖可能引起酶抑制，进而阻碍底物的完全转化，使得从反应介质选择性除去鼠李糖将能够改善向所需单鼠李糖脂材料的转化。

实施例4-β-D-葡萄糖苷酶活性评估

使用pNPG作为底物来监测来自土曲霉的酶的β-D-葡萄糖苷酶活性，pNPR用作底物显示α-l-吡喃鼠李糖苷活性，并且两种底物的混合物用于确定底物偏好(参见图5)。分析表明，来自土曲霉的酶仅识别pNPR作为底物。未检测到与pNPG的反应的吸光度信号，并且对于pNPR底物观察到的反应动力学不受混合底物的反应中pNPG存在的影响。该结果表明来自土曲霉的酶不具有β-D-葡萄糖苷酶活性。