一种胞外分泌量和分泌速度增强的淀粉分支酶突变体

技术领域

本发明涉及一种胞外分泌量和分泌速度增强的淀粉分支酶突变体，属于基因工程和酶工程技术领域。

背景技术

淀粉分支酶(1，4-α-glucan branching enzyme，GBE)是一类葡萄糖基转移酶，以葡聚糖分子为底物，同时具备“水解”、“转移”、“合成”三个功能。根据氨基酸序列的相似性，淀粉分支酶又被归类为糖苷水解酶(Glycoside hydrolases，GHs)。GBE可以通过水解淀粉中的α-1,4-糖苷键，并将具有非还原末端的糖链以α-1,6-糖苷键的形式连接至受体链上，形成新的α-1,6-分支点，增加淀粉的分支度，提高淀粉的抗消化性和慢消化性。由于GBE这种独特的提高淀粉分支度的特性，可以用来制备高支化淀粉及淀粉衍生物，具有极大的工业应用前景。

淀粉分支酶一般来源于植物，动物和微生物中。植物来源的淀粉分支酶最为常见，但其在改性淀粉过程中涉及多种同工酶的协同催化，较为复杂，因此不适合工业化生产；动物来源的淀粉分支酶在发酵生产过程中异源表达相对困难。相比而言，微生物来源的淀粉分支酶最适反应温度较高、特异性强、分支化度大、催化方式简单，且易于基因操作，因而在工业化生产中有较大优势。微生物中淀粉分支酶一般来源于细菌(如蓝藻细菌、嗜热球菌、大肠杆菌)以及真菌(酿酒酵母、构巢曲霉)。

一般自然菌株产生分支酶能力较低，需要对产酶条件进行优化，才能到达较高的产酶水平。酶的工业化应用往往受限于酶的低表达量及复杂的酶分离过程等因素。近年来，国内外许多研究通过基因工程技术实现了淀粉分支酶的异源表达，显著提高了淀粉分支酶的表达量。然而，大多数的报道都是以大肠杆菌作为宿主，而大肠杆菌及易形成包涵体，分离较为困难。同时，大肠杆菌本身含有的内毒素严重限制了淀粉分支酶在食品领域的应用。

因此，将具有良好应用前景的淀粉分支酶安全地进行表达，并探索一种更具有针对性的高效表达策略，是如今值得探索的方向。通过基因工程和酶工程等手段实现淀粉分支酶的高效表达和分离，并将其应用于食品领域，对于淀粉分支酶的工业化应用具有重要的意义。

发明内容

为了解决现有技术中存在的淀粉分支酶的胞外分泌能力差等问题，本发明通过对来源于热葡萄糖苷地杆菌Geobacillus thermoglucosidans STB02编码的淀粉分支酶进行截断突变得到。

本发明提供了一种胞外表达量和分泌速度显著提高的突变体ΔNloop，在72h的胞外酶活提高17.29％，同时胞外分泌速度得到极大提升，进一步促进了淀粉分支酶在食品级枯草芽孢杆菌表达系统中的高效表达。

本发明提供了一种淀粉分支酶突变体ΔNloop，所述淀粉分支酶突变体是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的前6位的氨基酸截断突变得到的。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体ΔNloop的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体ΔNloop的核苷酸序列如SEQIDNO.4所示。

在本发明的一种实施方式中，所示淀粉分支酶亲本酶为来源于热葡萄糖苷地杆菌Geobacillus thermoglucosidans STB02，编码所述淀粉分支酶亲本酶的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

本发明还提供了一种编码上述淀粉分支酶突变体ΔNloop的基因。

本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。

在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是pP43NMK为表达载体。

本发明还提供了一种携带上述基因，或上述重组载体的重组细胞。

在本发明的一种实施方式中，以细菌或真菌为宿主细胞。

在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为宿主细胞。

本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌以枯草芽孢杆菌或大肠杆菌为宿主，表达了上述淀粉分支酶突变体ΔNloop。

