一种基于磁珠快速提取口腔拭子DNA的试剂盒及应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用磁珠法快速提取口腔拭子DNA的试剂盒及应用。

背景技术

DNA(Deoxyribonucleicacid)，又称脱氧核糖核酸，是绝大多数生物的遗传物质，决定了生物的基本特征，是分子生物学最重要的研究内容之一。快速提取高质量DNA对于开展分子生物学研究和分子诊断工作有重要意义。

目前提取DNA的方法主要有酚/氯仿法、磁珠法、过柱法等。酚/氯仿法的试剂对人体和环境均有毒害作用，同时操作较为复杂，无法配备高通量自动化提取设备；过柱法由于亲和柱的亲和力问题，只能吸附大的DNA片段。磁珠法无需氯仿等有害试剂，同时可高效吸附DNA片段，适配高通量自动化提取设备，成为核酸提取的热点研究技术。近年来公布了很多磁珠法DNA提取方法的专利，但大部分试剂盒提取时间较长，例如申请号CN202110722206.5、CN202011536024.0、CN202110249828.0等专利，提取时间均在30-60min。

发明内容

本发明的一个目的是为了提供一种基于磁珠的快速提取口腔拭子DNA的试剂盒，所述试剂盒无需有害试剂，省时省力，节约成本，且提取的基因组DNA纯度高。

本发明提供的基于磁珠的快速提取口腔拭子DNA的试剂盒包括裂解结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠，所述裂解结合液由SDS、CTAB、盐酸胍、异硫氰酸胍、Tris-HCl、NaCl、EDTA、柠檬酸、柠檬酸三钠、PVP30和异丙醇中的至少5种成分组成，所述洗涤液为乙醇水溶液，所述洗脱液为Tris-HCl和EDTA，磁珠为羟基磁珠或羧基磁珠。

优选的，所述裂解结合液由Tris-HCl缓冲液、NaCl、EDTA、柠檬酸、柠檬酸三钠、PVP30、异丙醇和物质a组成，所述物质a为CTAB或SDS或盐酸胍或异硫氰酸胍中的至少一种；

优选的，所述裂解结合液中，物质a的质量百分含量为1％-5％或摩尔浓度为1M-4M；

优选的，所述裂解结合液中，Tris-HCl浓度为50-200mM，NaCl浓度为50-500mM，EDTA浓度为20-100mM，柠檬酸浓度为0.1-0.5M，柠檬酸三钠浓度为0.2-1M；

优选的，所述裂解结合液中，PVP30的体积百分含量为1-3％，异丙醇的体积百分含量为40％-60％；

优选的，所述洗涤液中乙醇体积分数为50％-80％；

优选的，所述洗脱液为中Tris-HCl浓度为10-30mM，EDTA浓度为0.1-0.5mM；

优选的，所述磁珠为羟基磁珠或羧基磁珠，粒径为100-1000nm。

优选的，所述物质a为CTAB，所述裂解结合液中，CTAB的质量百分含量为2％；Tris-HCl浓度为50mM；NaCl浓度为500mM；EDTA浓度为40mM；柠檬酸浓度为0.5M；柠檬酸三钠浓度为0.2M；PVP30体积百分含量为1％；异丙醇体积百分含量为50％；

