一种自动化核酸适配体筛选系统

技术领域

本发明涉及核酸适配体筛选技术领域，具体地说是一种自动化核酸适配体筛选系统。

背景技术

核酸适配体是利用 SELEX 技术从体外筛选获得，进行筛选之前，首先要构建一个随机寡核苷酸库，其中寡核苷酸链长为 20～40nt，容量为 1014～1015 条寡核苷酸链，其所包括的各种不同立体结构，一般可与自然界内所具有的所有类别的靶标相结合，接着筛选过程主要包括：（1）结合：将靶标与寡核苷酸库一起孵育设定时间之后，寡核苷酸链与靶标相结合；（2）分离：通过离心、过滤等方法将没有结合或结合不稳定的寡核苷酸链洗脱，并将寡核苷酸链从靶标上分开；（3）扩增：将从靶标上分开得到的寡核苷酸链利用 PCR技术扩增，生成次级文库，再进行下一轮次的核酸适配体筛选。按以上步骤进行迭代，经过几轮或十几轮的筛选之后，利用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪和QPCR仪来查看当前筛选进程，若完成则通过测序获得该靶细胞的核酸适配体。荧光显微镜和激光共聚焦显微镜用于定性观察单链核酸与靶细胞或对照细胞结合情况，而流式细胞仪和QPCR则可对核酸进行定量。相比于流式细胞仪，QPCR方法操作较为简单、成本更低，且筛选过程中本身也需要对单链核酸进行扩增，所以QPCR方法更适合自动化集成。

Hung 等用高效的芯片cell-SELEX 技术筛选获得了 13 种卵巢癌细胞(Ovariancancer) 的高特异性核酸适配体，其中 3 种核酸适配体的Kd值分别达到1.8nmol/L、8.3nmol/L和1.3nmol/L，这种筛选系统将来可能用于靶向治疗和检测。

集成式工作站筛选方法是将细胞核酸适配体筛选所涉及的各模块和仪器放置在工作平台上，通过机械手和多通道移液器来实现筛选过程中试剂和耗材的转移，各模块配合完成文库变性、细胞清洗、孵育、洗脱和 PCR 扩增等步骤，具有灵活、高效等优点。在集成式工作站中，每个模块和仪器的操作都可进行控制，通过组合方式可实现连续多轮的细胞核酸适配体筛选，自动化程度很高。不过由于工作站在自动化筛选过程中，无法避免核酸气溶胶污染问题，筛选结果可能出现假阳性结果，所以目前应用受到一定限制。

现行的核酸适配体筛选方法还存在着各种问题：（1）筛选系统中靶细胞的数量不足，导致潜在的核酸适配体在筛选中被遗漏，所以最终得到的核酸适配体不是最优；（2）筛选方法未作防污染措施，导致核酸逸出，产生交叉污染，影响筛选结果；（3）单链核酸与靶细胞分离效果不理想，潜在的核酸适配体可能丢失；（4）筛选进程监测与筛选实验分离在不同装置或仪器中进行，增加了操作的难度和交叉污染的风险。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种自动化核酸适配体筛选系统。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种自动化核酸适配体筛选系统，其特征在于：该筛选系统包括密闭的核酸适配体筛选仪，在核酸适配体筛选仪内腔中的功能模块上布置有筛选卡盒，密封的筛选卡盒内的筛选工位上集成有核酸适配体筛选过程所需的物品和试剂，在筛选工位的上方设有配置移液枪的移液机构，该移液机构与筛选卡盒外的枪头转动电机相连接且移液枪的气路能够通过医用硅胶管连通控制气源，筛选工位中的细胞培养皿工位上安置有通过振荡接口与筛选卡盒外的振荡电机相连接的细胞培养皿适配模块；所述的功能模块上集成有能够实现筛选卡盒所需要的不同温度环境的温控模块、分离单链DNA的磁分离模块、扩增DNA并检测核酸量的PCR与荧光检测模块。

所述的筛选工位沿筛选卡盒的内腔底面周向分布，筛选工位包括细胞培养皿工位、清洗液工位、磁珠工位、核酸富集工位、文库工位、扩增与检测工位、结合液工位、扩增试剂工位、胰酶工位和废液工位，细胞培养皿工位、清洗液工位、磁珠工位、核酸富集工位、文库工位、扩增与检测工位、结合液工位、扩增试剂工位、胰酶工位和废液工位依次设置或者按照使用者的需求设置。