在本发明的一种实施方式中，以Bacillus subtilis WB600为宿主。

在本发明的一种实施方式中，以pP43NMK为表达载体。

本发明还提供了一种提高淀粉分支酶胞外分泌量和分泌速度的方法，将氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶的前6位氨基酸进行截断突变。

本发明还提供了一种合成支链淀粉的方法，其特征在于，将上述淀粉分支酶突变体，或上述重组细胞添加至含有直链淀粉的反应体系中，反应制备得到支链程度提高的淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述直链淀粉为0.1％(w/v)马铃薯支链淀粉。

在本发明的一种实施方式中，所述淀粉分支酶突变体的添加量为：0.1mg/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述反应条件为：40～60℃反应1～2h。

本发明还提供了一种纯化淀粉分支酶的方法，所述方法为，将上述野生型，或上述突变体通过先过疏水柱，再过离子柱的两步方法进行纯化。

有益效果

(1)本发明通过将来源于热葡萄糖苷地杆菌Geobacillus thermoglucosidansSTB02的淀粉分支酶的前6位氨基酸进行截断突变，显著提高了热葡萄糖苷地杆菌来源淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌及大肠杆菌中的胞外表达水平，本发明的方法安全、高效，其制备得到的含有淀粉分支酶突变体ΔNloop发酵72h的粗酶液活力与原始酶相比，提高了17.29％，且在48h开始可以完全将胞内酶分泌至胞外，显著提高了胞外分泌速度；并且采用本发明的方法获得的重组酶是胞外酶，有利于后期大规模生产的提取纯化，产品符合食品要求。

(2)本发明促进了淀粉分支酶在枯草芽孢杆菌中的胞外分泌表达，且表达水平较高，这在一定程度上创新了淀粉分支酶在食品级枯草芽孢杆菌表达系统中的现有表达水平，可进一步促进淀粉分支酶在食品工业中的生产应用。

(3)本发明通过二步纯化的方法，即先疏水柱纯化，后离子柱纯化的方法，能够有效的得到淀粉分支酶的纯酶蛋白，在不使用镍柱的情况下，更适合应用于食品领域，具有较高的食品领域的应用潜力。

附图说明

图1：野生型和突变体粗胞外胞内蛋白的SDS PAGE电泳分析，其中，条带Marker：蛋白标准分子量；ΔNloop,ΔN-15aa,ΔN-20aa,ΔN-30aa为Gt-GBE的突变体。

图2：野生型和突变体72h发酵的胞外胞内的粗酶活情况，ΔNloop,ΔN-15aa,ΔN-20aa,ΔN-30aa为Gt-GBE的突变体。

图3：野生型和突变体粗酶液的SDS PAGE电泳分析，其中，条带Marker：蛋白标准分子量；Gt-GBE-WT：Gt-GBE的野生型；Gt-GBE-ΔNloop：Gt-GBE的突变体。

图4：野生型和突变体72h发酵全过程的胞外胞内的酶活曲线，其中WT为野生型，ΔNloop为突变体。

具体实施方式

本发明的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。

下述实施例中公开的麦芽糊精溶液购自山东保龄宝生物股份有限公司，下述实施例中所涉及的异淀粉酶购自美国Sigma公司。

下述实施例所涉及的培养基如下：

LB液体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。

LB固体培养基：酵母粉5g/L，胰蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0，1.5％(w/v)琼脂。

TB液体培养基：酵母粉24g/L，胰蛋白胨12g/L，甘油5g/L，KH

下述实施例中所涉及的检测方法如下：

淀粉分支酶酶活的检测：

用10mM磷酸缓冲液(pH 7.5)配制0.25％(w/v)的马铃薯支链淀粉溶液，加入0.5mg/mL淀粉分支酶后混合均匀并置于50℃水浴条件下准确反应15min。反应结束后沸水浴灭酶。取300μL反应混合液加入5.0mL显色液(0.05％(w/v)KI，0.005％(w/v)I