优选的，所述洗涤液中乙醇体积百分含量为75％。

优选的，所述洗脱液中Tris-HCl浓度为20mM，EDTA浓度为0.4mM。

优选的，所述磁珠为羟基磁珠或羧基磁珠，粒径为800nm。

本发明的第二个目的是提供一个基于上述磁珠法试剂盒提取口腔拭子DNA的应用，所述应用的具体步骤如下：

1)取待测口腔拭子保存液，加入裂解结合液、磁珠，充分混匀，室温静置；将离心管放置于磁力架上静置，磁珠完全吸附后，去掉上清液；

2)向步骤1)得到的离心管加入洗涤液，振荡混匀；然后置于磁力架上静置30s，磁珠完全吸附后，去掉上清液；

3)将离心管从磁力架上取下，加入洗脱液，振荡混匀，加热孵育；将离心管放置于磁力架上静置，磁珠完全吸附后，取上清DNA溶液低温保存。

优选的，所述步骤1)中的静置室温静置时间为5min；磁力架上静置时间为30s。

优选的，所述步骤2)中的振荡时间为10s；磁力架上静置时间为30s。

优选的，所述步骤3)中加热温度为56℃，加热时间为2min，磁力架上静置时间为30s。

本发明的有益效果在于：

1.本试剂盒操作步骤少，简单快速，无需对样本进行预处理，10分钟内即可快速完成提取操作，极大缩短了DNA提取时间；

2.本试剂盒可用于提取多个物种的口腔拭子样本基因组DNA，兼容性强；

3.本试剂盒不使用氯仿、苯酚等有机溶剂，可大幅降低对实验人员的身体伤害；

4.本试剂盒的提取方法可有效减少提取过程中核酸的损失，大大增加提取效率；

5.本试剂盒适配磁珠提取工作站，可自动化提取，减少人力成本。

附图说明

图1为本发明不同试剂配方提取的口腔拭子DNA的电泳条带，其中，M是Marker。

图2为本发明不同方法提取的口腔拭子DNA的电泳条带，其中，M是Marker。

图3为本发明提取的不同物种口腔拭子DNA的琼电泳条带，其中，M是Marker。

图4为本发明提取试剂盒(6)提取的人源口腔拭子DNA实时荧光定量PCR结果图，其中，横坐标是循环数，纵坐标是荧光强度。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的盐酸胍、硫氰酸胍、Tris-HCl、EDTA购买于生工生物工程(上海)股份有限公司；CTAB、NaCl、柠檬酸、柠檬酸三钠、PVP购买于西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司。乙醇、异丙醇购买于北京北化精细化学品有限责任公司。磁珠为羟基磁珠，购买于生工生物工程(上海)股份有限公司。口腔拭子保存液，购自江苏宝芝林医疗科技有限公司，产品备案号：苏扬械备20200380号。

实施例1：磁珠法快速提取口腔拭子DNA试剂盒制作

利用磁珠技术快速提取口腔拭子DNA的试剂盒，所述试剂盒的成分由裂解结合液、洗涤液、洗脱液和磁珠组成。裂解结合液主要成分的CTAB质量百分含量为0.5-4％，SDS质量百分含量为0.5-4％，盐酸胍摩尔浓度量为1M-4M，异硫氰酸胍摩尔浓度量为1M-4M。

1.提取试剂盒(1)中的各个成分的配方如下所示：

1)裂解结合液a：CTAB浓度(质量百分含量)为0.5％；Tris-HCl浓度为50mM；NaCl浓度为500mM；EDTA浓度为40mM；柠檬酸浓度为0.5M；柠檬酸三钠浓度为0.2M；PVP30体积比为1％；异丙醇体积比为50％；溶液最终pH值为8.0。2L裂解结合液配制过程如下：①取磁转子和800mL无菌水放入1L玻璃烧杯，将烧杯放在磁力搅拌器上，磁力搅拌器温度调至70℃，打开2-3档磁力搅拌；②使用天平称取5g的CTAB，29.22gNaCl，13.45gEDTA，192.13g柠檬酸，103.228g柠檬酸三钠依次加入烧杯中；③使用量筒分别取50mL浓度为1M的Tris-HCl和20mLPVP，加入烧杯中；④磁力搅拌1-2h，试剂完全溶解后，使用无菌水定容至1L，再加入异丙醇定容至2L，然后分装保存。

2)洗涤液：乙醇浓度为75％。1L洗涤液配制过程如下：①使用量筒取0.75L乙醇溶液，然后使用无菌水定容至1L，充分混匀后，分装保存。

3)洗脱液：Tris-HCl浓度为20mM，EDTA浓度为0.4mM，溶液最终pH值为8.0。1L洗脱液配制过程如下：①取磁转子和800mL无菌水放入1L玻璃烧杯，将烧杯放在磁力搅拌器上，磁力搅拌器温度调至70℃，打开2-3档磁力搅拌；②使用天平称取0.1345gEDTA，加入烧杯中；③使用量筒取20mL浓度为1M的Tris-HCl，加入烧杯中；④磁力搅拌1h，试剂完全溶解后，使用无菌水定容至1L，然后分装保存。

4)磁珠为羟基磁珠，粒径为800nm。

上述裂解结合液、洗涤液和洗脱液都是独立包装的，可以在使用时分别使用。

2.提取试剂盒(2)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试a的CTAB含量(质量百分含量)由0.5％改为2％，其他成分不变，得到裂解结合液测试b。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试b，其他成分不变，得到提取试剂盒(2)。

3.提取试剂盒(3)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试a的CTAB含量(质量百分含量)由0.5％改为4％，其他成分不变，得到裂解结合液测试c。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试c，其他成分不变，得到提取试剂盒(3)。

4.提取试剂盒(4)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试a的CTAB更换为SDS，含量(质量百分含量)为0.5％，其他成分不变，得到裂解结合液测试d。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试d，其他成分不变，得到提取试剂盒(4)。

5.提取试剂盒(5)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试d的SDS含量(质量百分含量)由0.5％改为2％，其他成分不变，得到裂解结合液测试e。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试d，其他成分不变，得到提取试剂盒(5)。

6.提取试剂盒(6)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试d的SDS含量(质量百分含量)由0.5％改为4％，其他成分不变，得到裂解结合液测试f。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试d，其他成分不变，得到提取试剂盒(6)。