所述的移液机构包括旋转轴和移液枪，旋转轴的顶部设有卡盒气路接口且旋转轴的底部通过连板与移液枪的顶部相连接、使得移液枪的枪头能够与筛选工位对应，在旋转轴和连板内皆设有连通移液枪的气路；所述旋转轴的顶部伸出筛选卡盒的内腔与枪头转动电机相连接，且枪头转动电机通过旋转轴带动移液枪旋转。

旋转轴的顶部一个连接方式为：十字槽连接，即在旋转轴的顶部设有连接枪头转动电机输出端的十字槽；且该十字槽的中心开孔作为卡盒气路接口。

所述的筛选卡盒包括卡盒封闭外壳，卡盒封闭外壳的内腔顶部设有套在旋转轴上的竖向定位仓，在竖向定位仓内设有套在旋转轴上的竖向定位弹簧，竖向定位弹簧的上端固定在旋转轴上、且下端能够抵在竖向定位仓的底面上，以限定旋转轴相对卡盒封闭外壳的升降高度。

所述的功能模块上设有放置筛选卡盒的卡槽功能底座；所述的温控模块通过TEC器件来实现筛选卡盒所需要的不同温度环境。

所述的核酸适配体筛选仪内腔中布置有驱动模组，驱动模组包括模组升降电机、升降安装台和升降联轴器，模组升降电机的驱动端通过升降联轴器与升降安装台的顶部连接；在升降安装台的悬臂上安装有枪头转动电机，枪头转动电机驱动端上设置的十字接头能够嵌入移液机构中的旋转轴顶部的十字槽中、使得枪头转动电机能够带动旋转轴转动。

所述升降安装台的下方设有振荡电机，振荡电机固定设置在工作仓内，且设置在振荡电机驱动端的振荡接头能够插入振荡接口中。

所述升降安装台的悬臂上设置有外部气路接口，外部气路接口通过医用硅胶管连通移液机构上的卡盒气路接口。

所述的核酸适配体筛选仪内设有卡盒转移模块，卡盒转移模块用于将核酸适配体筛选仪内的筛选卡盒转移至功能模块中的卡槽功能底座上，使得移液机构能够与枪头转动电机的驱动端相连接且移液机构的移液枪的气路能够通过医用硅胶管连通控制气源、使得振荡接口能够与振荡电机的振荡接头相连接。

所述的卡盒转移模块包括卡盒转动电机、转动联轴器、转动轴和卡盒固定钳，卡盒转动电机的驱动端通过联轴器与转动轴的上端相连接，转动轴使得周侧均匀分布有多个卡盒固定钳，卡盒固定钳能够夹紧筛选卡盒，卡盒转动电机带动卡盒固定钳转动、将筛选卡盒转动至设定位置；所述的顶部升降电机能够驱动卡盒转动电机、转动联轴器、转动轴和卡盒固定钳整体升降。

本发明中的核酸适配体筛选方案流程如下：通过将已变性淬火的初始DNA /RNA文库与阴性细胞孵育，去掉与其结合的核酸序列，利用磁珠纯化未结合的核酸序列；然后将文库与靶细胞孵育，通过施加适当筛选压力洗涤次数，保留与靶细胞结合的核酸序列，利用胰酶将细胞消化之后，通过磁珠富集核酸；最后利用PCR技术扩增与靶细胞结合的核酸序列，并通过实时荧光定量方法来检测富集的核酸量，将其与前一轮筛选得到的核酸量进行比较，若具有明显差异，则继续循环筛选过程，若无明显变化，则靶细胞的核酸筛选完成，通过测序得到适配体序列。

本发明相比现有技术有如下优点：

本发明的自动化核酸适配体筛选系统将核酸适配体筛选过程中所需要的物质统一存放在密封的筛选卡盒内、所需要的培养功能和转移功能亦集成在密封的筛选卡盒内，其余的震荡功能、温控功能、磁分离功能、PCR与荧光检测功能放置于筛选卡盒外的工作仓内；在所构建的密封卡盒内集成细胞培养皿、移液和产物转移结构，通过预置细胞样本和筛选试剂自动完成从文库处理、靶标清洗、孵育、富集、扩增到荧光定量检测的一体化过程，利用荧光定量方法来分析通过磁富集获得的单链核酸量作为反馈信号来监测整体筛选进程，解决现行方法中存在的核酸与靶标分离效果差、筛选进程监测操作难度大和核酸逸出产生的气溶胶污染问题，保证筛选的效率和质量，最终获取到真正具有特异性的核酸适配体，并可切实应用到相应的研究领域中，为相关疾病的诊治提供了重要的手段。