一个酶活力单位定义为：在530nm处，吸光值每分钟降低1％所需加入酶的量为一个酶活力单位。

实施例1：淀粉分支酶突变体的制备

具体步骤如下：

(1)化学合成核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的淀粉分支酶gbe，设计实验所需的互补引物链(见表1)，利用PCR的方式P出淀粉分支酶的基因，并通过同源重组的方法与商业化的载体质粒pP43NMK连接，构建重组质粒pP43NMK-gbe；

(2)以步骤(1)制备得到的重组质粒pP43NMK-gbe为模板，设计实验所需的互补引物链(见表1)，引物由金唯智生物科技有限公司合成，参照TaKaRa公司STAR Primer GXL试剂盒说明书所示方法进行定点突变；制备得到突变体ΔNloop(前6位氨基酸进行截断突变)，ΔN16aa(前16位氨基酸进行截断突变)，ΔN20aa(前20位氨基酸进行截断突变)，ΔN30aa(前30位氨基酸进行截断突变)的基因的重组质粒。

表1：淀粉分支酶突变位点的引入

PCR反应体系依照STAR Primer试剂盒说明书中所设定条件：5×PrimeSTARBuffer(Mg

将反应后得到的PCR产物用DpnI在37℃下保温消化1h，随后将处理好的PCR产物按照E.coli JM109感受态转化方法转入到E.coli JM109中，制备得到转化子，并将转化子涂布到含有50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，将涂布后的LB固体培养基倒置于37℃恒温培养箱中培养10～12h，挑取阳性单克隆接种于含有50μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基并于37℃下培养10～12h，提取质粒，并送公司测序，获得含有原始基因的重组质粒：pP43NMK-gbe；及含有突变基因的重组质粒：pP43NMK-ΔNloop、pP43NMK-ΔN16aa、pP43NMK-ΔN20aa、pP43NMK-ΔN30aa。

实施例2：含有表达淀粉分支酶突变体基因的基因工程菌的构建及突变体的分泌表达及分离纯化

具体步骤如下：

(1)分别将实施例1中得到的重组质粒pP43NMK-gbe和pP43NMK-ΔNloop、pP43NMK-ΔN16aa、pP43NMK-ΔN20aa、pP43NMK-ΔN30aa导入Bacillus subtilis WB600宿主感受态中，分别制备得到B.subtilis WB600/pP43NMK-gbe和B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔNloop、B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔN16aa、B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔN20aa、B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔN30aa重组菌株；

(2)分别将重组菌株在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养10～12h，挑取阳性单菌落接种于含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中。将该三角瓶置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养10～12h，制备得到种子液；

(3)将种子液按2％(v/v)的接种量，接种于含有50mL TB液体培养基的250mL三角瓶中，并置于回转式摇床中以200r/min的速率，在25℃下诱导72h，分别制备得到含有野生型gbe的粗酶液、含有ΔNloop的粗酶液、含有ΔN15aa的粗酶液、含有ΔN20aa的粗酶液、含有ΔN30aa的粗酶液；各培养基在使用前添加终浓度为50μmg/mL的卡那青霉素。

每隔24h分别将上述粗酶液做SDS-PAGE分析，同时破碎胞内细胞做SDS-PAGE分析，结果如图1所示，结果显示，原始酶及突变体酶均得到了表达。

(4)原始酶及突变体酶酶活的检测

用碘比色法测量Gt-GBE的野生型和突变体的72h的胞外蛋白分泌量，并进行SDS-PAGE分析。结果如表2，图1和图2所示：

表2：野生型和突变体GBE在72h的胞外粗酶活力

结果显示，各个突变体和野生型的酶蛋白在发酵72h后都进行了胞外的表达，其中突变体ΔNloop的胞外分泌量相对于野生型提升约17.60％，而突变体ΔN15aa，ΔN20aa，ΔN30aa的胞外分泌量相比于野生型有不同程度的下降，且分别截去20和30个氨基酸后，胞外分泌量下降较多。