7.提取试剂盒(7)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试a的CTAB更换为盐酸胍，摩尔浓度为1M，其他成分不变，得到裂解结合液测试g。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试g，其他成分不变，得到提取试剂盒(7)。

8.提取试剂盒(8)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试a的盐酸胍的摩尔浓度由1M改为2M，其他成分不变，得到裂解结合液测试h。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试h，其他成分不变，得到提取试剂盒(8)。

9.提取试剂盒(9)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试a的盐酸胍的摩尔浓度由1M改为4M，其他成分不变，得到裂解结合液测试i。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试i，其他成分不变，得到提取试剂盒(9)。

10.提取试剂盒(10)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试a的CTAB更换为硫氰酸胍，摩尔浓度为1M，其他成分不变，得到裂解结合液测试j。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试j，其他成分不变，得到提取试剂盒(10)。

11.提取试剂盒(11)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试a的硫氰酸胍摩尔浓度由1M改为2M，其他成分不变，得到裂解结合液测试k。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试k，其他成分不变，得到提取试剂盒(11)。

12.提取试剂盒(12)中的各个成分的配方如下所示：

将裂解结合液测试a的硫氰酸胍摩尔浓度由1M改为4M，其他成分不变，得到裂解结合液测试l。

所述将提取试剂盒(1)中的含裂解结合液测试a替换为裂解结合液测试l，其他成分不变，得到提取试剂盒(12)。

实施例2：磁珠法快速提取口腔拭子DNA试剂盒的测试

使用实施例1中配制的试剂分别组成12套试剂盒，分别为提取试剂盒(1)(包含裂解结合液测试a、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(2)(包含裂解结合液测试b、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(3)(包含裂解结合液测试c、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(4)(包含裂解结合液测试d、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(5)(包含裂解结合液测试e、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(6)(包含裂解结合液测试f、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(7)(包含裂解结合液测试g、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(8)(包含裂解结合液测试h、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(9)(包含裂解结合液测试i、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(10)(包含裂解结合液测试j、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(11)(包含裂解结合液测试k、洗涤液、洗脱液和磁珠)；提取试剂盒(12)(包含裂解结合液测试l、洗涤液、洗脱液和磁珠)。使用上述试剂盒提取3份人源口腔拭子样本，同时以商业化磁珠提取试剂盒(索莱宝D1500和天根生化DP342)作为对照，测试比较不同试剂配方的核酸提取效果。各试剂盒均采用下述实验流程：

①准备干净的2.0mL离心管，按顺序加入200μL口腔拭子保存液，650μL裂解结合液，10μL磁珠，充分混匀后，室温静置10min；

②将上述离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，去掉上清液；

③向上述离心管加入300μL洗涤液，振荡混匀3min；

④将上述离心管置于磁力架1min，磁珠完全吸附后，去掉上清液；

⑤向上述离心管加入100μL洗脱液，充分振荡混匀，置于56℃，孵育10min，期间颠倒混匀1次；

⑥将上述离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，取上清DNA溶液低温保存，待质检和基因型检测。

对上述实验提取的口腔拭子DNA进行紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳实验，质检提取的DNA质量。紫外分光光度计检测采用Nanodrop2000设备，结果见表1。琼脂糖凝胶浓度为1％，样本的上样量为5.0μL，M为20KbDNAMarker，电压120V，电泳时间30min，结果见图1。综合分析紫外分光光度计检测和琼脂糖凝胶电泳质检结果，12个试剂盒均可提取出口腔拭子DNA，但试剂盒(1)至(6)的DNA产物浓度较高，条带更清晰，试剂盒(7)至(12)的DNA产物浓度较低，条带亮度较低。说明CTAB和SDS更适合用于提取口腔拭子DNA，盐酸胍和硫氰酸胍提取口腔拭子的效果较差。其中，提取试剂盒(6)的DNA浓度最高，条带最亮，平均浓度为60ng/μL，显著高于其他试剂配方，且A260/A230＝1.83，A260/A280＝1.90。表明该试剂配方提取的DNA浓度高、纯度高，推荐作为口腔拭子DNA提取的试剂组合。

表1.不同试剂盒提取口腔拭子DNA的紫外分光光度计质检结果

实施例3：磁珠法快速提取口腔拭子DNA方法的测试

经实施例2测试分析，选择提取试剂盒(6)(包含裂解结合液测试f、洗涤液、洗脱液和磁珠)进行口腔拭子DNA提取方法测试。测试样本为实施例2所述3份人源口腔拭子样本，每份样本提取6个重复，DNA质检方法参照实施例2，测试的提取方法如下：