附图说明

附图1为本发明的自动化核酸适配体筛选系统的结构原理图；

附图2为本发明的筛选卡盒的结构原理图；

附图3为本发明的驱动模组和移液机构组合结构示意图。

其中：1—移液机构；11—旋转轴；12—卡盒气路接口；13—竖向定位弹簧；14—移液枪；15—竖向定位仓；2—卡盒封闭外壳；3—细胞培养皿适配模块；31—振荡接口；4—筛选工位；40—细胞培养皿工位；41—清洗液工位；42—磁珠工位；43—核酸富集工位；44—文库工位；45—扩增与检测工位；46—结合液工位；47—扩增试剂工位；48—胰酶工位；49—废液工位；5—驱动模组；51—模组升降电机；52—枪头转动电机；53—外部气路接口；54—升降安装台；55—十字接头；56—振荡电机；57—振荡接头；58—升降联轴器；6—功能模块；61—卡槽功能底座；7—卡盒转移模块；71—卡盒转动电机；72—转动联轴器；73—转动轴；74—卡盒固定钳；75—顶部升降电机；8—核酸适配体筛选仪；81—工作仓；9—筛选卡盒。

具体实施方式

下面结合附图与实施例对本发明作进一步的说明。

如图1-3所示：一种自动化核酸适配体筛选系统，该筛选系统包括密闭的核酸适配体筛选仪8，在核酸适配体筛选仪8内腔中的功能模块6上布置有筛选卡盒9，密封的筛选卡盒9内的筛选工位4上集成有核酸适配体筛选过程所需的物品和试剂，筛选工位4包括细胞培养皿工位40、清洗液工位41、磁珠工位42、核酸富集工位43、文库工位44、扩增与检测工位45、结合液工位46、扩增试剂工位47、胰酶工位48和废液工位49；在筛选工位4的上方设有配置移液枪14的移液机构1，该移液机构1与筛选卡盒9外的枪头转动电机52相连接且移液枪14的气路能够通过医用硅胶管连通控制气源，筛选工位4中的细胞培养皿工位10上安置有通过振荡接口31与筛选卡盒9外的振荡电机56相连接的细胞培养皿适配模块3；在功能模块6上设有放置筛选卡盒9的卡槽功能底座61，在功能模块6上集成有能够实现筛选卡盒9所需要的不同温度环境的温控模块、分离单链DNA的磁分离模块、扩增DNA并检测核酸量的PCR与荧光检测模块，将筛选卡盒9放置在卡槽功能底座61上，功能模块6能够对筛选工位4中的相应工位提供温控功能、磁分离功能、PCR与荧光检测功能。

如图1-3所示，移液机构1由移液枪14、控制移液枪14旋转定位与垂直定位的旋转轴11和用于控制移液枪14的枪尖吸取与排放液体的气路等组成。具体的说，移液机构1包括旋转轴11和移液枪14，旋转轴11的顶部设有卡盒气路接口12且旋转轴11的底部通过连板与移液枪14的顶部相连接、使得移液枪14的枪头能够与筛选工位4对应，在旋转轴11和连板内皆设有连通移液枪14的气路；该旋转轴11的顶部伸出筛选卡盒9的内腔与枪头转动电机52相连接，且枪头转动电机52通过旋转轴11带动移液枪14旋转；如旋转轴的顶部一个连接方式为：十字槽连接，即在旋转轴11的顶部设有连接枪头转动电机52输出端的十字槽；且该十字槽的中心开孔作为卡盒气路接口12。

进一步的说，为了提高旋转轴11上下升降时的密封性，在该筛选卡盒9的卡盒封闭外壳2的内腔顶部设有套在旋转轴11上的竖向定位仓15，在竖向定位仓15内设有套在旋转轴11上的竖向定位弹簧13，竖向定位弹簧13的上端固定在旋转轴11上、且下端能够抵在竖向定位仓15的底面上，以限定旋转轴11相对卡盒封闭外壳2的升降高度。