(5)淀粉分支酶突变体的纯化：

Gt-GBE的纯化采用先疏水HiTrap Phenyl HP柱(CV 5mL)初步纯化，再用HiTrap QHP柱(CV 5mL)进行二步纯化完成。

1、疏水柱：

平衡液A1液；20mM Tris-HCl+5％硫酸铵，pH 8.0；

洗脱液B1液；超纯水；

用A1液1：1稀释粗酶液，并逐步添加固体硫酸铵至终浓度为5％；

将以上所有溶液用0.45um的微孔滤膜过滤，设置流速为2.5mL/min，用4倍柱体积的A1液平衡层析柱，平衡完后上样，待UV线跑平约4倍柱体积后，换成B1液洗脱，收集洗脱峰得到初步纯化的酶液。

2、强阴离子柱：

平衡液A2液；20mM Tris-HCl，pH 8.0；

洗脱液B2液；20mM Tris-HCl+1M NaCl，pH 8.0；

稀释液C液：40mM Tris-HCl，pH 8.0；

用C液1：1稀释上述洗脱液，并用HCl调节pH至8.0；

将以上所有溶液用0.45um的微孔滤膜过滤，设置流速为2.5mL/min，用4倍柱体积的A2液平衡层析柱，平衡完后上样，待UV线跑平约4倍柱体积后，换成B2液进行梯度(浓度分别为0.15M，0.25M，0.4M NaCl)洗脱，收集洗脱峰得到二步纯化的酶液。将洗脱液分别用超滤浓缩管进行超滤浓缩，并在-80℃保存。

制备得到含有野生型gbe的纯酶、含有ΔNloop的纯酶、含有ΔN15aa的纯酶、含有ΔN20aa的纯酶、含有ΔN30aa的纯酶。

3.分别检测野生型gbe的纯酶、ΔNloop的纯酶、ΔN15aa的纯酶、ΔN20aa的纯酶、ΔN30aa的纯酶的比酶活，结果如表3所示：

表3：野生型和突变体GBE的比酶活(胞外)

结果显示，N末端突变对Gt-GBE的比酶活影响较小。结合表2粗酶活的相关数据，证明ΔNloop突变体能有效提升Gt-GBE的胞外分泌量。

实施例3：淀粉分支酶突变体对基因工程菌分泌蛋白速度的影响

具体步骤如下：

(1)按照实施例2的方法，制备得到B.subtilis WB600/pP43NMK-gbe和B.subtilisWB600/pP43NMK-ΔNloop重组菌株。

(2)分别将重组菌株在LB固体培养基上进行划线分离，置于37℃恒温培养箱中培养10～12h，挑取阳性单菌落接种于含有50mL LB液体培养基的250mL三角瓶中。将该三角瓶置于200r/min的回转式摇床中，在37℃下培养10～12h，制备得到种子液；

(3)将种子液按2％(v/v)的接种量，接种于含有50mL TB液体培养基的250mL三角瓶中，并置于回转式摇床中以200r/min的速率，在25℃下诱导72h；

分别检测B.subtilis WB600/pP43NMK-gbe和B.subtilis WB600/pP43NMK-ΔNloop重组菌株胞外胞内的酶活，结果如图4和表4所示，SDS-PAGE效果如图3所示：

表4：原始酶及突变体酶在不同发酵时间的胞外胞内酶活数据

结果显示，突变体ΔNloop在48h几乎可以将胞内蛋白完全分泌至胞外，而此时野生型WT还有部分胞内蛋白未分泌至胞外，因此突变体ΔNloop的蛋白分泌速度相比于野生型WT，有极大的提升。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。