提取方法(1)：

①准备干净的2.0mL离心管，按顺序加入200μL口腔拭子保存液，650μL裂解结合液，10μL磁珠，充分混匀后，室温静置10min；

②将上述离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，去掉上清液；

③向上述离心管加入300μL洗涤液，振荡混匀3min；

④将上述离心管置于磁力架1min，磁珠完全吸附后，去掉上清液；

⑤向上述离心管加入100μL洗脱液，充分振荡混匀，置于56℃，孵育10min，期间颠倒混匀1次；

⑥将上述离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，取上清DNA溶液低温保存，待后续检测实验使用。

提取方法(2)：

①准备干净的2.0mL离心管，按顺序加入200μL口腔拭子保存液，650μL裂解结合液，10μL磁珠，充分混匀后，室温静置7min；

②将上述离心管放置于磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后，去掉上清液；

③向上述离心管加入300μL洗涤液，振荡混匀1min；

④将上述离心管置于磁力架1min，磁珠完全吸附后，去掉上清液；

⑤向上述离心管加入100μL洗脱液，充分振荡混匀，置于56℃，孵育5min，期间颠倒混匀1次；

⑥将上述离心管放置于磁力架上静置1min，待磁珠完全吸附后，取上清DNA溶液低温保存，待后续检测实验使用。

提取方法(3)：

①准备干净的2.0mL离心管，按顺序加入200μL口腔拭子保存液，650μL裂解结合液，10μL磁珠，充分混匀后，室温静置5min；

②将上述离心管放置于磁力架上静置30s，磁珠完全吸附后，去掉上清液；

③向上述离心管加入300μL洗涤液，振荡混匀30s；

④将上述离心管置于磁力架30s，磁珠完全吸附后，去掉上清液；

⑤向上述离心管加入100μL洗脱液，充分振荡混匀，置于56℃，孵育2min，期间颠倒混匀1次；

⑥将上述离心管放置于磁力架上静置30s，待磁珠完全吸附后，取上清DNA溶液低温保存，待后续检测实验使用。

通过上述3种提取方法对口腔拭子样本进行DNA提取，采用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计法进行DNA质检并分析，3种提取方法均可提出口腔拭子样本的DNA，条带清晰，无明显降解，A260/280和A260/230比值在1.7-2.0之间，纯度较高；提取方法(1)的DNA浓度显著高于提取方法(2)和(3)，条带亮度也最高，耗时25min，表明提取方法(1)提取的DNA浓度最高，但耗时最长；提取方法(2)和(3)提取的DNA浓度相对较低，但仍符合PCR检测实验质量要求，耗时10-15min。因此，上述方法均可以用于口腔拭子DNA提取，提取方法(3)可极大缩短提取时间，提高效率。

表2.不同方法提取口腔拭子DNA的紫外分光光度计质检结果

实施例4：磁珠法快速提取口腔拭子DNA试剂盒的应用

经实施例2和实施例3测试分析，选择提取试剂盒(6)(包含裂解结合液测试a、洗涤液、洗脱液和磁珠)和提取方法(3)进行各类口腔拭子DNA提取测试。收集到人源口腔拭子12份，猪源口腔拭子12份，羊源口腔拭子4份，犬源口腔拭子8份，猫源口腔拭子6份，实验流程和DNA质检流程参照实施例2。同时对上述提取试剂盒(6)提取的口腔拭子DNA进行稀释，稀释至10ng/μL，取1.5μL加入qPCR反应体系中扩增，人源样本选用内参基因ACTB，序列信息如下：

ACTB_F_primer：5’-ATCGTGCGTGACATTAAGGACAAG-3’

ACTB_R_primer：5’-AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3’

ACTB_probe：5’-5FAM-TGCCAATGGTGATGACCTGGCCGTCAG-BHQ1-3’

对提取DNA进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计质检(见表3和图3)，提取人源口腔拭子样本DNA平均浓度最高，条带最亮，为64.852ng/μL；猪源口腔拭子样本DNA平均浓度为46.917ng/μL，羊源口腔拭子样本DNA平均浓度为38.874ng/μL，犬源口腔拭子样本DNA平均浓度为44.673ng/μL，猫源口腔拭子样本DNA平均浓度为41.061ng/μL，均有清晰的电泳条带，无明显拖尾。同时对人源样本DNA进行qPCR测试，PCR结果如图3所示，产物扩增曲线清晰，不同样本间结果稳定。结果表明，上述方法提取的DNA浓度和纯度较高，符合qPCR检测要求，对不同物种样本兼容性强，同时极大地提高了提取的效率。

表3.提取不同物种口腔拭子DNA的紫外分光光度计质检结果

通过上述实施例可以看出，本发明的试剂盒及测试方法，可在5-10min完成核酸提取工作，安全高效，核酸纯度高，极大地提高核酸提取工作效率。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。