如图1、图3所示，在核酸适配体筛选仪8的工作仓81内布置有驱动模组5，驱动模组5包括模组升降电机51、升降安装台54和升降联轴器58，模组升降电机51的驱动端通过升降联轴器58与升降安装台54的顶部连接；在升降安装台54的悬臂上安装有枪头转动电机52，枪头转动电机52驱动端上设置的十字接头55能够嵌入移液机构1中的旋转轴11顶部的十字槽中、使得枪头转动电机52能够带动旋转轴11转动，且升降安装台54的悬臂上设置有外部气路接口53，外部气路接口53通过医用硅胶管连通移液机构1上的卡盒气路接口12；筛选卡盒9放置在卡槽功能底座61上后，外部气路接口53与卡盒气路接口12自动进行结合，并保证连接处密封良好。另外在升降安装台54的下方设有振荡电机56，振荡电机56固定设置在工作仓81内，且设置在振荡电机56驱动端的振荡接头57能够插入振荡接口31中。

如图1所示，在核酸适配体筛选仪8内设有卡盒转移模块7，卡盒转移模块7用于将核酸适配体筛选仪8内的筛选卡盒9转移至功能模块6中的卡槽功能底座61上，使得移液机构1能够与枪头转动电机52的驱动端相连接且移液机构1的移液枪14的气路能够通过医用硅胶管连通控制气源、使得振荡接口31能够与振荡电机56的振荡接头57相连接。进一步的说，卡盒转移模块7包括卡盒转动电机71、转动联轴器72、转动轴73、卡盒固定钳74和顶部升降电机75，卡盒转动电机71的驱动端通过联轴器72与转动轴73的上端相连接，转动轴73使得周侧均匀分布有多个具有弹性的卡盒固定钳74，卡盒固定钳74能够夹紧筛选卡盒9，当使用筛选卡盒时9时，卡盒转动电机71带动卡盒固定钳74转动、将筛选卡盒9转动至设定位置，然后顶部升降电机75驱动下方结构整体下降至卡槽功能底座61上方，驱动模组5下压筛选卡盒9，顶部升降电机75驱动下方结构整体上升，使筛选卡盒9脱离卡盒固定钳74。当筛选卡盒9使用完成后，顶部升降电机75驱动下方结构整体下降至工位，卡盒固定钳74下降夹住筛选卡盒9；接着顶部升降电机75驱动下方结构整体上升，卡盒转动电机71带动卡盒固定钳74转动、将本轮使用的筛选卡盒9转动至其他位置，同时下一轮筛选卡盒9到达卡槽功能底座61上方。

如图2所示，细胞培养皿工位40、清洗液工位41、磁珠工位42、核酸富集工位43、文库工位44、扩增与检测工位45、结合液工位46、扩增试剂工位47、胰酶工位48、废液工位49中包括八个固定工位、两个可分离工位，两个可分离工位是细胞培养皿工位40和文库工位44，细胞培养皿工位40和文库工位44上的试剂槽是活动式的、可与筛选卡盒9分离，实际使用时也可根据需要进行灵活组合配置。

如图1-3所示，本发明的自动化核酸适配体筛选系统主要由核酸适配体筛选仪8和多个分离式的、密封的筛选卡盒9两部分组成，在核酸适配体筛选仪8的工作仓81内布置有多个筛选卡盒9，使得该核酸适配体筛选仪8一次可连续实现多轮核酸适配体筛选。核酸适配体筛选仪8由驱动模组5、功能模块6和卡盒转移模块7组成。驱动模组5主要包括模组升降电机51、用于驱动移液机构1运动的枪头转动电机52、外部气路接口53、升降安装台54、十字接头55、振荡电机56、能够插入振荡接口31的振荡接头57和升降联轴器58。功能模块6主要包括卡槽功能底座61，用于完成筛选工位4的相应工位上的试剂加工。卡盒转移模块7主要由卡盒转动电机71、转动联轴器72、转动轴73、卡盒固定钳74和顶部升降电机75组成，用于转动筛选卡盒9。筛选卡盒9包括移液机构1、卡盒封闭外壳2、细胞培养皿适配模块3、筛选工位4。核酸适配体筛选仪8中最多放六个筛选卡盒9，移液机构1主要包括旋转轴11、卡盒气路接口12、竖向定位弹簧13、移液枪14。移液机构1控制卡盒内移液枪14的旋转和竖直运动，外部气路接口53采用医用硅胶管与卡盒气路接口12接合，连通筛选卡盒9内的移液枪14的枪尖；卡盒封闭外壳2保证筛选卡盒9内操作的封闭性，避免外界干扰；细胞培养皿适配模块3主要包括振荡接口31；筛选工位4主要包括包括细胞培养皿工位40、清洗液工位41、磁珠工位42、核酸富集工位43、文库工位44、扩增与检测工位45、结合液工位46、扩增试剂工位47、胰酶工位48和废液工位49。本发明的筛选系统用于细胞、蛋白、病原体、小分子和离子等核酸适配体的快速、高质筛选。

使用时，打开装置电源后，实验人员将本次实验所需筛选卡盒9按照顺序依次放入核酸适配体筛选仪8的工作仓81内。实验开始后，利用功能模块6中的加热模块，将文库工位44上的文库变性；变性结束后，利用功能模块6的冰浴功能，将变性后的文库进行冰浴；接着模组升降电机51工作，外部气路接口53由升降安装台54驱动插入卡盒气路接口12，同时十字接头55与旋转轴11顶端的十字槽接合；旋转轴11驱动移液枪14，逆时针旋转至磁珠工位42，模组升降电机51驱动升降安装台54向下运动，进而压迫移液枪14垂直向下运动，吸取磁珠工位42处的所需磁珠，将磁珠转移至结合液工位46处的结合液中（以下移液操作同上）；接着将处理后的文库转移至结合液工位46处的磁珠与结合液构成的混合液中,将该混合液转移至细胞培养皿工位40处的细胞培养皿中；振荡电机56驱动振荡接头57插入振荡接口31，带动细胞培养皿左右转动，细胞与文库充分接触，孵育30min；待孵育结束，将清洗液工位42处的清洗液转移至细胞培养皿中，清洗去除未与细胞结合的单链DNA；将清洗废液转移至废液工位49处的废液皿中；将胰酶工位48处的胰酶转移至细胞培养皿中，将细胞从细胞培养皿上消化下来，转移至核酸富集工位43；利用功能模块6中的磁分离功能将核酸富集工位43处的单链DNA从细胞表面分离出来；将分离出来的单链DNA转移至扩增试剂工位47处的扩增试剂中；待扩增结束，将扩增试剂转移至扩增与检测工位45，利用功能模块6中的PCR与荧光检测模块，扩增DNA并检测，获得本轮筛选结果，将扩增产物转移至文库工位44处保存。顶部升降电机75驱动卡盒固定钳74下降并将筛选卡盒9固定、然后顶部升降电机75驱动卡盒固定钳74上升抬起用过的筛选卡盒9，卡盒转动电机71驱动转动轴73旋转，将下一个筛选卡盒9旋转至工作位置。重复上述步骤，直至本次筛选卡盒9用尽，最后打开仪器右面拉门，取出废弃筛选卡盒9，放入专门垃圾箱内。。

本发明的自动化核酸适配体筛选系统的温控模块通过TEC器件来实现筛选卡盒9所需要的不同温度环境，TEC器件需控制电流的方向即可在同一片 TEC 实现快速制热或制冷效果，结构简单，控制方便，非常适合在小型温度模块中使用。

本发明的自动化核酸适配体筛选系统采用的各电机优选28 系列两相混合步进电机，有较好的速度调节性能和良好的运行稳定性；进一步的，适配于 28 混合式步进电机的轴套式增量式编码器，安装在步进电机输出轴的尾部，精确反馈步进电机运行的角度和圈数。

本发明的自动化核酸适配体筛选系统提出并构建了一种适用于细胞、蛋白、离子和小分子特异性核酸适配体筛选的基于纳米磁珠的核酸富集与以实时荧光定量结果为反馈的高质筛选方法，其中建立了一种以封闭的分离式筛选卡盒为载体的自动化筛选模型，能够在短时间实现从文库处理、孵育、富集到扩增和进程监测一体化，可解决核酸气溶胶污染问题，提高筛选效率和筛选质量，具有使用方便、成本低、集成度高和易于扩展的特点；以正常细胞和恶性肿瘤各细胞亚型作对照细胞，通过该系统的筛选可得到每种细胞亚型的高特异性和亲和力核酸适配体，可用于肿瘤的准确分型和其他方面的研究。同样，本系统也可将核酸适配体用于其他靶标如外泌体、金属离子等识别，这也是本系统所采用的方法学的核心竞争优势。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。